蛋白质序列分析

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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
氨基酸组成分析
二硫键裂解后，需要对每个多肽链中氨基酸的组成进行 测定;
将分离纯化后的多肽链样品分为两部分，一部分样品经 过完全水解，测定其氨基酸组成，并计算出氨基酸各种 残基的含量；另一部分样品则进行N-端或C-端测序。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
2．影响Edman降解反应裂解率的因素 测序完成后，根据每个循环的产率得到起始产率 （initial yield），起始产率可估计蛋白质真实含量， 与氨基酸组成分析得到的含量相比，还可以推测N端 是否封闭； 根据每个循环的产率得到的重复产率（repetitive yield）可判断仪器是否正常运行。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
1953年，Frederick Sanger在对牛胰岛素研究中首先 提出氨基酸直接测序概念； 迄今为止，直接测序已阐明了几千种蛋白质的氨基酸 序列。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
氨基酸组成分析
二硫键裂解之后，通过SDS-PAGE电泳法或SEC或 RP-HPLC色谱法等分离蛋白质不同亚基; 由于每个氨基酸残基的分子质量大约110Da，根据 每个亚基分子质量大小，可确定氨基酸残基数量; 蛋白质的分子质量一般采用SDS-PAGE或SEC等方法 确定，生物质谱法因为准确度更高、分析速度更快， 现在越来越被普遍采用。
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2019/4/2 丝、酪
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
Edman降解法可在全自动测序装置中完成；
全自动测序仪反应杯中，蛋白质键合于固相基质上或 吸附于惰性玻璃纤维上而被固定，反应试剂通过泵系 统注入并控制试剂量，Edman降解反应产生的噻唑 啉酮衍生物被输送进入反应杯，再经过水解生成 PTH-氨基酸，含有50个氨基酸残基的蛋白质序列可 在1小时内完成测定，蛋白质量低至pmol时也能够得 到准确的分析结果。
蛋白质序列分析
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2019/4/2
第一节 肽和蛋白质测序策略
蛋白质一级结构即蛋白质多肽链中氨基酸排列顺序， 既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有 助于蛋白质基因结构的研究。 测定蛋白质氨基酸序列对诊断学新方法开发、 治疗 新方法建立及多肽类药物的研究均有重要意义。
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2019/4/2 精、赖
第二节 氨基酸直接测序
肽链的裂解-化学降解法
总之，为满足测序要求， 常采用不同方法来进行 多肽链的裂解，以得到 足够小的多肽片段。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
二硫键（Disulfide bond）的裂解
确定不同的多肽链数目
根据蛋白质N-端或C-端残基摩尔数和蛋白质相对分子 质量可确定蛋白质分子中多肽链数目； 单体蛋白质分子只含一条多肽链，蛋白质摩尔数与末端 残基摩尔数相等； 由多条多肽链组成的蛋白质分子，末端残基摩尔数是蛋 白质摩尔数的倍数。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽链的裂解
采用化学或酶反应裂解肽链中某些特殊位置上的肽键， 产生若干能进行测序的小片段； 一般将蛋白质样品分为两等份，采用不同试剂裂解产 生两套不同片段，分别完成两套片段测序后，根据重 叠情况即可重新排序。
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二硫键在两个Cys残基间形成，可出现在一条多肽链不同 氨基酸残基间，也可出现在不同多肽链氨基酸残基间; 测序之前，必须裂解存在于多肽链或不同多肽链间的二硫 键以便于分离和展开亚基; 分解蛋白质原有结构也使测序中采用的蛋白质分解试剂能 够更好地发挥作用。
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2019/4/2 半胱
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
三氟乙酸可构成强酸条件并裂解PTC-肽，但也可与Ser 和Thr上的羟基发生反应，使Ser和Thr的N端α-氨基发生 部分封闭，因此当反应循环至Ser和Thr时，裂解产率会 突然降低。
丝氨酸和苏氨酸的PTH衍生物会部分转化为其他产物， 也会导致产率降低。 耦联试剂PITC所发生副反应也会影响正确辨认。
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2019/4/2 尺寸排阻
第二节 氨基酸直接测序
氨基酸组成分析
酸催化水解中，寻找理想水解条件比较困难，因为要 裂解所有肽键，必须对氨基酸残基的降解平衡进行综 合考虑； 碱催化水解一般用于特殊情况下，多肽在100℃条件 下与4MNaOH反应4～8小时，Arg、Cys、Ser、Thr被 分解，其它的氨基酸则被脱胺基和外消旋； 内肽酶和外肽酶具有高度专一性，可用作某些肽键水 解的催化酶，Asn、Gln、Trp 等含量的测定常常采用 酶法。
下一个残基不是Pro时，胰蛋白酶可裂解肽链羧基端（C 端）带正电荷残基（Arg和Lys）；
将胰蛋白酶消化所获得特征片段图谱与数据库进行比较， 即可进行蛋白质的鉴定。
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2019/4/2 脯、精、赖
第二节 氨基酸直接测序
肽链的裂解-酶解法
除去裂解位点后，即除去Lys或Arg支链上正电荷，这个 位点上的肽将不再被胰蛋白酶切断；
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
目前，一般蛋白质分析最多能够分析至N端第50个氨基 酸左右，而对蛋白质全序列分析，首先需要将蛋白质裂 解为一系列肽段，对各个肽段进行分析后再拼接。 蛋白质样品中含有较多对Edman反应敏感的残基或肽 键时，由于肽键容易发生断裂，得到的裂解率将更低。
第二节 氨基酸直接测序
二硫键的裂解
