基因转移及方法
生物学中的基因转移技术
生物学中的基因转移技术基因转移技术指的是将特定基因从一个生物体转移到另一个生物体的过程。
这项技术对于生物学研究和生产实践均有重要意义，可以用来治疗遗传性疾病、培育优良农作物和畜禽等，同时也引起了伦理和道德方面的争议。
本文将从基因转移技术的原理、应用和争议等方面进行探讨。
一、基因转移技术的原理基因转移技术通常分为两种方式：直接转移和间接转移。
直接转移是将外源基因利用载体（如病毒、质粒等）直接导入细胞，使其被转录和翻译。
而间接转移则是通过某些特定的现象将基因转移到目标生物体内，例如利用基因编辑技术改变DNA的序列，或者通过核酸递质等方式实现基因传递。
基因转移技术的实现需要多种技术手段的配合。
例如，需要使用基因工程技术构建质粒或病毒载体，将外源基因插入载体中并导入到目标细胞中。
同时还需要分子生物学、细胞生物学等多方面的知识和手段，保证转入的基因能够在细胞内正确表达，实现预期的功能。
基因转移技术的原理与方法非常复杂，其应用也十分广泛。
下面将从不同方面探讨基因转移技术的应用和争议等问题。
二、基因转移技术的应用1、治疗遗传疾病基因转移技术可以用于治疗许多遗传性疾病。
例如，一些癌症患者可能因体内基因发生突变而丧失对DNA损伤的反应能力，使得其免疫系统难以发挥作用。
科学家可以利用基因转移技术将这些缺陷基因进行修复，并将其移植到患者体内，从而帮助其重建免疫系统。
此外，还有各种其他类型的遗传疾病，例如血友病、囊性纤维化等等，均可通过基因转移技术进行治疗。
这些疾病的基因突变导致体内某些功能无法正常发挥，基因转移技术可以通过恢复或增强其功能来治疗患者。
2、培育优良种类基因转移技术可以对农业和畜牧业产生巨大的影响。
通过转移特定基因，可以培育出更具抗病性、生产力和保鲜性的作物和畜禽。
例如，基因工程技术已经成功应用于培育各种水果、蔬菜和谷类作物，比如晚熟型西瓜、抗虫蚜的卡蜜拉花菜等。
同时，基因转移技术也可以用于优化家禽、家畜的品种。
生物化学第十四章-基因重组和基因工程
第十四章基因重组和基因工程一、自然界的基因转移和重组：基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
1．接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。
2．转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
3．整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。
整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。
来源于宿主DNA的基因称为转导基因。
4．转座：转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。
这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。
⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。
当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。
其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。
⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。
免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。
基因转移与重组概述
染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就 越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。
Hfr ×F-杂交
3.F′×F-杂交——性导
Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游 离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。
3.性导——F′×F-杂交
初
生
F′
F′×F-与F+×F-的不同点：
F因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细 胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上
（三）接合
F因子的四种细胞形式（掌握）
①F-菌株(“雌性”菌株)：不含F因子，无性菌毛，但可以 通过接合作用接收F因子而变成F+菌株。 ②F+菌株(“雄性”菌株)：F因子独立存在，细胞表面有性
菌毛。 ③Hfr菌株：F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性 菌
溶源转变特点
1. 噬菌体不携带任何供体菌的基因； 2. 噬菌体是完整的，而不是缺陷的； 3. 噬菌体基因的整合到宿主染色体上导致宿 主获得新性状，未通过基因重组而形成的稳 定转导子； 4. 宿主获得新性状具有不稳定性。
（三）接合(conjugation)
通过细胞与细胞的直 接接触而产生的遗传信 息的转移和重组过程。
（一）转化
供体菌
DNA片段
受体菌
转化子（transformant）：转化后的受体
感受态
来自Trp+细胞的DNA
色氨酸缺陷型 没有色氨酸野生型生长
在缺乏色氨 酸培养基上 有菌落产生 （野生型）
自然转化的必要条件
1、建立感受态的受体细胞 感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞。 自然感受态：细胞一定生长阶段的生理特性，受自 身的基因控制（感受态因子）。 人工感受态：通过人为诱导，使细胞具有摄取DNA 的能力，或将DNA导入细胞内。
基因转移技术
