大鼠脊髓损伤BBB评分中文版

Western blot 试验操作步骤
一、蛋白样品制备
1 用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中
2 用4℃预冷的PBS 1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中
3 1000rpm，离心10min
4 倒掉上清，沉淀用1ml PBS 重悬，转入EP管中，再加1ml PBS冲洗离心管壁上残留的细
胞转入EP管中
5 4℃，4000rpm，离心5min
6 倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净）
7 配制裂解液，计算所需用量，每个EP管中加入100ul裂解液(10mg组织/100ul)
若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度100mM，用RIPA稀释至1Mm. 【单去污剂裂解液（PMSF）：1mol/L Tris·HCl（pH8.0）2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ;
蒸馏水至50ml; 混匀后4℃保存】
8 4℃裂解30-45min，每5min振荡一次
9 4℃ 14000g 离心5min，取上清（移入1.5ml的EP管中）。

10 蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明）
每管蛋白一致，分装约20ul/管左右（加入5×buffer并用RIPA稀释成1×）
11 将蛋白样100℃，变性5min，，-80℃（or -20℃）保存。

二、SDS-PAGE的配制：
1 试剂及配制：
（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g，去离子水至100ml，过滤，避光，4℃贮存。

（2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。

（3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）：称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。

（4）10%SDS：1g SDS加入10ml去离子水，室温贮存。

（5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵加入1ml水，4℃保存，现用现配。

（6）TEMED（可购买成品）
（7）5×电泳缓冲液(Tank buffer)：称取15.14g Tris碱(分析纯)，72.1g甘氨酸(分析纯)，5g SDS(分析纯)，加适量的超纯水溶解，pH值应该在8.3左右，加超纯水定容1000ml，室温储存。

（8）分离胶、浓缩胶液配方：（两个用小烧杯，用完立即刷）
总体积5ml 2ml 5ml
浓度12%分离胶5%浓缩胶10%分离胶
水(ml) 1.6 1.4 1.9
30%丙烯酰胺(ml) 2.0 0.33 1.7
1.5mmol/L Tris溶液(pH8.8)(ml) 1.3 — 1.3
1.0mmol/L Tris溶液(pH6.8)(ml) —0.25 —
10%SDS(ml)（透明）0.05 0.02 0.05
10%过硫酸铵溶液(ml) 0.05 0.02 0.05
TEMED(ml)（铺胶前加）0.002 0.002 0.002
2. 制胶程序：（小分子量）
（1）装板（小玻璃朝外）
（2）配制分离胶，加TEMED后，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，从一边开始，并为浓缩胶留足够空间（梳齿长约1cm）。

立即覆盖蒸馏水至顶部，天冷可放入烤箱15-20分钟，待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，避免气泡出现。

（3）待聚合后（约20分钟），拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽的前后槽，在加样孔中加入10-20ul样品（蛋白量20ug左右）。

左侧第一孔加maker，样品不够可用laoding buffer。

电泳：接通电源，浓缩胶80伏约半小时，此后分离胶120/160伏继续1小时左右。

三、转膜：
1、转移缓冲液的配制：（先用先配）
试剂用量
甘氨酸14.413g
Tris碱 3.0285g
无水甲醇40-200ml（蛋白量150以上加40）
水至1000
2、转膜程序：
（1）剪4张滤纸，和一张PVDF膜，大小与凝胶相同（滤纸要比胶小，膜稍大以防转膜时发生短路）。

在膜的一角做一记号（或剪角）。

（2）将剪好的膜依次序浸入100%甲醇（10秒）→去离子水（5min）→转移缓冲液（大于10min）。

（3）滤纸和海绵（纤维）垫浸入转移缓冲液中（大于10min）
（4）剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。

