实验九质粒DNA的制备

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试剂
溶液Ⅰ： 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA
溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS
溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml
(酚/氯仿)，异丙醇, 乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA
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三．实验方法
一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到培养基上（活化菌种），37℃过 夜培养
2. 从培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含 氨苄），37℃振荡过夜培养
3. 从中取4毫升种子菌液于LB培养基中（含Amp），37℃振荡 培养3-4小时
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二 质粒提取
1. 取1ml培养物倒入 Eppendorf 管中，4000-5000r/min，5min 2. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 3. 将细菌沉淀悬浮于150μl溶液Ⅰ中，振荡混匀。 4. 加入150μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物，
室温放置5分钟。 5. 立即加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 6. 12000r 4 ℃离心10分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管
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分离质粒DNA方法
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法；
煮沸法；
SDS法； 羟基磷灰石层析法等
各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、 碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化。
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本实验目的
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pUC19
链长2,686 bp 多克隆位点：EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I,
Sal I, Pst I, Sph I 和Hind III 只有一个酶切位点。 用途 克隆外源基因。 利用lac promoter进行基因表达。 使用M13 primers进行DNA测序。
实验四 碱变性法小量制备质粒 DNA
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一．实验目的及背景
质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。
大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。
其复制和遗传独立于细菌染色体。
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质粒类型
质粒按复制方式分为两种类型： 1.松弛型质粒
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋 白。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依 然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色 体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷 贝数可达 2000-3000 拷贝。
本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
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碱变性法基本原理
在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌 染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状 态。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上 清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
中。
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7．加入等体积异丙醇，振荡混匀，于室温静置5分 钟,12000r 4 ℃离心15分钟。
8．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数 次，8000r 于离心5分钟。
9．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。
10．加入20μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解 DNA。
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问题与讨论：
１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作 用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应 体系出现的现象及其成因。
２．染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据 是什么？
3. 沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高 盐、低温条件下进行？
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2.严紧型质粒
严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白， 质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成 抑制剂来增加。
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质粒的应用
大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒
害致死的基因。
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细 菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。