影响DEAE-葡聚糖的转染效率的主要因素：细胞的数 量、DNA的浓度和DEAE-葡聚糖的浓度最为重要。大 体说来，按每个直径10cm的培养皿中加入 1～10ug的 转染DNA，并使用每毫升培养基含100～400ug DEAE-葡聚糖的溶液，对于绝大多数类型的细胞，都 能得到很好的转染效率。由于DEAE-葡聚糖对有些细 胞具有毒性，因此用低浓度溶液作短时间的接触反类是将目的基因转导入体外培养的细胞或导入从 体内取出的细胞，观察目的基因在细胞中的表达，这 项技术称基因转染(gene transfection )技术。通常情 况下，该技术转入的目的基因不与细胞染色体发生整 合，而是在细胞质呈现暂时性表达，随时间推移而逐 渐减弱或消失。为了使目的基因进入细胞后能与细胞 基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，需用病毒 载体将目的基因导入细胞，并发生整合；
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在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将 TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面， 轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进 行复制，并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因 导入洋葱表皮细胞。现在，该技术已在烟草、 水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜 豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上 成功。
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它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方 法， 1.可直接用不含有原核载体DNA片段的外 源基因进行转移； 2.外源基因的长度不受限制, 可达100kb ； 3.实验周期相对比较短。
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二、电穿孔法(Electroporation)
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电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下 使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间 的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。几乎所 有类型的细胞，包括植物的原生质体、动物的初生细 胞，以及不能用其它方法(诸如磷酸钙或DEAE-葡聚糖 法)转染的细胞，都可以成功地使用电穿孔技术进行基 因转移。此项技术具有操作简便，基因转移效率高等 优点。
转基因方法
转基因方法一、基因枪法：1、综述：基因枪法又称为高速微弹法、微粒抢法、微粒轰击法，是由康奈尔大学的Sanford等于1987年首次研制出的火药引爆基因枪，并与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究出的一种基因转移的新方法。
1990年美国杜邦公司推出商品基因枪PDS-1000系统。
在此期间，高压放电、压缩气体驱动等各种基因枪相继出现，并都在重复的实践中得到改进和发展。
其改进的核心是粒子加速系统，以提高射弹的可控度，即粒子速度和射入的浓度等。
2、基本原理：其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。
微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。
根据基因枪的动力系统，可将它们分为三种类型：一类是以火药爆炸力为加速动力，其显著特征是塑料子弹和阻挡板。
塑料子弹前端载放已沉淀有DNA的钨金粉。
当火药爆炸时，塑料子弹带着钨金粉向下高速运动，至阻挡板时，塑料子弹被阻遏，而其前端的钨金粉粒子继续以高速向下运动，击中样品室的靶细胞。
其粒子的速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制，不能做到无级调整，可控度较低。
第二类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。
其工作原理是把载有DNA 的钨金粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴众着微水滴。
在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。
当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨金粒继续向下冲击射入细胞。
第三类是以高压放电为驱动力。
其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨金粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。
3、步骤：（1）微粒体的洗涤。
取60-100mg钨或金粉，溶于1ml无水乙醇中，用超声波振荡洗涤。
微粒体处理后可在密闭条件下室温贮存一周。
离心除去乙醇，密闭贮存于室温中，备用，保存时间不要超过一周。
（2）DNA微粒载体的制备。
基因转移的三种方式
基因转移的三种方式
基因转移是指将一个或多个基因从一种生物体中移植到另一种
生物体中，使得受体生物体也能表达新的基因。
基因转移有三种方式： 1. 体细胞核移植：这是一种将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中的技术。