（5）安装转膜装置：从正极（红色）→负极（黑色）依次为：白色边盒→多孔垫片→（1~2张）滤纸→PVDF膜→凝胶→（1~2张）滤纸→多孔垫片→黑色边盒。

扣上吊扣后插进转膜槽中。

转膜槽内加冰盒，防止电泳时过热。

（6）接通电源：恒流电转移两个小时，电流一般是100mA（视蛋白大小而定）。

（7）电泳结束后，关闭电源，将膜取出。

四、封闭及免疫反应
（一）试剂的配制：
1．5x TBS：（PH 7.5）用时稀释5倍
试剂1000ml用量
Tris-base 6.05g
NaCl 43.83g
去离子水至1000ml
2．1x TBST：1x TBS+0.05%Tween-20
试剂1000ml用量
Tween-20 0.5ml
1x TBS 1000ml
3．Blocking buffer：1x TBST+5% Dry Milk
试剂100ml用量
Dry Milk 5 g
1x TBST 100ml
（二）、免疫反应程序：
1.取膜（平头镊子，玻璃平皿），放入10ml Blocking buffer（封闭缓冲液），室温轻摇2h，或
4℃过夜。

2.一抗孵育，用TBST配制，1:1000（比例须看说明书，装入塑封袋中赶净气泡后用封口机
封口），室温摇床上孵育1h后4℃过夜。

用TBST室温洗膜10min×3次
3.二抗孵育。

用Tbst稀释，1:2000（比例须看说明书，方法同上），室温轻摇45min-2h。

4.用TBST洗膜10min×3次。

五、显影：
1 试剂
（1）超敏发光液（ECL）（A、B液等比混合）
（2）显影液：显影粉（按说明书配制）
（3）定影液：定影粉（按说明书配制）
2 显影程序
（1）发光液工作液的配制：等体积混合适量A液（200ul）和B液(200ul)，视膜大小而定，直接在保鲜膜上混合。

（2）显色反应：将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体（切勿接触膜的蛋白面），然后置于保鲜膜上，浸入并与发光液均匀充分地接触。

（3）压片检测：将膜固定于暗盒内（蛋白面朝胶片）。

暗盒内放入胶片，压片曝光。

（压片时间要摸索，15s-过夜）
（4）显影：胶片放入显影液，观察显影情况。

（时间视显影情况而定）
（5）定影：胶片放入定影液，2-10min。

流水冲洗，干燥保存
六、ECL膜再生
1 试剂
膜再生液：（500ml）SDS：10g ；Tris：3.62g （Tris 碱）；H2O：400ml 调PH值6.7；定容至500ml；加250μlβ-巯基乙醇。

2 膜再生程序：
（1）TBST洗膜10min×3次
（2）用时将膜浸在膜再生液中，60℃水浴30 min（摇床）
（3）TBST洗膜10min×3次
（4）封闭液封闭
BBB法脊髓损伤的行为学评分
评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。

将动物放置于平台上,观察记录其后肢的行走及肢体活动。

评分分三部分第一部分为0一7分,评判动物后肢各关节活动第二部分为8一13分,评判后肢的步态及协调功能第三部分为14一21分,评判运动中爪的精细动作,三项满分为21分.
定义：将动物放入一开口盆中，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。

0 无可观察到的后肢运动
1 1或2个后肢关节轻度活动，一般为髋关节/膝关节。

2 1个后肢关节大幅运动和另一关节轻度活动
3 2个后肢关节大幅运动
4 所有3个后肢关节轻度活动
5 2个后肢关节轻度运动和第3个关节大幅运动
6 2个后肢关节大幅运动，第3个关节轻度活动
7 所有3个后肢关节大幅运动
8 不负重摆动，或足底着地，但不负重
9 仅站立的时候足底负重或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行
10 偶见负重步行，但前、后肢不协调
11 由频繁到持续负重步行，但无前、后肢协调
12 由频繁到持续负重步行，偶见前、后肢协调
13 由频繁到持续负重步行，频繁前、后肢协调
14 持续协调足底步行，优势爪在刚触地和抬起时旋转
15频繁足底步行，持续前、后肢协调，偶尔足背侧步行
16 持续协调足底步态，当前肢向前时无或偶有伸趾，优势爪刚触地时平行
17 持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪触地时平行，抬起时旋转
18 持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行
19 持续协调足底步态，持续伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行
20 基本内容同18，尾在部分或全部观察期中下垂
21 基本内容同18，尾持续上翘，但躯体不稳。