氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷

氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷

一、采样与样品预处理（同微生物生物量碳）

土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。

二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE）

1、方法原理

土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的磷大幅度增加。通过测定浸提液中磷的增加量，估算土壤微生物量磷。浸提液中磷用钼锑抗比色法测定。

2、仪器及设备

培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；分光光度计3、试剂

1.无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液

[ϕ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。（试剂浓硫酸ϕ(H2SO4)=95~98% ，稀释19倍）

2.0.5mol/L NaHCO3：42.0g NaHCO3(化学纯)溶于800mL水中，用0.5mol/L NaOH调节溶

液的pH至8.5，用去离子水稀释至1L。溶液贮存于塑料瓶中。长时间放置，使用前必须检验pH值。

3.钼锑抗试剂：称取酒石酸锑钾0.5g，溶解于100mL水中，制成0.5%的溶液。另称取

钼酸铵10g，溶于450mL水中，徐徐加入153mL浓H2SO4，边加边搅。再将0.5%的酒石酸锑钾溶液加入到钼酸铵溶液中，最后加水至1L，充分摇匀，贮存于棕色瓶中。

临用前（当天），称取左旋抗坏血酸1.5克（Vc，三级），溶解于100mL钼锑贮备液中，此溶液有效期为24h。

4.磷标准溶液：准确称取在105℃烘箱中烘干的KH2PO4(分析纯)0.4394g，溶解在400mL

水中，加浓H2SO45mL（防止发霉），转入1L容量瓶中，定容，摇匀。此溶液为100mg/L

P标准溶液，在4℃冰箱中可长期贮存。

吸取磷标准溶液5mL，稀释至100mL，即为5mg/L P标准溶液（不宜久存）。

5. 250ug/mL KH2PO4：0.5492 g KH2PO4-定容至 500ml 水；0.10984 g定容至100 ml。

6.硫酸溶液（2.5 mol L-1）：量取70.0 ml分析纯浓硫酸，稀释至500 ml。

7.1mol L-1 NaOH：称取40 g分析纯氢氧化钠，溶于1 L蒸馏水中。

8.2,6 二硝基酚指示剂：称取0.2 g指示剂溶于100ml水中。

4、操作步骤

4.1薰蒸

称取相当于5.0g烘干土重的湿润土壤3份，分别放在约100 mL的烧杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度，同时放入一个装有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min。关闭干燥器的阀门，在25o C的黑暗条件下放置24h。

打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行薰蒸处理。

当干燥器不漏气时，取出装有水、碱液和氯仿的烧杯，氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部，用真空泵反复抽气，每一次都要打开干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤闻不到氯仿气味为止。

薰蒸开始的同时，称取等量土壤3份，用NaHCO3溶液(见下一步骤，试剂2)浸提，同时做不加土壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置1周，4℃下放置1个月或在-15o C 下保存。

4.2浸提

薰蒸结束后，将土壤全部转移到250 mL的震荡瓶中，加入80mL0.5mol/L NaHCO3溶液，在振荡机上振荡浸提30min（25℃，185rev/min）,用无磷滤纸过滤。

薰蒸开始的同时，称取等量土壤3份，同上用0.5mol/L NaHCO3 80 mL溶液浸提，同时做不加土壤为空白对照。浸提液立即测定或在-15o C下保存。

P回收率测定

另取等量土壤3份，加入0.5 mL 250ug/mL KH2PO4（50ugP/g土），同上加入80 mL0.5mol/L NaHCO3溶液浸提，浸提液在室温下可以放置1周，4℃下放置1个月或在-15o C下保存。

4.3测定

吸取土壤浸提液25 mL（根据土壤含磷量进行调整）于50mL容量瓶中.

调解pH：加2,6-二硝基苯酚1-2滴，用3mol/L的硫酸把溶液调至无色。回滴用 1mol/L

的NaoH溶液。

缓缓加入钼锑抗溶液5mL（试剂3），边加边轻轻摇动（防止溶液溢出），全部排除溶液中的CO2。加去离子水定容。静置0.5h后（如果温度太低，显色比较缓慢，可以在水浴中加热），用分光光度计在880nm波长下比色。

标准曲线绘制：分别准确吸取5mg/L 磷标准溶液（试剂4）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 于50mL 容量瓶中，再加入NaHCO3溶液(试剂2)10 mL。调pH(同4.3上)。加入钼锑抗溶液5mL，静置0.5h比色。

4.4 测定土壤含水量：

称5.00g 上述湿润土壤，放在铝盒中，在105℃烘箱中烘8h，然后称其干重。（三个平行）。

5、结果计算

1.熏蒸和未熏蒸浸提的磷量（mg/kg）

P(mg/kg) =显色液P（mg/kg）×显色液体积×ts/DW

式中：显色液P（mg/kg）−−标准曲线中查得显色液的P（mg/kg）数；

显色液体积−−50mL；

ts −−分取倍数（浸提液总体积/吸取浸提液体积）

DW −−土壤的烘干质量，g。

2.生物量磷（Bp）的计算

Bp=(F-UF)/(Kp×R)

式中：F−−熏蒸浸提的磷量（mg/kg）；

UF−−未熏蒸浸提的磷量（mg/kg）；

Kp−−浸提液微生物生物量磷占总微生物生物量磷的比例，为0.4； R(%)−−加入无机磷的回收率。

R(%)=[ (测定值-土壤可溶性无机磷)/25)×100%

测定值−−土壤加入K2HPO4溶液后，再浸提所得到的磷（mg/kg）；

土壤可溶性无机磷−−未熏蒸浸提的磷量（mg/kg）；

25−−浸提前加入的磷量（mg/kg）。

（与林启美老师word文档内容一致）