食品中金黄色葡萄球菌检验 GBT4789.10-2010

葡萄球菌肠毒素的检测
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目的： 食品原料或成品污染的金黄色葡萄球菌及 某些芽胞菌后会产生危害身体健康的肠毒素， 经热杀菌或货架期长时间放置后微生物死亡， 但由于肠毒素可耐受100℃的高温30min而仍 然不被破坏，故很容易引起食源性中毒，是一 种重要的危害人类健康的细菌毒素。人食用后 会出现严重的腹泻、肠炎甚至死亡。许多欧美 国家对我国进口的一些食品强制要求检测肠毒 素。
MPN 法
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要点
金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品 最高的稀释度应在九管内 如何理解 检验流程 注意事项
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结果报告（MPN/g或MPN /mL） 、阳性管观察和确认、培 养基
PetrifilmTM测试片法
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依据
各国认证 加拿大 Health Protection Branch Method MFLP-21 法国 AFNOR AFNOR Certificate Number 3M 01/9-04/03 日本 Food Safety Regulation Standard Analytical Method 美国 AOAC AOAC 2003.07, AOAC 2003.08, AOAC 2003.11
第三法
金 黄 色 葡 萄 球 菌 P e t r i f i l m TM测 试 片 法
检 样 25g(mL)样 品 +225mL 稀 释 ， 均 质 液，均
制备样品匀液， 做成几个适当倍数的稀释液， 选择合适稀释度， 各 取 1mL,分 别 加 入 Petrifilm 纸片 3 6 °C ± 1 °C 24h± 2 h
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酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种基于抗原抗体免疫反应的快速检测方 法，其基本原理是把抗体预先包被在固体微孔表 面，然后依次加入样本和酶标抗体，使其与结合 在固相载体上的抗体进行特异性反应，形成“三明 治”的抗原抗体复合物结构，最后加入酶反应底物 后，底物能被酶催化变成有色产物，颜色反应的 深浅与样品中相应的抗原量呈正相关。利用肉眼 就可以根据颜色的深浅进行定性分析，或者也可 以使用酶标仪进行定量测定。由于酶的高效性催 化，能放大免疫反应的结果，故其灵敏度很高， 是一种经典的免疫学检测方法。 AOAC官方标准：OMA 993.0
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食品中金黄色葡萄球菌检验
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修订原则
参照FDA、AOAC、ISO等有关标准，使本标 准更接近现行国际标准 积极吸取新方法、新技术 保持与原标准的连续性
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食品中金黄色葡萄球菌检验
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将原标准拆分为三种方法(定量和定性) 增加计数标准的的方法： MPN法 对有些描述更细化 增加计数公式和公式的解 释、操作描述等方面
食品中金黄色葡萄球菌检验
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背景资料
FDA BAM (2001)chapter12 AOAC 975.55 987.09 AOAC 975.55 987.09 ISO6888-1、ISO 6888-2 CCFAC(RA) Microbiological Methods Manual Method 7.2:1995 UK Canada MFHPB-28(September 1995) USDA/FSIS Microbiology laboratory Guidebook 3 rd Edition SN 0172-92
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VIDAS 葡萄球菌肠毒素(SET2) Ref 30705
名字 : VIDAS Staph enterotoxin II 葡萄球菌肠毒素 代码 : SET2 货号 : 30705 包装 : 30 检测 说明 : 检测食品中的葡萄球菌肠毒素 实验时间: 出结果时间: 认证 : 80分钟 1天 AOAC
TM
判读
没有菌落
只有典型紫红色菌落
除典型紫红色菌落外其它颜色的菌落
所有紫红色菌落计数为金 黄色葡萄球菌
在测试片上置入确认反应片后培 养 1-3 h
报
告
计数有粉红色菌晕的菌落为金黄色葡 萄球菌
PetrifilmTM测试片法
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定性方法
2003版
结 果 判 定
划线Baird-Parker平板：
§菌落直径为2mm～3mm ； §颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外 层有一透明圈； §用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非 脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈；
§长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产 生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥；
100 90 80 含各致病因子的菌株% 70 60 50 40 30 20 10 0 SEA SEC SEG SEJ etd TSST-1 致病因子基因类型
定量方法
计数标准
第二法：Baird Parker 第三法：MPN法 增加了计算公式
新增加
介绍PetrifilmTM测试片法
图1 金黄色葡萄球菌Baird－Parker平板法检验程序
增加了计算公式 两个 公式一： T=AB/Cd T:样品中金黄色葡萄球菌菌落数 A:某一稀释度典型菌落的总数 B:某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数 C:某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数 d:稀释因子
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使用前，如Baird－Parker平板表面有水珠，可放 在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的 水珠消失。 如样液不易吸收，可将平板放在36℃±1℃孵育 1 h；等样液吸收后反转平皿， 再培养。
划线血平板：
§菌落较大，圆形，光滑凸起 ，湿润； §颜色呈金黄色，有时呈白色； §菌落周围有透明溶血圈
血 浆 凝 固 酶 试 验
新鲜配置的兔血 浆0.5ml
BHI 培 养 物 0.2ml~0.3ml
振荡摇匀， ℃+1℃温箱或水浴箱； 置36 36℃ 间隔 30min 观察，共 6h ； 间隔30min 30min观察，共 观察，共6h 6h；
Baird-Parker法
计算
公式二：N=∑T/1.1d ∑T：两个稀释度确认的金葡菌 d：第一级稀释度
公式引用ISO 6888-1:1999(E)
A1B1 C1 + A2B2 C 2 T= 1.1d
