发酵工程第三章 发酵机制

葡萄糖
6-磷酸葡萄糖
葡
6-磷酸果糖 6-磷酸葡萄糖酸
萄 糖
生
果糖-1，6-二磷酸
5-磷酸核糖
物
合
NAD+
NADH2 3-磷酸甘油醛
成 谷
乳酸
丙酮酸
⑨
③ 乙酰辅酶A
CO2 ② CO2 CO2
磷酸烯醇式
氨 酸 的
NADPH2
丙酮酸羧化酶 代
CO2草酰乙酸
天冬氨酸 柠檬酸
谢 途
NADP+
⑧
NAD+
NADH2
2. NH4+浓度 （1）影响到发酵液的pH值 （2）与产物的形成有关：
过低，不利于α—KGA的还原氨基化 过高，产生固安酰胺
NH4+的供给方式： （1）液氨 （2）流加尿素
3.磷酸盐 过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA
之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等…… （2）产生并积累Val，
类发酵称之为：代谢控制发酵
发酵机制：微生物通过其代谢活动，利用基 质（底物）合成人们所需要的
代谢产物的内在规律。 发酵机制研究的内容：
1.微生物的生理代谢规律（就是各种代谢产 物合成途径及代谢调节机制）；
2.环境因素（营养条件、培养条件等）对代 谢的影响及改变代谢的措施；
第一节 有机酸发酵机制
柠檬酸的发酵机制
2.GA产生菌体内的NADPH的再氧化能力欠缺或丧 失
（1）如上图所示，NADPH是α—KGA还原氨基化生 成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH
是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。
（2）由于NADPH的再氧化能力欠缺或丧失，使得 体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制α— KGA的脱羧氧化有一定的意义。 3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶— —异柠檬酸裂解酶。
归纳： ①果Mn糖2+激缺酶乏的→代抑谢制调蛋节白，合促成进→ENMHP4途↑ 径畅通解除磷酸 有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链 ②由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。
丙应酮的酸平氧 衡化 ，脱 以羧 及生柠成檬乙酸酰合成Co酶A和不C被O调2的节固，定增两强个了反 合成柠檬酸的能力。 ③由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使 柠檬酸积累。 ④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌 头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸 的积累及排出细胞外。
谷氨酸来自百度文库酵机制
谷氨酸，学名：α-氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨 酸钠，商品名称味精，是重要的调味品。
早期生产谷氨酸的方法有两种，一是提取法：甜 菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可 得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水 解，再分离提纯。1957年发酵法生产谷氨酸在日 本协和发酵公司投产。
3.柠檬酸的产酸速度大大地高于国外水平。平均产 酸速率是国外的2 倍。
葡萄糖 磷酸烯醇式丙酮酸
14
13
丙酮酸
柠檬酸
ATP
1
脱氢酶
乙酰辅酶A
降低
2
草酰乙酸
限速反应
柠檬酸
乙酰辅酶A
10
3
苹果酸 延胡索
12
关键酶
9
酸酶
延胡索 酸
乙醛酸 抑激制活
8
琥珀酸
7
AAMTP
抑 激制 活
顺乌头酸16 衣康酸
11
异柠檬酸 脱氢酶
3
异柠檬酸 异柠檬酸
4 脱氢酶 草酰琥珀酸
琥珀酰辅酶A
6
α-酮戊二 酸脱氢酶
α－酮戊二酸
5
15 谷氨酸
异柠檬酸 脱氢酶
TCA循环与乙醛酸循环
葡萄糖
14
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸 脱氢酶
13
丙酮酸
1
CO2
乙酰辅酶A
2
参与嘌呤和嘧啶的合成 脂肪酸
苹果酸 脱氢酶
草酰乙酸
10
苹果酸
9
延胡索酸
8
琥珀酸
7
天冬氨酸
乙酰辅酶A
顺乌头酸 径
苹果酸
乙醛酸循环 TCA循环
延胡索酸
乙醛酸
⑤
异柠檬酸
④
NADP+
琥珀酸 ⑥ CO2
CO2 草酰琥珀酸
α－酮戊二酸
⑦
NADPH2
谷氨酸
NADP+
NADPH2
乙醛酸循环
GA生物合成的内在因素
从上图可以看出，GA产生菌必须具备以下条件： 1.α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失
这是菌体生成并积累α—KGA的关键，从上图可 以看出，α—KGA是菌体进行TCA循环的中间性产 物，很快在α—KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成 琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低， 也就是说，由α—KGA进行还原氨基化生成GA的 可能性很少。只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低 时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。
