Folin-酚比色法测定蛋白质含量
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实验一 Folin-酚比色法测定蛋白质含量
一. 目的
学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法
二. 原理
Folin-酚法,又名Lowry法,所用的试剂由两部分组成:试剂甲为碱性硫酸铜溶液,相当于双缩脲试剂,可与蛋白质中肽键起双缩脲反应,生成Cu2+-蛋白质络合物;试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物,在碱性条件下极不稳定,易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。
在一定蛋白质浓度范围内,钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比,以此可测定蛋白质的含量。
该方法灵敏度高,测定范围为25μg~250μg,比双缩脲法灵敏100倍,用作一般浓度的测定较为适宜,且操作简便、快速,所以是一般实验室中经常使用的方法之一。
注意,酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。
三. 实验材料及设备
1. 材料
绿豆芽
2. 仪器
分光光度计电子天平
3. 器材
普通试管:20mL×8
容量瓶:100mL×1
移液管:1mL×4 5mL×1
烧杯:250mL×1 50mL×1
滤纸:φ11cm
滴管: 2
洗耳球: 2
坐标纸
研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:各1
四. 试剂的配制
1. 牛血清白蛋白标准液(250μg/mL)
精确称取0.0250g牛血清白蛋白,用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2. Folin-酚试剂甲
●溶液A:Na2CO310g
NaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL;
酒石酸钾钠0.25g
●溶液B:CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL;
●使用前,将溶液A和溶液B以50:1相混合。该混合液只能保持一天。
3. Folin-酚试剂乙
●在1500mL容积的磨口烧瓶中,加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠
(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水,再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸,充分混合后,接上回流冷凝管,以小火回流10小时。
●回流结束后,趁热加入150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴,再继续开口沸腾
15分钟,以驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色。
(若仍呈绿色,须重复滴加液体溴,再沸腾15分钟,直至呈黄色。)
●用蒸馏水定容到1000mL;过滤;用棕色试剂瓶保存。
●使用前稀释1倍,使其最终浓度相当于1N酸。
五. 操作步骤
1. 样品液的制备
(1) 取材:称取新鲜绿豆芽下胚轴2g左右,准确记录其质量。
(2) 研磨:将取得的材料置于研钵中,研磨成匀浆。
(3) 过滤:将匀浆转移至垫有滤纸的漏斗中过滤,收集滤液;
用约10mL蒸馏水分三次洗涤研钵,洗涤液也过滤并收集其滤液。
(4) 定容:将滤液用蒸馏水定容到100mL,作为样品待测液。
2. 标准曲线制作及样品测定
取8支试管,按下表所示顺序操作。
六. 结果处理
1. 由0~5号管的数据,以蛋白质含量(μg)为横坐标,A500为纵坐标,在坐标纸上绘制标
准曲线;
2. 求两个样品管A500的平均值—A500;
3. 由—A500从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(μg);
4. 计算你所取生物材料中蛋白质的百分含量。