这种方法已被用于动物的克隆，以便复制一个完整的动物。
在这种方法中，一个成熟细胞的核被提取，然后被移植到一个无核的细胞中。
这个受体细胞被激活，以便成为一个新的个体。
2. 病毒载体：这种方法利用病毒将基因载入目标细胞。
这种方法已被广泛用于研究和治疗人类疾病。
病毒可以被改造成携带目标基因，并将其引入人体细胞中。
这种方法可以用于治疗某些遗传性疾病，例如血友病和免疫缺陷病。
3. 基因枪：这种方法使用高速粒子束将DNA导入目标细胞。
这种方法已被用于转化植物和动物。
在这种方法中，基因被粒子束“发射”到目标细胞中。
这个过程被称为基因枪法，因为它使用的仪器类似于一把枪。
这些方法都具有独特的优点和限制，但它们都为基因转移提供了重要的工具和资源。
随着基因技术的不断发展，基因转移将继续为医学、农业和工业领域带来新的发展机会。
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细胞器基因转移的原理及应用
细胞器基因转移的原理及应用细胞器是细胞的一种重要器官，包括线粒体和叶绿体等。
细胞器中含有一些特殊的细胞器基因，这些基因对于细胞代谢和功能发挥着重要的作用。
然而，某些疾病或异常情况可能导致细胞器基因的突变和缺失，进而影响细胞功能。
因此，细胞器基因转移技术的出现对于研究细胞功能和治疗某些疾病具有重要意义。
一、细胞器基因转移的原理细胞器基因转移技术是指将来自同种或不同种细胞器的DNA 序列导入到目标细胞器中，进而改变细胞器的基因组成，以达到治疗或研究目的。
该技术可分为两种类型：1. 转染转染是指通过DNA载体将外源DNA序列导入到目标细胞中，进而改变细胞器的基因组成。
在细胞器基因转移技术中，将外源DNA序列构建在质粒或病毒载体上，通过与目标细胞的接触而转染细胞器。
质粒和病毒载体均可以携带DNA序列，并且具有一定的靶向性，可以选择性地将外源DNA序列导入到目标细胞器中，达到治疗或研究的目的。
2. 线粒体转移技术线粒体转移技术是指通过将包含正常线粒体DNA的成熟卵细胞核注射到受精卵中，进而使新生儿产生正常的线粒体DNA。
线粒体转移技术的出现极大地扩展了细胞器基因转移技术的应用范围，并且被广泛地应用于某些疾病的治疗中。
例如，某些神经肌肉疾病、失明等疾病都与线粒体DNA突变有关，通过线粒体转移技术可以治疗或预防这些疾病的发生。
二、细胞器基因转移的应用细胞器基因转移技术在生物科技领域应用广泛，其主要有以下几个方面：1. 研究细胞功能细胞器中含有一些重要的细胞器基因，这些基因对于细胞功能发挥着重要的作用。
通过细胞器基因转移技术，可以将外源DNA序列导入到目标细胞器中，改变细胞器的基因组成，从而研究该细胞器在细胞代谢和功能中的作用。
2. 治疗疾病细胞器基因转移技术主要应用于某些线粒体疾病的治疗中。
线粒体疾病是一类由于线粒体DNA突变导致的遗传性疾病，其特点是症状复杂、早发、严重。
通过线粒体转移技术，可以治疗或预防某些线粒体疾病的发生，为患者提供更好的治疗选择。
基因水平转移的评判方法和转移方式研究进展
2
二、基因水平转移的发现历程
1928年英国细菌学家Grifith发现，将非致死
性肺炎链球菌与加热杀死的致死性肺炎链球菌 一起注射到小鼠体内时，非致死性的肺炎链球 菌就成了致死性的。 Grifith猜想非致死性肺 炎链球菌从致死性肺炎链球菌中获得了一种转 化因子。 1944年，Avery等指出Grifith发现的转化因 子是DNA，也就是死去的细菌分解出的DNA 片段，这实际是发现最早的基因水平转移现象。
进化树分析法
碱基组成分析法
选择压力分析法
内含子分析法
特殊系列鉴定法
核苷酸编码偏向性分析法
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（一）、进化树分析法
在亲缘关系较近的物种间，它们的某个特 定基因的某一段序列相似性较高，一般可 以作为基因水平转移的初始证据，物种间 绝大部分基因进化关系与生物分类相符合， 只有少数发生水平转移的基因进化关系与 传统生物分类差异极大，因而进化树上进 化枝的排列就成了判断基因水平转移的重 要标准。
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Delorme等对前庭链球菌(Streptococcus
vestibularis)的几个等位基因以及基因组 特定座位分离情况进行分析, 认为唾液链 球菌(Streptococcus salivarius)和前庭链 球菌是不同的种, 唾液链球菌在某些座位 的多样性高于前庭链球菌, 表明后者是最 近才进化形成的。对其进行分析后发现, 它们之间在研究的9个座位中有3个发生了 基因水平转移。
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朱新宇对具有顶复合器门的原生动物
(Apicomplexan protozoa)的质体样细 胞器—Apicoplast的clpC基因进行分 析, 与该基因在其他质体和细菌中的同 源基因重建clpC基因的系统发生树, 结 果显示细菌伯氏疏螺旋体(Borrelia buigdorferi)基因组的clpC基因整合到 了质体样细胞器中, 发生了由细菌向质 体样细胞器的基因水平转移。
自然界的基因转移和重组
Holliday 中间体
（一）位点特异的重组 由整合酶催化，在两个DNA序列的
特异位点间发生的整合。 例如：噬菌体的整合酶识别噬菌体
DNA 和宿主染色体的特异靶位点，而 后发生的选择性整合。
（二）同源重组 发生在同源序列间的重组。同源
重组不依赖特异DNA序列，而依赖 同源性。
同源重组需要一些重组蛋白和酶。 如Rec A、B、C、D及DNA连接酶等。
一、接合作用（conjugation)
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至 另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。