2.影响杂醇油形成的条件
①菌种； ②培养基组成：酮酸溢流； ③发酵条件：一般发酵温度高，高级醇生成
量高，通风有利于高级醇生成 高级醇生成与乙醇生成是平行 的，随乙醇的生成而生成。
第二节 氨基酸发酵机制
氨基酸发酵的代谢控制
控制发酵的环境条件 氨基酸发酵受菌种的生理特征和环 境条件的影响。 控制细胞渗透性 通过改变细胞渗透性，实现氨基酸 的积累。
二、TCA循环的调节 1.TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。
但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这 是黑曲霉TCA循环的第一个特点。 顺乌头酸酶失活，阻断TCA循环是柠檬酸积累的 必要条件。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失 活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌 头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可 能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。 2.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺 失或活力很低（TCA循环被阻断）。 3.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。 标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP， 缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积 累减少。
果糖激酶的合成 6-P-葡萄糖↑（积累） 反馈抑制己糖激
酶
，抑制葡萄糖进入细胞内
葡萄糖利用降低。
同时，在好气条件下，丙酮酸激酶活性降低。
另外，丙酮酸激酶活性降低也是由于磷酸果糖激酶活性降低所致。
丙酮酸激酶活性↓ 使磷酸烯醇式丙酮酸↑ 反馈抑制己糖激酶活性 糖酵解速度↓
ATP 葡萄糖 ⑴ ADP
ADP ATP ATP CO2 CO2 ADP
CO2
乙丙酮酰CoA
酸羧 化酶
草酰乙酸
柠檬酸
抑 制
顺乌头
剂 阻断 酸酶
苹果酸
顺乌头酸
柠檬酸的生物合成途径
柠檬酸积累的代谢调节
糖酵解及丙酮酸代谢的调节 黑曲霉在缺锰的培养基中培养时，可提高 NH4+浓度，高浓度NH4+可有效解除ATP、 柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制。 三羧酸循环的调节 及时补加草酰乙酸
乳酸 ⑿ +2H+
AMP
NH4+
乙醇
葡萄解糖除-6-果磷糖酸-抑6-⑵制磷酸
柠檬酸 ATP
活化
Mg2+
磷酸果
⑶
ADP
无机磷⒁
糖激酶
果糖-1，6-二磷酸
丙酮酸
2NAD+
⑾ 2CO2
乙醛 +2H+
⑷
二羟丙酮 磷酸
⑸
甘油醛3-磷酸
烯醇式丙酮酸 2ATP
⑽
2(NADH+H+)
⑹ 2Pi 1，3-二磷酸甘油酸
力，使a-酮戊二酸不能继续氧化；CO2固定反应的能力 强，使四碳二羧酸全部是由CO2固定反应提供，而不走乙 醛酸循环，以提高对糖的利用率；谷氨酸脱氢酶的活力很 强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和反馈阻
遏．同时NADPH2再氧化能力弱，这样就使a-酮戊二酸到 琥珀酸的过程受阻，在有过量铵离子存在的条件下，a-酮 戊二酸经氧化还原共遏氨基化反应而生成谷氨酸，生成的 谷氨酸不形成蛋白质，而分泌泄漏于菌体外，谷氨酸产生 菌不利用体外的谷氨酸，谷氨酸成为最终产物。
GA发酵的外在因素
GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的 菌体特性，但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在 因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。 1.供氧浓度 过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α—KGA的还原氨 基化受到影响，不利于GA 的生成。 供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利 于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖 酸转化率，降低了产物的提出率。
控制旁路代谢
D-苏氨酸
L-苏氨酸
D-苏氨酸 脱氢酶
α-酮基丁酸
L-苏氨酸 脱氢酶
反馈抑制
L-异亮氨酸 降低反馈作用物的浓度
控制反馈作用物浓度是克服反馈抑制和 阻遏，使氨基酸的生物合成反应能顺利 进行的一种手段
消除终产物的反馈抑制与阻遏
通过使用抗氨基酸结构类似物突变株的 方法来进行
促进ATP的积累，以利于氨基酸的生物 合成
