抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化

棉枯萎
麦根腐
赤霉
梨黑星
159201 159202 159203 159204 159205 159206
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
100
81
85
53
0
10
85
82
37
61
39
19
100
75
85
57
10
7
65
78
58
64
44
19
100
81
85
75
0
5
100
摘 要 从陕西渭北旱原的土壤中分离到 1 株对水稻稻瘟 、小麦赤霉 、棉花枯萎 、小麦根腐 、小麦全蚀 、梨黑星 等多种植物病原真菌拮抗性好的放线菌 。对其进一步纯化后 ,进行发酵条件的优化 ,认为选用 12 号培养基 , p H 8. 0 ,培养 72 h ,30～34 ℃,150 r/ min 条件为最佳 。 关键词 放线菌 ;筛选 ;发酵 ;优化 中图分类号 Q939. 9 文献标识码 A 文章编号 1005 - 7021 (2004) 04 - 0012 - 03
pH
5. 0
6. 0
7. 0
8. 0
9. 0
抑菌率/ %
31
65
81
87
68
表 6 温度对发酵液抑菌作用的影响
温度/ ℃ 26 28 30 32 34 36 38 抑菌率/ % 70 81 91 90 89 84 64
表 7 摇床转速对发酵液抑菌作用的影响
转速/ (r/ min)
100
150
2 结果与分析
2. 1 高拮抗菌株的筛选 本研究共对 240 株放线菌的发酵液进行初筛 和复筛后 ,得到 5 株较好的菌株 ,再对这 5 株的抑 菌 率进行比较 ,结果见表2 。其中以1 5 9 号抑菌
收稿日期 :2003 - 06 - 10 作者简介 :刘翠娟 女 ,硕士研究生 。主要从事微生物学及土壤拮抗微生物的研究 。
释液 0. 05 mL ,加入已做好的高氏 1 号培养基平 板上 ,用灭菌的玻璃刮刀将稀释液均匀涂布开 。 放入 28 ℃恒温箱中培养 。设 3 个重复 。 ③挑菌 : 根据形态将放线菌挑入高氏 1 号斜面上培养 7 d 后保存 。 1. 2. 3 拮抗放线菌的筛选 放线菌发酵液拮抗 性测定 :将放线菌接入发酵培养基 ,恒温水浴摇床 培养 ,30 ℃,培养 3 d 后 ,60 ℃水浴 15 min ,用草 酸调 p H 到 3. 5 。静置 1 h 后过滤 ,收集滤液 。取 3 mL 发酵滤液注入培养皿中 ,将熔化的 PDA 培 养基与发酵液 (约 7∶1) 混合均匀 ,冷却后接病原 菌的菌饼 。加蒸馏水和草酸作对照 。用生长速率 法计算抑制率 。由抑制率判断放线菌对病原菌拮 抗作用的强弱 。 1. 2. 4 单胞分离 将放线菌的孢子制成孢子悬 浮液 ,孢子悬浮液稀释后用平板涂抹法制成单胞 菌落 。培养 7 d 后挑入高氏 1 号斜面上保存 。并 用生长素率法继续筛选单胞菌 。 1. 2. 5 发酵培养基的选择 本研究采用 16 种不 同的发酵培养基 (表 1) ,30 ℃培养 3 d ,以稻瘟菌 作为供试的病原菌 ,生长速率法计算抑制率来表 示不同培养基中的抗生素的累积量 。 1. 2. 6 测定发酵时间 、培养基 p H、温度及摇床转 速对发酵滤液抑菌作用的影响
4 期 刘翠娟等 :抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化
13
效果最好 ,因为它不仅对菌丝的生长有抑制作用 , 能同时具备这 3 个特点 。因此选择 159 号菌作
而且还有溶菌作用 ,持效期最长 。而其它菌株不 为筛选到的高拮抗菌株 。
表 1 16 种液体培养基成分
14
微 生 物 学 杂 志 24 卷
表 4 培养时间对发酵液抑菌作用的影响
时间/ h 抑菌率/ %
24 36 48 60 72 84 96 120 30 43 73 84 90 90 87 89
表 5 p H 对发酵液抑菌作用的影响
12
微生物学杂志 2004 年 7 月 第 24 卷 第 4 期 J OURNAL OF MICROBIOLO GY J uly 2004 Vol. 24 No . 4