二、转化作用（transformation)
通过自动获取或人为地供给外源DNA， 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
分离
DNA
RH 型 肺炎双球菌
（一）插入序列转座 插入序列（insertion sequences，IS）：
长750 ~ 1500bp 组成： 反向重复序列：9~41bp，位于两侧 转座酶编码基因：产物引起转座，位于中间 正向重复序列：4~12bp，位于反向重复序列
外侧，为插入序列所特有
转座酶基因
插入序列转座： 1. 保守性转座 从原位迁至新位 2. 复制性转座 插入序列复制后，一个复制本迁到 新位，另一个保留在原位。
SH 型 肺炎双球菌
三、转导作用（transduction) 当病毒从被感染的细胞（供体）
释放出来，再次感染另一细胞（受体） 时，发生在供体细胞与受体细胞之间
的DNA转移及基因重组。
四、转座（transposition) 大多数基因在基因组内的位置是固
定的，但有些基因可以从一个位置移动 到另一位置。这些可移动的 DNA序列包 括插入序列和转座子。由插入序列和转 座子介导的基因移位或重排称为转座。
基因工程中的基因转移技术及其应用
基因工程中的基因转移技术及其应用基因工程是一个在生物医学研究领域具有重要作用的领域。
基因工程通过对生物基因的修改、剪切和复制等技术手段，可以创造新的生物或制造新的物质，并为科学家深入了解生命的奥秘提供了契机。
其中，基因转移技术是主要的技术之一。
基因转移技术，是指将某种生物的基因片段或完整的基因序列转移到另一种生物体内的过程，此技术包括植物基因转移和动物基因转移两种。
植物基因转移植物基因转移是指将想要的基因从一个植物体系中转移到另一个植物体系中。
植物基因转移的目的是改变特定植物体系的某种特性或是创建具有所需要的特性的植物体系，从而达到某种特定目的。
植物基因转移的步骤一般包括：（1）DNA序列预处理：利用酶切、聚合酶链反应（PCR）等方法拆分出所需要的DNA序列；（2）载体构建：制作带有所需基因的载体，采取不同的载体可以选择合适的表达系统；（3）载体转载：将转移载体注入目标受体植物体系的组织中；（4）筛选重组组织：将转移载体注入植物后，等待重组组织产生，利用抗生素、酵素等进行筛选；（5）重构的植株愈合并生长发育：将重组的植株从筛选出的组织中移植出来，针对它们进行呼吸、营养等方法的处理，促进重构植株的发育。
植物基因转移技术使得可以在无性繁殖的植物中快速创造出优秀利用价值或是适应特殊气候环境的新品种。
动物基因转移动物基因转移是指将某种生物体的基因片段或是完整的基因序列转移到另一种动物体内的过程。
动物基因转移通常使用微注射、基因转染、冷冻等方法进行。
能够应用动物基因转移技术的生物包括小鼠、果蝇、斑马鱼、火山灰蝇等。
动物基因转移最常见的两种技术是：1.基因敲除：利用基因敲除技术，切除目标基因，从而对某些生物的功能进行特定调控。
2.基因转导：基因转导也称转染或转化技术，将目的基因导入细胞内，从而实现对某些生物学过程进行特定调控。
动物基因转移技术目的并非简单地替代低生产性或低质量的基因。
它更多的是通过基因转移技术，更加了解人类疾病的发展过程，如何对某些疾病进行治疗等方面。
转基因的方法和原理（可编辑）
转基因的方法和原理转基因的方法和原理 1目的基因制备和载体系统 2几种有效的转基因方法 3定点突变和受体系统简介转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。
转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。
转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。
基本步骤 1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA 连接到能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞；4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；目的基因制备和载体系统目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。
载体：质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等 PCR反应 PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。
PCR要求反应体系具有以下条件： 1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物约20个碱基左右； 2、具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶； 3、4种dNTP； 4、作为模板的目的DNA序列。
PCR反应可扩增出100～5000bp的目的基因。
PCR反应过程 1、变性，即将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；2、退火，将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对；3、延伸，将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。
反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。
利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有poly A这一结构特点，可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子，根据碱基配对原则，将其吸附，从真核细胞的总RNA中提取出来，再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。
