Folin-酚比色法测定蛋白质含量

实验一 Folin-酚比色法测定蛋白质含量

一. 目的

学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法

二. 原理

Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。

在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。

该方法灵敏度高，测定范围为25μg～250μg，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。

注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。

三. 实验材料及设备

1. 材料

绿豆芽

2. 仪器

分光光度计电子天平

3. 器材

普通试管：20mL×8

容量瓶：100mL×1

移液管：1mL×4 5mL×1

烧杯：250mL×1 50mL×1

滤纸：φ11cm

滴管： 2

洗耳球： 2

坐标纸

研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1

四. 试剂的配制

1. 牛血清白蛋白标准液（250μg/mL）

精确称取0.0250g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。

2. Folin-酚试剂甲

●溶液A：Na2CO310g

NaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL；

酒石酸钾钠0.25g

●溶液B：CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL；

●使用前，将溶液A和溶液B以50:1相混合。该混合液只能保持一天。

3. Folin-酚试剂乙

●在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠

(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。

●回流结束后，趁热加入150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴，再继续开口沸腾

15分钟，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。

（若仍呈绿色，须重复滴加液体溴，再沸腾15分钟，直至呈黄色。）

●用蒸馏水定容到1000mL；过滤；用棕色试剂瓶保存。

●使用前稀释1倍，使其最终浓度相当于1N酸。

五. 操作步骤

1. 样品液的制备

(1) 取材：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g左右，准确记录其质量。

(2) 研磨：将取得的材料置于研钵中，研磨成匀浆。

(3) 过滤：将匀浆转移至垫有滤纸的漏斗中过滤，收集滤液；

用约10mL蒸馏水分三次洗涤研钵，洗涤液也过滤并收集其滤液。

(4) 定容：将滤液用蒸馏水定容到100mL，作为样品待测液。

2. 标准曲线制作及样品测定

取8支试管，按下表所示顺序操作。

六. 结果处理

1. 由0～5号管的数据，以蛋白质含量(μg)为横坐标，A500为纵坐标，在坐标纸上绘制标

准曲线；

2. 求两个样品管A500的平均值—A500；

3. 由—A500从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(μg)；

4. 计算你所取生物材料中蛋白质的百分含量。