Folin-酚比色法测定蛋白质含量

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实验一 Folin-酚比色法测定蛋白质含量

一. 目的

学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法

二. 原理

Folin-酚法,又名Lowry法,所用的试剂由两部分组成:试剂甲为碱性硫酸铜溶液,相当于双缩脲试剂,可与蛋白质中肽键起双缩脲反应,生成Cu2+-蛋白质络合物;试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物,在碱性条件下极不稳定,易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。

在一定蛋白质浓度范围内,钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比,以此可测定蛋白质的含量。

该方法灵敏度高,测定范围为25μg~250μg,比双缩脲法灵敏100倍,用作一般浓度的测定较为适宜,且操作简便、快速,所以是一般实验室中经常使用的方法之一。

注意,酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。

三. 实验材料及设备

1. 材料

绿豆芽

2. 仪器

分光光度计电子天平

3. 器材

普通试管:20mL×8

容量瓶:100mL×1

移液管:1mL×4 5mL×1

烧杯:250mL×1 50mL×1

滤纸:φ11cm

滴管: 2

洗耳球: 2

坐标纸

研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:各1

四. 试剂的配制

1. 牛血清白蛋白标准液(250μg/mL)

精确称取0.0250g牛血清白蛋白,用蒸馏水溶解后定容至100mL。

2. Folin-酚试剂甲

●溶液A:Na2CO310g

NaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL;

酒石酸钾钠0.25g

●溶液B:CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL;

●使用前,将溶液A和溶液B以50:1相混合。该混合液只能保持一天。

3. Folin-酚试剂乙

●在1500mL容积的磨口烧瓶中,加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠

(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水,再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸,充分混合后,接上回流冷凝管,以小火回流10小时。

●回流结束后,趁热加入150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴,再继续开口沸腾

15分钟,以驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色。

(若仍呈绿色,须重复滴加液体溴,再沸腾15分钟,直至呈黄色。)

●用蒸馏水定容到1000mL;过滤;用棕色试剂瓶保存。

●使用前稀释1倍,使其最终浓度相当于1N酸。

五. 操作步骤

1. 样品液的制备

(1) 取材:称取新鲜绿豆芽下胚轴2g左右,准确记录其质量。

(2) 研磨:将取得的材料置于研钵中,研磨成匀浆。

(3) 过滤:将匀浆转移至垫有滤纸的漏斗中过滤,收集滤液;

用约10mL蒸馏水分三次洗涤研钵,洗涤液也过滤并收集其滤液。

(4) 定容:将滤液用蒸馏水定容到100mL,作为样品待测液。

2. 标准曲线制作及样品测定

取8支试管,按下表所示顺序操作。

六. 结果处理

1. 由0~5号管的数据,以蛋白质含量(μg)为横坐标,A500为纵坐标,在坐标纸上绘制标

准曲线;

2. 求两个样品管A500的平均值—A500;

3. 由—A500从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(μg);

4. 计算你所取生物材料中蛋白质的百分含量。

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