转基因技术发展史
转基因技术发展史转基因技术是现代生物学技术的代表，其发展历程涵盖了许多关键的技术突破和里程碑。
以下是对转基因技术发展史的全面概述，主要从基因克隆技术、基因转移方法、基因表达调控、转基因生物安全性、转基因技术的应用领域、转基因技术的未来发展以及转基因技术的社会影响等方面进行阐述。
一、基因克隆技术基因克隆技术是转基因技术的基础，它使得科学家能够识别、分离和复制特定的基因。
该技术的出现，使得科学家可以精确地操作DNA，从而实现对生物体的遗传改良。
二、基因转移方法基因转移是实现转基因技术的关键步骤。
目前，已经发展出了多种有效的基因转移方法，如质粒转化、微注射、基因枪、农杆菌转化等。
这些方法的不断改进和优化，使得科学家能够更高效地将外源基因导入到生物体中。
三、基因表达调控基因表达调控是转基因技术的另一个重要组成部分。
通过调控外源基因的表达，科学家可以实现对生物体的遗传特性的精确控制。
这包括启动子的选择和改造、增强子和抑制子的应用等。
四、转基因生物安全性转基因生物的安全性是公众关注的焦点之一。
科学家在发展转基因技术的同时，也致力于评估转基因生物的安全性。
至今，大量的研究已经证明，经严格评估的转基因食品在安全性上与传统的育种技术没有显著差异。
五、转基因技术的应用领域转基因技术的应用领域非常广泛，涵盖了农业、医药、工业和基础研究等多个领域。
在农业方面，转基因技术被用于改善作物的抗性、产量和营养成分。
在医药方面，该技术被用于生产重组蛋白药物、基因治疗和疫苗等。
在工业方面，转基因技术被用于生产生物燃料、工业酶和化学品等。
此外，该技术在基础研究中也被广泛应用，如用于研究基因功能和生物进化等。
六、转基因技术的未来发展随着科技的不断进步，转基因技术也在不断发展。
未来，该技术有望在以下几个方面取得更大的突破：1）提高外源基因的表达水平；2）开发更加高效的基因转移方法；3）探索新的基因编辑技术；4）利用人工智能和大数据技术优化转基因作物的设计和改良等。
转基因方法
转基因方法一、基因枪法：1、综述：基因枪法又称为高速微弹法、微粒抢法、微粒轰击法，是由康奈尔大学的Sanford等于1987年首次研制出的火药引爆基因枪，并与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究出的一种基因转移的新方法。
1990年美国杜邦公司推出商品基因枪PDS-1000系统。
在此期间，高压放电、压缩气体驱动等各种基因枪相继出现，并都在重复的实践中得到改进和发展。
其改进的核心是粒子加速系统，以提高射弹的可控度，即粒子速度和射入的浓度等。
2、基本原理：其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。
微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。
根据基因枪的动力系统，可将它们分为三种类型：一类是以火药爆炸力为加速动力，其显著特征是塑料子弹和阻挡板。
塑料子弹前端载放已沉淀有DNA的钨金粉。
当火药爆炸时，塑料子弹带着钨金粉向下高速运动，至阻挡板时，塑料子弹被阻遏，而其前端的钨金粉粒子继续以高速向下运动，击中样品室的靶细胞。
其粒子的速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制，不能做到无级调整，可控度较低。
第二类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。
其工作原理是把载有DNA的钨金粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴众着微水滴。
在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。
当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨金粒继续向下冲击射入细胞。
第三类是以高压放电为驱动力。
其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨金粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。
3、步骤：（1）微粒体的洗涤。
取60-100mg钨或金粉，溶于1ml无水乙醇中，用超声波振荡洗涤。
微粒体处理后可在密闭条件下室温贮存一周。
离心除去乙醇，密闭贮存于室温中，备用，保存时间不要超过一周。
（2）DNA微粒载体的制备。
（3）靶外植体材料准备。
基因转移与重组的方式
基因转移与重组的方式基因转移与重组是当前生物科技领域的一个热门话题。
在该领域内，研究人员常常探索基因组的结构和功能，以便更好地理解生命的本质和疾病的起因。
本文将通过分析基因转移与重组的方式，深入探讨这个主题。
一、基因转移的方式1. 细菌转化细菌转化是一种细菌利用外源DNA的方法，使其自身可以表达新的特征。
该方法的具体步骤为：将外源DNA转移到细菌的质粒中，随后，该DNA被内部的细菌酶切割成碎片，并与质粒结合成为新的DNA序列。
最后，细菌再次繁殖，其后代将具有这些新的特征。
细菌转化已经被广泛应用于研究与应用领域。
2. 病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移是一种向特定细胞或组织中转移特定基因的技术。
这种方法的实现需要特殊的病毒载体，即将外源DNA注入病毒中，然后通过病毒感染宿主细胞来实现基因转移。
该方法已被广泛应用于基因疗法领域，可用于治疗遗传疾病和癌症等重大疾病。
二、基因重组的方式1. PCR方法PCR法是将DNA序列复制许多次的方法。
该方法的可靠性和高度精准的结果，使其在基因重组和重组酶中经常被使用。
通过PCR法，科学家可以复制DNA的段，将它们与其他DNA片段结合，然后将它们插入到其他细胞中，从而实现基因重组。
2. 随机交换随机交换是一种利用DNA片段间的非同源配对的方法，将DNA片段粘合成新的DNA序列。
这种方法的效率很高，并且不需要特殊的重组酶。
