病原菌的分离培养和纯化
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普通植物病理学
实验十七、病原菌的分离培养和纯化
一、目的要求
(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
二、基本原理植物病原菌的分离培养,是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜的生活条件,即让病原菌生活在适宜的培养基上,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用,在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养,必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
三、材料、仪器与用具
1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考)
(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。
(2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。
(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。
(4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。
(5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。
(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv.1achrymans)。
(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms 。
(9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv.glycinea)。
(10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp.carotovora)。
2.培养基pda培养基;肉膏蛋白胨培养基;加寄主组织煎汁的培养基等。
3.仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70%酒精、0.1%升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0.1%升汞溶液配制:升汞1e 浓盐酸2.5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中,待充分溶解后,再加水稀释。升汞是剧毒药物,在操作时应特别小心。
四、实验操作
(一)病原真菌的分离
1.组织分离法按照以下步骤进行:
(1)取灭菌培养皿一个,置于湿纱布上,在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示:为了保证无菌操作,应注意下面几点:工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内,工作中临时去取容易带来杂菌;保证工作人员自身的洁净,工作前用肥皂洗手;无菌操作前还要用70%酒精擦拭双手;工作中,特别在使用无菌操作间时,呼吸要轻,不要说话。
(2)用无菌操作法向培养皿中加入25%乳酸1--2滴(可减少细菌污染),然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中,每皿倒10--15ml,轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示:加入25%乳酸1~2滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外,在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长,也是常用的方法。加青霉素(20μg/ml)可以抑制g+细菌生长;加多黏霉素b(5.0μg/ml)可以抑制g—细菌生长;加链霉素(40μg/ml)或氯霉素(50μg/ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外,其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜)’时加
入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领,不必在火焰上方,一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料),选择典型的单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长3--4mm)病组织数块。提示:选择新患病的组织作为分离的材料,可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生,因此,一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
(4)将病组织放人70%酒精中浸3—5s后,按无菌操作法将病组织移人0.1%升汞液中分别表面消毒0.5、1、2、3、5rain(也可使用其他表面消毒剂),如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短;反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留的消毒剂。提示:先用70%的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡,减少表面张力,70%的酒精亦用于表面消毒,处理的时间较短(一般数秒至lmin)。升汞溶液消毒的时间因材料而异,可自30s至30min不等,一般情况下,需时间3,5min。
(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放4--6块。提示:在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水,以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6)将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果。
(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落,则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下,用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上,在25℃左右恒温箱内培养,数日后,观察菌落生长情况,如无杂菌生长,即得该分离病菌纯菌种,便可置于冰箱中保存。提示:除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外,还要在显微镜下检查,进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离,则要将长出的蕾落分别转出,通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。在组织分离工作中,如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实),在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上,完成分离工作。
2.稀释分离法
(1)取灭菌培养皿三个,平放在湿纱布上,编号,并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水,在每一皿中分别注入0.5~1.0ml。
(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液,与第一个培养皿中的灭菌水混合,再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中,混合后再移三环到第三个培养皿中。