裂解反应最好在变性条件下进行； 加入盐酸胍或SDS等变性剂，使紧密结合的蛋白质结构 展开而暴露出所有的二硫键，然后加入氧化剂或还原剂 使二硫键裂解。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
二硫键的裂解
方法的明显缺点是过甲酸会导致Met残基氧化为甲硫氨 酸亚砜和砜，也可使Trp残基的吲哚侧链部分降解。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽链的裂解-酶解法
用于蛋白质部分裂解的蛋白酶
蛋白酶 胰蛋白酶 胃蛋白酶 Rn-1=Arg,Lys Rn=Leu,Phe,Trp,Tyr,Val Rn-1=Phe,Trp,Try Rn-1=Glu 酶切位点 Rn≠Pro Rn-1≠Pro Rn≠Pro
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
在Merrifield树脂 固相基质上进行 的Edman降解反 应情况如图
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽链的裂解
多肽片段太长，不能直接进行序列测定，必须通过特 定反应将裂解为更小的肽段； 通过两种或几种不同断裂方法（断裂点不同）将每条 多肽链样品降解成为两套或几套重叠肽段或肽碎片， 每套肽段分别进行分离、纯化， 再对纯化后的每一肽 段进行氨基酸组成和末端 残基分析。
肽链的裂解
当蛋白质分子由二条或二条以上多肽链构成时，必须 裂解这些多肽链。
如果多肽链之间通过共价二硫键交联，可采用氧化剂 如果多肽链是通过非共价相互作用缔合的寡聚蛋白， 或还原剂断裂二硫键。 用8 mol/L尿素、6 mo1/L盐酸胍或高浓度盐等变性剂 处理，裂解寡聚蛋白质中的亚基； 再根据裂解后的单个多肽链不同大小或不同电荷进行 分离、纯化。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
氨基酸组成分析
通过测量氨基酸残基的相对百分比并与数据库进行比较 可确定一个未知蛋白质的氨基酸组成；
测量分两个步骤完成:
首先通过酸水解、碱水解或酶水解等裂解蛋白质中所有 肽键; 继而分离游离氨基酸并进行定量测定。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
Edman降解测序包括耦联、裂解、萃取和转换等过程。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
Edman降解的最大优点是水解除去末端标记的氨基酸 残基时，不会破坏余下的多肽链。 蛋白质中含有一个或多个半胱氨酸残基时，有时一对 半胱氨酸残基会通过二硫键发生交联，在此情况下首 先对二硫键进行裂解处理，再进行Edman降解测序。
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2019/4/2
第一节 肽和蛋白质测序策略
①根据基因测序结果，从cDNA演绎肽和蛋白质序列；
简单、快捷，甚至可得到未分离出的蛋白质或 多肽 序列信息，但得到的一级结构不含蛋白质 翻译后修 ②直接测序策略； 饰及二硫键位置等信息； ③质谱测序与生物信息学搜索相结合的策略。
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2019/4/2 蛋、色
第二节 氨基酸直接测序
二硫键的裂解
二硫键也可以用大大过量的二硫苏糖醇（DTT）或巯基 乙醇还原为巯基。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
二硫键的裂解
为防止二硫键重新形成，产生的巯基（-SH）须用烷基 化试剂（如碘乙酸）处理，处理后产生的烷基化衍生物 在后续测序步骤中的肽裂解条件下十分稳定。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
N-端序列分析（Edman降解） 1．Edman降解分析原理 通过与氨肽酶（aminopeptidase）、丹磺酰氯（dansyl chloride）或Edman试剂（phenyl isothiocyanate， PITC,异硫氰酸苯酯）的反应进行。
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2019/4/2 赖、精
第二节 氨基酸直接测序
肽链的裂解-酶解法
如果在其他氨基酸支链上引入正电荷，会产生一个可 被胰蛋白酶识别的新裂解位点；
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽链的裂解-酶解法
内肽酶专一性比胰蛋白酶略差，所产生肽片段小，与其 它肽片段重叠程度不够，肽片段在蛋白质序列中重新排 列时的位置可能发生错误； 对Arg和Lys含量较高的蛋白质，则可采用限制胰蛋白酶 水解方式，亦即通过改变反应条件，缩短反应时间，使 酶与肽链接触机会减小，从而获得符合测序要求的肽片 段。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
肽段氨基酸序列的测定
肽和蛋白质序列测定（Protein Sequencing）直接测序 策略步骤： 1.采用化学法或酶法从蛋白质多肽链N端或C端将氨基 酸残基依次从蛋白质或多肽末端切割下来； 2.对每次切割下来的氨基酸残基进行正确鉴定，通常 采用在氨基酸残基上衍生一个生色基团，利用高效 液相色谱法进行分离鉴定氨基酸残基。
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2019/4/2
第二节 氨基酸直接测序
氨基酸组成分析
上述几种方法都可应用于定量测定某些氨基酸，为保证 所有肽键完全水解，又不引起氨基酸残基降解，单独采 用任何一种方法都不能满足要求，可采用两种或三种水 解方法的联合应用。 完成水解后所得的游离氨基酸混合物采用离子交换色谱 或 RP-HPLC 进行分离，根据洗脱时间进行鉴定，根据 峰面积或峰高进行定量测定。
内肽酶
糜蛋白酶 内肽酶GluC
亮氨酸氨肽酶 R1≠Pro
氨肽酶
外肽酶 羧肽酶 A 羧肽酶 B 羧肽酶 C
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所有N-端残基
Rn≠Arg,Lys,Pro 1≠Pro Rn=Arg,Lys 所有C-端残基
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2019/4/2
RnRn-1≠Pro
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第二节 氨基酸直接测序
肽链的裂解-酶解法