然而，缺点是需要大量的操作和许多检测，使得该方法在某些方面不如PCR法效果好。
综合而言，基因转移与重组的方式有许多种，每种方式都有其优势和弱点，而最终会由其应用领域和实际需求来决定应该选择哪种方式。
对于产生的新颖性生物学特征，应重视新颖性及其可能带来的风险，并且应该检查所有的基因转移与重组活动，以确保它们的合法性。
基因的转移
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图 制备感受态E.coli的过程
* 培养大 肠杆菌
On ice 30 min 4℃离心 ℃ 收集菌 OD600至 0.3-0.4 用冰冷的 CaCl2重悬 冰冷CaCl2 冰冷 重悬 On ice 10 min 4℃离心 ℃ 收集菌 4℃离心 ℃ 收集菌 用冰冷的 CaCl2重悬
分装， 分装，-70 ℃ 冻存
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图 热休克法 heat shock
10ng重组 重组 DNA 冰上混合。摄入 冰上混合。 混合 静置10分 吸附DNA 静置 分 DNA 42ºC 1 吸附 钟 100µL感 µ 感 分钟 受态菌 10-100µL转 µ 转 化液涂含抗 菌素的平板 37℃震 ℃ 摇1小时 小时 加入1mL 加入 LB培养基 培养基
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3. 感受态假说
cacl2溶液制备感受态细胞的机制 假说1 假说 细菌的细胞壁局部溶解，质膜穿孔， 细菌的细胞壁局部溶解，质膜穿孔，让 外源DNA进入。 进入。 外源 进入 假说2 假说 细胞处于感受态时， 细胞处于感受态时，表面形成一种可接 的酶位点， 受DNA的酶位点，一旦细胞制备成感 的酶位点 受态细胞，就能稳定地摄取外源DNA 受态细胞，就能稳定地摄取外源 分子。 分子。
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（二） CaCl2制备感受态大肠杆菌
1. CaCl2的作用 的作用 改变细菌质膜通透性 允许DNA进入。 膜通透性， 进入。 改变细菌质膜通透性，允许 进入 2. 操作程序 挑单菌落置培养基中。 →挑单菌落置培养基中。 过夜培养， →过夜培养，至OD600=0.3 ~0.5 。 → 冰浴10 min。4℃离心，去培养液。 冰浴 ℃离心，去培养液。 冰冷的0.1molCaCl2 悬浮菌体。 悬浮菌体。 →冰冷的 冰浴10 →冰浴 min 。4℃离心，去培养液。 ℃离心，去培养液。 冰冷的0.1molCaCl2 重悬浮菌体。 重悬浮菌体。 →冰冷的 分装， 冻存。 →分装，-70 ℃冻存。
基因转移的三种方式
基因转移的三种方式基因转移是指将一种生物体中的基因转移到另一生物体中，以达到改变其遗传特征的目的。
基因转移的方式可以分为三种：自然转移、人工转移和非传代转移。
一、自然转移自然转移是指基因通过自然途径在生物体中传递的过程。
包括三种具体方式：1.1 细胞物质的直接接触在自然环境中，细菌和某些单细胞真核生物常常聚集在一起形成微生物群落。
当它们接触时，其中的一些细胞可以通过吞噬作用拿走其他细胞的部分细胞物质，包括DNA分子。
这些DNA分子可以被接受细胞吸收，被它们自己的DNA插入到新的位置，从而改变受体细胞的遗传特征。
1.2 病毒介导的转移病毒是一种寄生的微生物，可以侵入生物细胞并将自己的基因插入宿主细胞的DNA中。
在这个过程中，有些病毒也会带着宿主细胞的DNA一同复制到自己的基因组里面，从而发生基因交换。
这种方式常常是很严重的疾病的病因，例如艾滋病病毒可以通过类似的途径传递。
转座子是一种可以随意改变其定位的DNA段，它们能够在生物体的基因组中跳跃，从而改变基因序列。
这种跳跃可以是单个碱基对的改变，也可以是大片段的DNA片段的转移，甚至可以超过染色体层面，影响整个基因组的构成。
在自然环境中，转座子可以通过一些细胞器质体的介导在细胞中跳跃，从而影响细胞的基因表达。
二、人工转移人工转移是人类利用现代生物技术手段将基因转移到其他生物体中的过程。
它通常分为三种方式：人工基因转移使用病毒作为载体将所需的基因序列转移到细胞中。
在相应的基因序列中可以包含改变表达特征、增加药物代谢能力等人为需要的基因。
通过改造病毒的表面蛋白，使其更容易感染目标细胞，促进基因转移的效率，这种方式被广泛用于基因治疗和生物技术。
2.2 电穿孔技术电穿孔技术是指将电子或激光脉冲通过特殊的电极震荡散布在细胞内，形成一个微小的通道，使外来基因顺利地被导入细胞。
电穿孔通常使用在大量的细胞中，使其批量地将外源性DNA引入到系统细胞中。
这种方法适用于无法被病毒感染的细胞。
基因转移的四种方式
基因转移的四种方式基因转移是指将一种生物体的基因序列导入到另一种生物体中，从而改变其遗传特性的过程。
在现代生物技术的研究中，基因转移已经成为了一个重要的技术手段，可以用来改良作物、提高动物品质、治疗疾病等方面。
基因转移的方式有很多种，下面我们就来介绍一下基因转移的四种方式。
一、质粒转化法质粒转化法是一种常用的基因转移方法，它是利用化学方法将外源基因转移到受体细胞中。
具体来说，就是将所需的基因片段克隆到载体质粒中，再将质粒导入到受体细胞中，通过转化操作将质粒中的外源基因片段插入到受体细胞的染色体中，从而实现基因转移。
质粒转化法具有技术简单、转化效率高、基因稳定等优点，已经广泛应用于农业、医学等领域。
但是，质粒转化法存在一些局限性，如质粒大小受限、外源基因表达水平难以控制等问题。
二、病毒载体法病毒载体法是利用病毒作为载体将外源基因导入到宿主细胞中的一种基因转移方法。
具体来说，就是将所需的外源基因片段克隆到病毒载体中，再将病毒载体导入到宿主细胞中，病毒载体通过感染宿主细胞将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现基因转移。
病毒载体法具有转化效率高、基因表达稳定等优点，但是也存在一些缺点，如病毒感染后可能导致细胞死亡、病毒基因组的插入可能引起细胞突变等问题。