·研究报告·
抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化
刘翠娟1 ,段琦梅2 ,安德荣1
(1. 西北农林科技大学 植保学院 ,陕西 杨凌 712100 ;2. 西北农林科技大学 生命科学院 ,陕西 杨凌 712100)
过程中出现拮抗性不稳定现象 。所以必须再次分 离得到单胞菌落后继续测定拮抗性 ,选择其最佳 。 这样才能保证放线菌多次转管后拮抗性遗传的稳 定性 。 3. 2 放线菌的发酵是一个复杂的过程 ,受很多环 境条件的影响 。除了培养基的碳氮比 、微量元素 影响之外 ,还受培养时间 、p H、温度 、通气量等因 素的影响 。在放线菌发酵的前期 ,是菌体的生长 阶段 ,营养物质被消耗 ,抗生素开始产生 ,碳源产 生有机酸 ,p H 下降 ,抗生素的量增长迅速 ,发酵中 期 ,抗生素产生迅速 。到后期 ,抗生素增长缓慢 , 72 h 后就没有增长 ,分析原因可能是由于菌体衰 老 ,细胞开始自溶 ,发酵液中终产物的积累或其它 有害代谢物使产生菌处于一种对其进一步合成产 物不利的环境中 。或者是由于抗生素合成所需的 前体和其它因子的不足造成的 。 3. 3 此试验对 159 号拮抗单胞菌进行了发酵条 件的优化 ,得到了最佳的发酵条件 ,可为进一步发 酵罐培养提供依据 ,发酵液在田间的实际防效以 及对生物持续作用的效果还需进一步测定 。
培养基 。因此选定其为最佳的培养基配方 。 2. 4 培养时间 、p H、温度 、摇床转速对发酵液抑 菌率的影响 本试验分别测试了培养 24 , 36 , 48 , 60 , 72 , 84 ,96 ,120 h 发酵液的抑菌率 ,发现从 24 h 开始 抑菌率在不断提高 ,到接近 72 h 达到最高 90 % , 之后随着培养时间的增长抑菌率不再增加 。因此 确定 72 h 为最佳培养时间 。在测试的 p H 5. 0 , 6. 0 ,7. 0 ,8. 0 ,9. 0 这 5 个值中 ,抑菌率的最高值 在 p H 为 8. 0 时 。因此选定 p H 8. 0 为最佳 。从 表 6 中可以看出温度的变化对抗生素的产生影 响不大 ,30～34 ℃是最佳范围 。
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
培养基成分
葡萄糖 5g ,淀粉 40g ,鱼粉 5g ,黄豆饼粉 25g 。磷酸氢二钾 0. 05g ,硫酸铵 5g ,水 1000mL 淀粉 14g ,乳糖 16g ,黄豆粉 10g ,磷酸氢二钾 3g ,碳酸钙 4g ,氯化钾 0. 4g ,水 1000mL 葡萄糖 4g ,鱼粉 6g ,黄豆粉 16g ,硫酸铵 2g ,碳酸钙 4g ,水 1000mL 玉米粉 35g ,黄豆粉 20g ,硝酸钾 5g ,碳酸钙 4g ,水 1000mL 麦麸 40g ,花生粉饼 25g ,酵母粉 5g ,磷酸氢二钾 0. 2g ,水 1000mL 蛋白胨 10g ,蔗糖 30g ,磷酸氢二钾 0. 5g ,硫酸亚铁 0. 01g ,水 1000mL 葡萄糖 2g ,酵母膏 2g ,牛肉膏 3g ,蛋白胨 2g ,甘油 20g ,黄豆饼粉 20g ,硫酸镁 0. 5g ,磷酸氢二钾 1g ,水 1000mL 玉米粉 40g ,麸皮 10g ,麸质粉 5g ,硫酸铵 1g ,磷酸氢二钾 1g ,碳酸钙 4g ,葡萄糖 10g ,水 1000mL 淀粉 40g ,酒石酸氨 8. 5g ,氯化钠 3g ,磷酸氢二钾 3g ,硫酸镁 1g ,硫酸锌 1g ,豆油 4mL ,水 1000mL 糊精 15g ,黄豆粉 30g ,硫酸镁 0. 5g ,碳酸钙 10g ,水 1000mL 乳糖 15g ,玉米浆 4g ,磷酸氢二钾 0. 8g ,氯化钾 0. 2g ,碳酸钙 1. 6g ,水 1000mL 蔗糖 45g ,黄豆粉 25g ,氯化纳 1g ,磷酸氢二钾 0. 2g ,硝酸钾 0. 2g ,硫酸钠 0. 1g ,硫酸铁 0. 05g ,碳酸钙 3g ,水 1000mL 黄豆粉 50g ,玉米油 40g ,食盐 3g ,水 1000mL 黄豆饼粉 10g ,淀粉 10g ,玉米粉 15g ,鱼粉 5g ,蛋白胨 2g ,葡萄糖 5g ,硝酸钾 0. 5g ,碳酸钙 4g ,水 1000mL 淀粉 10g ,花生粉 15g ,黄豆粉 25g ,酵母粉 2g ,碳酸钙 7g ,水 1000mL 蛋白胨 30g ,葡萄糖 25g ,碳酸钙 5g ,玉米浸汁 10mL ,水 1000mL