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T —样品中金黄色葡萄球菌菌落数A1 —第一稀释度（低 稀释倍数）典型菌落的总数 A2 —第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数 B1 —第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落 数 B2 —第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落 数 C1 —第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的 菌落数 C2 —第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的 菌落数 1.1 —计算系数 d —稀释因子（第一稀释度）
Baird-Park法
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举例
eg 1 eg 2
10-1 65 183
10-2 6 21
Baird-Park法
举例
举例1： T=AB/Cd 公式一： T=65×4×10÷5=520 举例2： 公式二：N=∑T/1.1d T1=183×3÷5=110 T2=21×4÷5=17 ∑T= T1+ T2=127 N=∑T/1.1d=127×10÷1.1=1200
25 g 加入到 25 mL 提取缓冲液, 高速搅拌3 min 混合均匀
15 min @ 室温
离心 15 mn @ 3.000-5.000 g
用塞有润湿的脱脂棉的注射器抽取上 层液体 检测 pH (7.5 to 8)
µL:80分钟 500 500µ
VIDAS SET2
PCR法测定金葡中致病因子
食品中分离的金黄色葡萄球菌中致病因子的分布情况
食品中金黄色葡萄球菌检验
GB/T4789.10-2010
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金黄色葡萄球菌是造成人类食物中毒的重要致病 菌之一,在历年的食物中毒调查中, 该菌占整个细 菌性食物中毒的第1位或第2 位。本菌广泛分布 于自然界, 如空气、土壤、水及其他环境中。在 人类和动物的皮肤与外界相通的腔道中, 也经常 有本菌存在。具报道, 在正常人群中的带菌率可 达到30%～80%, 因此, 其可以通过各种途径和方 式, 尤其是经工作人员的手和上呼吸道而污染食 品, 并在合适的温度环境下, 细菌可以大量繁殖并 产生肠毒素, 从而引起消费者食物中毒。
结果判定
如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块） 或凝固体积大于原体积的一半， 被判定为阳性结果； 同时以已知血浆凝固酶试验阳性 和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照
结果如可疑： 挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5mLBHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复前 面的凝固酶试验。
结果报告
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报告在25g（mL）样品中检出或未检出金黄 色葡萄球菌。
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典型菌落计数和确认
A.如果只有一个稀释度平板菌落数在20 ～200 cfu之间，计数 A. 该稀释度平板上的典型菌落 B.最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数该稀释度平板上的 典型菌落； C.某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，但上 一倍稀释度平板上没有典型菌落，计数该级稀释度平板上的 典型菌落； D.某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，且上一 倍稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在20 cfu～200 cfu之间，计数该级稀释度平板上的典型菌落； 以上按公式一计算。 E.平板菌落数均在20 cfu～200 cfu之间，按公式二计算。
结果报告
单位：cfu/g或者cfu/mL； -1 若T或者N为0，报告<1d cfu/mL(g).
Baird Parker 培养基 + RPF 培养基构成
� R1 试剂 : Baird Parker 基础琼脂 � R2 试剂 : RPF 配方 (兔血浆 + 纤维蛋白原试验
)
凝固酶阳性葡萄球菌 : 菌落周围形成沉淀圈 (例) 金黄色葡萄球菌
的竞争性抑制反应；例如I125标记抗体，用于检测未知食品中的SE。
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酶联免疫吸附试验：目前应用较广；试剂盒或 全自动酶联荧
光免疫分析法(VIDAS法) 的使用；但是目前只能检测 传统的A-E五种
血清型。ห้องสมุดไป่ตู้
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聚合酶链反应技术：在体内模拟自然DNA的复制过程，对特定的
DNA或DNA片段进行快速扩增的方法，研究报道此法可对致病因子进行 快速准确的检测；
葡萄球菌致病因子
1 肠毒素：耐热的细菌外毒素，致病主要原因； 根据血清分型：A、B、C1-C3、D、 E、G、 H、I和J； 2 表皮剥脱毒素：eta etb etd ： TSST-1 3 中毒休克综合征毒素 中毒休克综合征毒素：
检测方法
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动物试验：幼猫或猴作为研究对象，观察结果 放射免疫测定法：建立在标记抗原和非标记抗原对特异性抗体
第三天
确认结果
MPN法
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依据
AOAC 987.09 FDA BAM 2001 德国 DIN EN ISO 6888-3:2003 SN0172-92标准 台湾检验方法 欧美国的一些产品的卫生标准要求
图 1 Baird －Parker 平板法检验程序 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌Baird Baird－ Parker平板法检验程序
Baird Parker 培养基 + RPF 操作 ：表面涂布方法
R1 基础琼脂
°C 水浴， 先溶於 100 100° °C 保温 然后置於 45 45° 。 R2 试剂
R1 试剂加入 R2 琼脂中融 化
ml 的琼 将约 20 20ml 脂加入平皿中， 配置平板。
待凝固烘干后， ml 将0.1 至 0.4 0.4ml 的样本液进行涂 布
方法的注意事项
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使用前，如Baird－Parker平板表面有水珠，可放 在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的 水珠消失。 如样液不易吸收，可将平板放在36℃±1℃孵育 1 h；等样液吸收后反转平皿， 再培养。
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Baird-Parker法
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计算
统一了样品的处理程序 增加了计数要求 选择20—200cfu菌数的平板
ml 无 加 10 10ml 菌水溶解
于37°C 下进行孵育 24小时
Baird Parker 琼脂 + RPF 与平板表面计数法的比較
g样品 + 225 ml 稀释液 25 25g 225ml
第一天
第二天
BPA+RPF BPA
阅读結果 ) (无需确认 无需确认)
挑可疑菌落 酶试验 进行凝固 行凝固酶试验