三、基因炮法基因炮法是利用高压气枪将外源基因片段直接送入宿主细胞中的一种基因转移方法。
具体来说，就是将所需的外源基因片段包裹在微小金属颗粒上，然后通过高压气枪将金属颗粒射入到宿主细胞中，金属颗粒与宿主细胞发生碰撞后将外源基因片段送入到宿主细胞的染色体中，从而实现基因转移。
基因炮法具有技术简单、能够转移大分子DNA等优点，但是也存在一些问题，如转化效率低、基因表达难以控制等问题。
四、基因修饰法基因修饰法是利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术对宿主细胞进行基因修饰的一种基因转移方法。
具体来说，就是通过编辑宿主细胞的染色体，将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现基因转移。
基因转移技术及其应用
基因转移技术及其应用随着科技的不断发展，人们对基因的深入研究和应用也越来越广泛。
基因转移技术是其中一项重要的研究方向，它将外源基因转移到目标细胞或生物体中，以实现某些特定功能的目的。
本文将从基因转移技术的基本原理、应用领域等方面介绍这一技术及其应用。
一、基因转移技术的基本原理基因转移技术是通过改变外源基因的DNA序列，将这些新基因引入细胞内并使其得以表达。
目前使用最广泛的基因转移技术是质粒转染法和病毒载体法。
1. 质粒转染法质粒转染法是将外源基因构建成质粒，通过一系列化学方法或电磁方法使其转移到目标细胞内。
质粒通常包含信使RNA和选择性标记，信使RNA含有所需表达的基因序列，而选择性标记则能标记含有转染质粒的细胞。
质粒转染法需要选择合适的转染剂，常见的有聚乙烯醇、二磷酸钙、脂质体等。
2. 病毒载体法病毒载体法是将外源基因构建成带有病毒序列的质粒，通过特定的病毒载体将其转移至目标细胞内。
病毒载体法具有相对高的转化效率，但也存在一定的安全隐患。
以上两种方法都可以实现基因转移，但其安全性和效率是需要注意的。
二、基因转移技术的应用领域1. 基因治疗基因治疗是基因转移技术最常见的应用之一。
它通过外源基因的转入，纠正或修复目标细胞中的异常基因，以达到治疗某些疾病的效果。
如常见的遗传性疾病、肿瘤等。
目前该技术的应用还处于初级阶段，但是发展前景广阔。
2. 基因工程基因工程是将制造、生产过程中需要的特定基因转入到特定生物中，以改善产品的性质和质量。
如基因工程食品就是通过基因转移技术将外源基因导入到作物中，改善其耐病性或营养价值。
可以大幅提升生产效率和品质。
3. 基因标记基因标记是通过基因转移技术向某个生物单元中加入一些可检测的或者可选的标记基因，使其成为特定的标记生物学试验。
如在生物物种鉴定、种源鉴定、遗传分析等领域。
4. 基因生物学研究基因转移技术在基因生物学方面的研究中也有广泛应用，在基因调节、细胞规模和表达研究、慢病毒等方面实现了很多突破。
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目的基因的用途
➢研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 调控
➢寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与 治疗
➢研究生物种系进化与相关同源性 ➢基因工程重组表达 ➢改造某些基因 ➢基因治疗
原理
➢ 原核目的基因获得：直接分离 ➢ 真核目的基因获得：
➢ 从cDNA 中组织细胞
↓温和破碎细胞 DNA片段与载体的连接包装
↓限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒 导入细胞
↓核酸杂交 筛选目的基因
人工合成目的基因片段
➢原理：DNA是由3’，5’-磷酸二酯键连接 ➢技术：DNA自动合成仪 ➢方法
➢ 化学合成法：固相 ➢ 酶促合成法：需模板 ➢ PCR
理
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质
提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析
制备mRNA ↓反转录 合成cDNA第一链 ↓置换法；外加引物法 合成cDNA第二链 ↓加接头，插入载体 重组D法
原理：2’，3’ddNTP与dNTP不同之处在于脱氧核糖 的3’ 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶 作用下通过其5’ 三磷酸基团掺入到DNA链中，但 不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，DNA链就不 可能继续延伸。这样，合成时在4种dNTP中加入 少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但十 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核 苷酸链，长度取决于从用以起始DNA合成的引物 末端到出现链终止位置之间的距离。在4组独立的 酶反应中分别采用4种不同ddNTP，结果将产生4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、 T、C、G位置上。
DNA 模板 (为第一轮聚合链反应产物经电泳纯化后混合)
引 物 A 突变区
3' 半分子
5' 半分子 5' EcoR Ⅰ
引物 B
突变区 H-mTNF-cDNA
3' BamH Ⅰ
工程菌构建
cIts4830
P L启动子
SD序列
Ampr
pBL
EcoR I, BamH I 双酶切 Ori
EcoR I
多克隆位点
基因工程方案 ： 分 、切 、接 、转 、筛
➢ 一 、分：目的基因的分离：从cDNA平端切口；粘端 切口
➢ 三 、接：把载体和目的基因连接成重组体：DNA 连接酶；“ 尾接法”；“ 人工连接器”
➢ 四 、转：重组体的转化
➢ 五 、筛：DNA 重组体筛选与鉴定：表型 ， DNA 限制酶酶切图谱, 核酸杂交 , 表达产物鉴 定等 。
第一轮聚合链反应