表 2 发酵液对病原菌的抑制率/ %
2. 2 单胞菌的拮抗性测定
菌号 104 129 136 159 171
稻瘟 40 77 94 61 98
全蚀 0 50 50 67 90
棉枯萎 麦根腐
67
51
39
61
4
44
76
64
48
96Fra Baidu bibliotek
赤霉 36 47 82 51 63
梨黑星 32 43 51 34 41
200
250
抑菌率/ %
85
91
87
90
表 7 表明摇床转速对发酵液抑菌作用有影 响 ,在测试 100 ,150 ,200 ,250 r/ min 的 4 个值中 , 150 r/ min 的抑菌率最高 ,达 91 %。
3 讨 论
3. 1 在放线菌的分离中 ,虽然已得到纯的菌落 , 但不一定是单胞菌落 ,这就会造成在以后的转接
159 号菌株分离到 6 个单胞菌 ,分别对它们 的拮抗性进行测定 。结果 (表 3) 159206 号单胞菌 在 24 h 和 48 h 的抑菌率都是最高的 ,因此选定 159206 号单胞菌株作为发酵优化的对象 。
表 3 24h ,48h 单胞菌发酵液皿内测定抑制率/ %
菌号
稻瘟
全蚀
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 土样 本试验采用的分离用土样采自陕 西渭北旱原 。 1. 1. 2 供试病原菌 小麦全蚀病菌 ( Geau m an2 nom yces gram i nis) 、稻瘟 ( Py ricul aria oryz ae) 、麦 类 赤 霉 菌 ( Fusari u m gram i nearu m ) 、棉 花 枯 萎 ( Fusari u m ox ysporu m ) 、梨 黑 星 ( Fusicl adi u m Pi ri n u m ( lib. ) Fuckel ) 、小 麦 根 腐 ( B i pol aris soroki niana) 。 1. 1. 3 培养基 分离筛选用培养基 :高氏 1 号 ; 拮抗试验用培养基 : PDA ;发酵试验用培养基 : 通 用大豆玉米浸汁液体培养基 。 1. 2 方法 1. 2. 1 采集土样 选好采集地点后 ,铲去表层 土 ,用取样器取规定深度的土样 ,装入无菌牛皮纸 袋中 ,带回实验室阴干后立即分离 。 1. 2. 2 放线菌的分离 ①称取 1 g 研磨好的土 壤 ,制备稀释成 102 ,103 ,104 ,105 倍的土壤悬浮液 备用 。 ②采用涂抹法分别取上述 4 个浓度土壤稀
植物病原真菌引起的植物病害是植物的第一 大病害 ,每年给粮食生产造成巨大的损失 。目前 对植物病害的防治普遍采用化学农药 ,而化学农 药对非靶标生物的毒害 、对环境的污染 、使害物产 生抗药性的问题至今仍难以解决 ,生物防治的方 法被认为是一条有效的途径 。本研究针对几种主 要的植物病害从土壤中筛选拮抗放线菌 ,并对其 发酵条件进行优化 ,以此可作为工业液体发酵的 参考 。
95
16
67
78
51
68
65
50
24
16
2
80
70
72
65
8
9
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59
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27
2. 3 发酵培养基的筛选结果 (图 1)
图 1 159206 不同培养基发酵液 对赤霉的抑制效果
从图 1 中可看出 ,1 号 、6 号 、12 号 、14 号培 养基的发酵液抑制率较高 ,其中最高的是 12 号