植物病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定

Kauffmann等[10]方法，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中 平板法测定它们对2种植物病原细菌的拮抗作用，其中3株
检测其纯度。以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物 菌具有抑菌活性，结果(见图1)显示：W04、W01、W2R对水
27F(5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3')和1527R(5'- 稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌都有不同程度的抑
cinerea 、菜豆炭疽病菌Colletotrichum sp.、黄瓜立枯病 菌Fusarium solani 、烟草赤星病菌Alternaria alternata 、绿 色木霉Trichoderma viride 、番茄叶霉病菌Fulvia falva 、 水 稻 纹 枯 病 菌R h i z o c t o n i a s o l a n i 、水 稻 白 叶 枯 病 菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 、水稻细菌性条斑病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzicola 、镰刀霉菌Fusaria 、无 名假丝酵母Candida famata ，以上均为浙江工业大学微生 物实验室保存菌种。
1.2.2 放线菌菌体对植物病菌的拮抗作用
(bootstrap)为1 000次重复。
采用平板对峙法 测Βιβλιοθήκη [5] 定放线菌对植物病原真菌的抑
3)培养特征及生理生化特性
菌 效 果 ：将 培 养 好 的 植 物 病 原 真 菌 用 打 孔 器 打 取 直 径
在部分培养特征培养平板上划线接种菌株W04，
为5 mm的菌块，然后将其倒置放在PDA平板中央，距中 28 ℃培养7~15 d后观察记录菌落特征[11]，并进行碳源、纤
放线菌是具有巨大使用价值的一类微生物，迄今已知 米小斑病菌Bipolaria maydis 、番茄灰霉病菌Botrytis
的抗生素中近2/3由放线菌产生[1-2]，其中在商业和医药中 使用的抗生素有75%由链霉菌产生[3]。在农用抗生素中已 获得农药登记的仅十余种，且主要用于防治水稻及大田农 作物的病害，而用于防治果蔬类重要真菌病害的则很少[4]。 在大力发展无公害果蔬生产的形势下，十分有必要开发防 治其真菌病害的农用抗生素。本文针对实验室筛选出的 放线菌，研究其对重要果蔬致病菌的拮抗活性，并鉴定其 分类地位，旨在发现新的抗生素或原有抗生素新的防治特
Isolation, Screening and Identification of Antagonistic Actinomycetes Inhibiting Plant Pathogens
WU Yan-hui, ZHAO Chun-tian, QIU Juan-ping
(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)
收稿日期：2009-10-27，修返日期：2009-12-08
基金项目：浙江省重大项目(农业生物技术专项)(2008C02007-2)
作者简介：吴艳辉(1985—)，女，山东济宁人，硕士研究生，主要从事应用微生物学方面的研究。E-mail：wuyanhui1314@。
通讯作者：裘娟萍，教授，硕士生导师。Tel：0571-88320057，E-mail：qiujping@。
第2期
吴艳辉，等：植物病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定
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用于无名假丝酵母培养。
扩增。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，
1.2 方法
1.2.1 土壤放线菌的分离与筛选 将土壤稀释液涂布到高氏1号平板上，30 ℃培养4 d，用
直径为5 mm的打孔器打孔，将琼脂块倒置于已涂布0.2 mL 终浓度为106个/mL无名假丝酵母的培养平板上，筛选对其 生长有抑制作用的菌株，测量抑菌圈大小并观察抑菌圈的 透明度和边缘整齐度。
AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3')进行16S rDNA的PCR 制效果，W04的抑制作用最强烈。
1.2.4 菌株鉴定
2 结果与分析
2.1 土壤放线菌的分离与拮抗菌株的筛选 从采集到的11份土样中采用稀释平板法[5，13]共分离到
放线菌99株，用琼脂块法筛选到9株放线菌对无名假丝酵 母有显著抑制作用，采用十字交叉法测定其抑菌圈大小。 结果(见表1)表明：菌株W2R、W01、W04和W25G对靶标假 丝 酵 母 菌 的 抑 制 效 果 最 为 明 显 ，抑 菌 圈 大 而 清 晰 ，其 他 几株抑菌效果则相对较弱。
第49卷第2期 2010年2月
应用技术
农药
Vol. 49, No. 2 Feb. 2010
植物病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定
吴艳辉，赵春田，裘娟萍
(浙江工业大学 生物与环境工程学院，杭州 310014)
摘要：从杭州地区采集的11份土样中共分离到99株放线菌，筛选出9株对产核黄素的无名假丝酵母Candida famata 有拮抗作用。采用平板对峙法复筛到1株对供试的多种植物病原菌抑制效果较强的菌株W04，该菌株对西瓜枯萎 病原菌的抑菌率达到79.1%；生长速率法测得其发酵滤液对西瓜枯萎病原菌的抑制率为82.6%。根据形态特征、生 理生化特性及16S rDNA序列分析，鉴定该菌株为淡紫灰链霉菌Streptomyces lavendulae Waksman & Curtis。 关键词：放线菌；植物病原菌；抑菌活性；分类鉴定 中图分类号：S482.2 文献标志码：A 文章编号：1006-0413(2010)02-0146-04
性，为丰富防治果蔬类病菌生物农药种类提供实践经验和 1.1.3 供试培养基
理论依据，为农用抗生素的研究与应用奠定基础。
PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基用于抑菌试验；高
1 材料与方法 1.1 材料
氏1号培养基用于放线菌分离培养；种子培养基(葡萄糖 1.0%，酵母粉1.0%，蛋白胨0.2%，鱼粉0.5%，pH值7.2)与 发酵培养基(可溶性淀粉4.0%，葡萄糖1.5%，鱼粉0.5%，酵
55 ℃ 复 性 4 5 s ，7 2 ℃ 延 伸 7 5 s ，3 0 个 循 环 ；7 2 ℃ 延 伸 1 0 min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，Gel Extraction Kit切胶回收。pGM-T克隆试剂盒进行PCR扩增产物的 连接，连接产物转化 E. coli DH5α ，将阳性克隆的菌液交 上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得序列与 GenBank数据库中序列进行BLAST分析。用DNAMAN 软件对所得序列与相似性较高的菌株进行同源性分析， 用MEGA 4软件采用邻接法构建系统发育树，自展系数
表1 不同放线菌的抑菌圈大小及形态
供试放线菌菌株 W04 W2R W01 W25G W09 W13 W14 W29 W33 对照
抑菌圈/mm 25.3 18.5 20.7 15.4 9.2 11.6 7.4 8.2 8.8 0.0
抑菌圈形态 透明、边缘清晰 透明、边缘清晰 透明、边缘较清晰 透明、边缘清晰 透明、边缘稍模糊 透明、边缘稍模糊 半透明、边缘模糊 透明、边缘稍模糊 透明、边缘稍模糊
糖60 g/L，甘氨酸2.3 g/L，生物素11.8 μg/L，(NH4)2SO4 8.1 g/L， KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.72 mg/L，CoCl2 11.8 mg/L， CuSO4·5H2O 20 μg/L，Na2MoO4 0.14 mg/L，H3BO3 20 μg/L， MnSO4 20 μg/L，ZnSO4·7H2O 17 mg/L，FeSO4·7H2O 2 mg/L)
央25 mm处呈“+”字倒放同样大小的供试放线菌菌块。以 维素利用和淀粉水解等生理生化特征分析[12]。
只接病原菌的平板为对照，试验重复3次。28 ℃培养至对
照平板上病原真菌长满平皿，测量病原菌菌落直径，通过
公式(1)计算菌丝生长抑菌率。
生长抑制率(%)= 对照菌对落照直菌径落-直处径理菌落直径×100
孢子丝及孢子形态。
表明：W04、W2R和W01抑菌谱较广，对以上10种供试病原
2)16S rDNA序列分析以及系统发育树的构建
真菌均有不同的抑制效果，尤其对西瓜枯萎病的抑制率最
菌 株 基 因 组 D N A 的 提 取 参 照 N i k o d i n o v i c [9]、 高。其他几株放线菌抑菌效果较弱，且抑菌谱窄小；双层
无
注：其他菌株均无抑菌效果，故未在表1中列出。
1)形态特征观察
2.2 放线菌菌体对供试植物病原菌的拮抗作用
高氏1号琼脂平板中采用插片法[8]将菌株W04在28 ℃
以10株植物病原真菌为指示菌，采用平板对峙法测定
培养箱中培养5~10 d，显微镜下观察气生菌丝、基内菌丝、 筛选到的9株放线菌的拮抗活性，测得抑菌率见表2，结果
10%的接种量接入发酵培养液，置于(28±1) ℃、转速为 200 r/min的恒温摇床上培养5 d[7]后，通过细菌过滤器得到 无菌滤液，吸取3 mL注入无菌培养皿中，将15 mL冷却至 50 ℃左右的PDA培养基倒入培养皿中，混合均匀，凝固后 接入西瓜枯萎病菌菌块(直径5 mm)，以加3 mL无菌水的 PDA平板为对照，重复3次。3 d后测量菌落直径，根据公 式(1)计算抑菌率。
(1)
双层平板法[6]测定放线菌对病原细菌的抑制作用：先
在培养皿中倒入10 mL琼脂培养基，凝固后再倒入10 mL
含有病原细菌菌悬液的牛肉膏蛋白胨培养基，待凝固后在
距平板中央15 mm处呈“+”字倒置放入放线菌菌块，28 ℃
培养24 h，观察抑菌效果并测量抑菌圈直径。
1.2.3 放线菌发酵滤液对植物病原菌的抑菌活性测定 将不同菌株接入种子培养液培养48 h，按体积分数
Abstract: A total of 99 actinomycetes were isolated from 11 kinds of soil samples collected from Hangzhou areas. Nine actinomycetes were screened, which had antagonism to Candida famata producing riboflavin. The strain W04 which had better inhibitory effects to many pathogenic pathogens tested was re-screened by panel confrontation method. The inhibition rate against Fusarium oxysporum f. sp. niveum reached 79.1%, and the mycelia growth inhibitory rate of its fermention filtrate was 82.6% using growth rate method. The strain W04 was identified as Streptomyces lavendulae Waksman & Curtis according to morphology, physiology biochemistry and 16S rDNA sequence analysis. Key words: actinomycetes; plant pathogens; antimicrobial activity; taxonomic identification
1.1.1 土壤样品
母粉1.0%，玉米浆4.0%，KH2PO4 0.2%，KCl 0.2%，CaCO3
从浙江省杭州市不同地形、不同植被、不同土壤类型 0.2%，pH值7.2)用于放线菌发酵培养；酵母培养基(葡萄
随机采集土样11份，晾干后置于4 ℃保存。
1.1.2 供试病原菌 西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. niveum 、玉