DNA 模板(pUC19- TNF 用Hind Ⅲ切后)
引物A
TNFcDNA
DNA 模板(pUC19- TNF用HindⅢ切后) TNFcDNA 引物 D
5' Hind Ⅲ 引物 C
3' Hind Ⅲ 5' Hind Ⅲ
引物 B 3' Hind Ⅲ
5'半分子
突变区
突变区
3' 半分子
第二轮聚合源于mRNA，反转录合成 双链cDNA，分别插入载体形成重组DNA 的集合体，导入宿主以扩增。
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质
提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析
制备mRNA ↓反转录 合成cDNA第一链 ↓置换法；外加引物法 合成cDNA第二链 ↓加接头，插入载体 重组DNA ↓导入宿主扩增
BamH I
T1
H-mTNF -cDNA
T2 EcoR I
BamH I
T4连接酶连接
PL 启动子 EcoR I
SD序
列
mTNF-cDNA
Amp r pBL-h-mTNF
BamH I T1
T2
Ori
切、接、转
目的基因序列测定
➢意义：前提；依据 ➢方法：酶促反应法（酶法）；化学裂解法
（化学法） ➢技术基础：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；标
方法： M 13，ddNTP法
➢ 步骤 ：
➢ 1.待测定 DNA 插入双链 M 13 复制型 DNA 中
➢ 2.菌体中扩增，提取单链 M 13 DNA ➢ 3.按待测 DNA 3’端前方的互补序列人工合成
➢ 自动测序仪：荧光标记
化学法——Maxam－Gilbert DNA 化学降解法
➢ 原理：一个末端标记的DNA片段在5组互相独立 的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反 应特异地针对于某种或某一类碱基。因此生成5组 放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末 端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中 均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组 反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此 后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离， 再通过放射自显影来检测末端标记的分子。
➢缺点：重复序列无法处理
嵌套缺失法
原理：核酸外切酶匀速消化DNA 步骤： 构建含目的序列测序载体
↓ 线性化DNA，形成3’突出端
↓ 核酸外切酶Ⅲ消化不同时间
↓ S1酶成平端
↓ 重新环化，分别测序，拼接
小结——分：目的基因的分离
➢目的基因的概念 ➢分离方法：基因；c DNA ；人工合成 ➢Sanger双脱氧链终止法基因序列测定原理 ➢长链（全基因）测序——嵌套缺失法的原
反转录合成cDNA
➢合成cDNA第一链：反转录酶 ➢合成cDNA第二链：
➢置换合成法：RNaseH；DNA聚合酶Ⅰ； T4DNA连接酶
➢外加cDNA与载体相连 ➢导入宿主细胞进行克隆
筛选目的基因
➢核酸杂交法：探针 ➢免疫结合法：抗体 ➢其他方法：双杂交；基因芯片
分——目的基因的分离
目的基因的获得及方法
➢目的基因概念 ➢PCR扩增 ➢其他方法：差异显示，基因陷阱
目的基因的概念
➢基因是DNA分子上含特定遗传信息的核酸 序列的总称，是遗传物质的最小功能单 位。
➢目的基因：对基因组中某个基因通过克隆 扩增，获得该基因以进行研究或应用，称 mRNA丰富，目的基因表达活跃 ➢ 注意点：防止RNA酶污染 ➢ 10-5μg/细胞，80~85%为rRNA，15%小分子量
RNA（tRNA等）1-5%mRNA，28S：18S=2： 1 ➢ 提取总RNA ：常规方法；Trizon ➢ 提取纯化脱氧链终止法
原理：2’，3’ddNTP与dNTP不同之处在于脱氧核糖 的3’ 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶 作用下通过其5’ 三磷酸基团掺入到DNA链中，但 不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，DNA链就不 可能继续延伸。这样，合成时在4种dNTP中加入 少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但十 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的 核苷酸链，长度取决于从用以起始DNA合成的引 物末端到出现链终止位置之间的距离。在4组独立 的酶反应中分别采用4种不同ddNTP，结果将产生 4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个 A、T、C、G位置上。
➢ 优点：高保真
测序策略
➢确证性测序：突变体验证 ➢从头测序：长链DNA ➢方法：
➢ 随机法（或鸟枪测序法） ➢ 定向法
➢嵌套缺失法：酶解均匀变短（核酸外切酶Ⅲ） ➢引物延伸法：测序↔合成引物
随机法（或鸟枪测序法）
➢原理：序列资料从含有靶DNA随机片段的 亚克隆中收集而来的。
➢流程：随机断裂（超声、核酸酶Ⅰ切割、 限制性内切酶切割）→亚克隆 →重叠排列 胞的分裂周期、 细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾 病的分子基础。
mRNA差示显示法获得目的基因
➢原理：一般15%基因表达，而且在不同状 态表达的基因是不同的
➢方法：PCR扩增（标记）→测序电泳→筛 选差异
➢优点：简便；灵敏度高；重复性好；多能 性；快速
选择原则
➢根据获得目的基因的目的选择方法 ➢根据目的基因本身特点选择方法 ➢根据实验室条件选择方法
基因定点突变