该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以 通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来 实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。
4.菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性
L—谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌 体内该酶的酶活性都很强，该反应的关 键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联。
谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型，谷氨酸发酵时通过控 制生物素亚适量，使最后一代细菌细胞变形、拉长，改变 了细胞膜的通透性，引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。 谷氨酸高产菌株丧失或仅有微弱的a-酮戊二酸脱氢酶活
日本在谷氨酸发酵生产方面居世界领先地位。味 之素、协和等均是其中代表。我国发展也比较快， 如河南的莲花味精公司，目前味精产量已从1983 年的400吨上升到2010年的62万吨，单厂味精产 量居世界第一位，国内市场占有率达43%；（广 西的荷花味精）等。
谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大 生长需要量300多倍的谷氨酸，研究发现： 大量积累并非是当初设想的由于特异代 谢途径导致，而是：
目前，我国柠檬酸行业从产量上位居世界第 一，从技术上，在国际上也是处于世界领先水平， 并远远领先于其他国家，其优势在于：
1.我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双 重功能，当淀粉原料被液化后，即可进行发酵， 不需要将淀粉水解成葡萄糖，简化了生产工艺， 降低了生产成本。
2.尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有 64小时，生产周期比国外的单边发酵周期还要短。
微生物的代谢产物很多，主要有乙醇、丙 酮、乳酸、氨基酸、酶制剂、抗生素等， 在这些产物中，乙醇、丙酮、乳酸等，微 生物可以在特定的外部环境下生成，这类
发酵我们称之为：自然发酵。
而有些产物诸如：氨基酸、酶制剂等，正 常的微生物是不能在培养基中大量的合成 与积累，是需要通过：化学的、物理的、 生物的等方法人为的改变其原来的代谢途 径，使之能够分泌并积累特定的产物，这
柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是 生物体主要代谢产物之一。
1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体； 1913年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。
柠檬酸及其盐类、酯类和衍生物是食品工业、药 物、美容化妆品等生产的重要原料；在工业生产 中有着广泛的用途。
我国柠檬酸发酵技术处于世界领先水平。如安徽 丰原生化公司，柠檬酸生产能力达18万吨，居世 界第一位，占世界柠檬酸生产额的17％。
参与蛋白
乙酰辅酶A 质合成
12
柠檬酸
3
顺乌头酸16 衣康酸
乙醛酸
3
11
异柠檬酸
4
草酰琥珀酸
琥珀酰辅酶A
5
6
α－酮戊二酸 15 谷氨酸
TCA循环与乙醛酸循环
参与蛋白 质合成
葡萄糖
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸
磷酸烯醇 式丙酮酸 羧化酶
实现柠檬酸积 累：
一、设法阻断代谢 途径，实现柠檬酸 的积累
二、代谢途径被阻 断部位之后的产物， 必须有适当的补充 机制
2ADP
⑺
2ADP
磷酸烯醇式丙酮酸 ⑼
2-磷酸甘油酸
3-磷酸甘油酸 2ATP
2H2O
糖酵解和酒精发酵的全过程
三、酒精发酵中的副产物 主产物：乙醇、CO2； 酵母菌酒精发酵 醇类（杂醇油） 醛类（糠醛） 副产物40多种 酸类（琥珀酸） 酯类
1.杂醇油的形成途径： ①氨基酸氧化脱氨作用； ②由葡萄糖直接形成：葡萄糖→α-酮酸→高级α酮酸 高级醇 ③正丙醇的形成：苏氨酸→α-氨基-2丁烯酸→α丁酮酸→醛→正丙醇
①代谢调节控制；
②细胞膜通透性的特异调节；
③发酵条件的适合；
发酵机制
谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖 经EMP途径或HMP途经生成丙酮酸，再氧 化成乙酰辅酶A，然后进入TCA，再通过乙 醛酸循环、CO2固定作用，生成a-酮戊二酸， a-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有 NH4+存在的条件下生成谷氨酸
酒精发酵机制 一、酒精生成机制
二、巴斯德效应
在好气条件下，酵母菌发酵能力下降（细胞内糖代谢降低，乙醇 积累减少）；不仅存在于酵母中，也存在于具有呼吸和发酵能力 的其他细胞中。－－－－巴斯德效应
关于巴斯德效应的机制：已经证实其第一个调节点是磷酸果糖激 酶。
在好气条件下，糖代谢进入TCA循环→柠檬酸↑、ATP↑ 抑制磷酸