分子生物学第九章DNA重组技术
DNA重组技术
5’---3‘外切酶活性
发挥生物学活性的条件
（1）DNA模板（可以是单链或双链） （2）带有3`-端游离羟基的引物链 （3）底物和激活剂 注：对双链DNA，当有dNTP存在时， 3`→5` 降解活性会被5`→3`方向的聚合活性所抑 制。 应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针
缺口
DNase I
限制性内切酶的切割方式
5‘侧切割 产生5’粘 端 3‘侧切割 产生3’粘 端 轴外切割 产生平端
II种类和活性
同功异源酶：来源不同但能识别和切 割同一位点的酶。又称同裂酶
同尾酶：识别序列不同，但产生相同粘性末 端的限制酶 酶的活性：酶对DNA水解程度单位： 指1μ g 纯的指定DNA在指定缓冲液中，于 37℃（最适温度更准确）酶解1 h完全酶解 DNA中所有同一限制性内切酶位点所需酶量
DNA聚合酶 I
DNA聚合酶 I
dNTP*
缺口
缺口平移法制备DNA分子探针
3b
Taq DNA聚合酶
显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性 90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ； 94℃ 反应 2 h残留活性40%。
应用： （1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。
二 工具酶1--限制性内切酶
指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部 分，具有识别双链DNA分子中的某种特 定核酸序列并由此切割DNA双链结构的 酶 类型：I，III型：由于识别位点并非严 格专一很少被应用 II型是DNA重组技术最为常用的工具酶
II型限制性内切酶的特点
识别位点严格专一 识别序列的碱基数一般为4，6，8个bp 识别位点经常是一种回文序列的DNA 仅需 Mg2+ 作催化反应辅助因子，能识别 双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA， 产生特异片段 种类繁多，应用广泛
分子生物学第九章DNA重组技术
四、限制性核酸内切酶的作用
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有 回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基 和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切 割的特异性不同，结果有三种不同的情况：
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以 Eoor 为例：
5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’ 3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'
非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝 白筛选lacI-lacZ’序列，和多克隆位点等。由此可构 建出两类λ噬菌体作载体；一类是插入型载体，可 将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容 许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即 可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。
三、动物病毒载体
Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白 质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别 序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要 ATP供给能量。
Ⅲ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成，仅需 Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切 断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常 在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而 言。
DNA连接酶
连接两个DNA分子或片段
多核苷酸激酶
催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端 标记探针
末端转移酶
在3’末端加入同质多聚物尾
SI核酸酶，绿豆核 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变
酸酶
为平端
DNA端酶Ⅰ
降解DNA，在双链DNA上产生随机切口
第二节 重组DNA载体
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
重组dna技术的基本过程
重组dna技术的基本过程
DNA重组技术是一种精密的科学技术，用于研究和设计生物体的基因，是分
子生物学研究的重要工具之一。
其基本过程包括把待改造基因从某族群中分离出来，结合另外一种特定的基因与之混合，使受体细胞能够接受和表达这些掺入的基因，最后进行检测验证，为改良后的生物体的表达提供了可靠的参照。
DNA重组技术的第一步就是选择和收集需要重组的基因。
一般选择一种有特
殊生物效用或表现的有用基因，另一种则是带有某种受体细胞表达机制的靶基因。
其中，靶基因负责携带和传输信息，而受体细胞负责把信息传递给其他细胞，激活基因表达。
然后，可以尝试使用不同的方法来将靶基因与有用基因进行混合，比如用酶联反应来重组基因，或者利用噬菌体法来进行DNA的交叉归并，经过这一步骤，不同的基因就可以完成混合合成组合。
最后，需要将重组的DNA带入到受体细胞中，这里需要使用到受精或体外转
化技术。
通常，科学家会将该细胞暴露于含有药物的生化培养基中，使其具有可接受外源DNA的能力，并继续将待重组的DNA和受体细胞混合，其中受体细胞只
接受含有重组激活基因的DNA，这样就可以把DNA重组合成植物或动物细胞。
最后，需要对新生成的重组体进行评价检测，以验证其中一些特殊性质，这也是DNA重组技术成功的根基。
总而言之，由于DNA重组技术的优势，如创造新的基因表达机理，修改基因
的功能，以及使用较少的原材料来实现重组，已经受到了广泛的应用，特别是在生物质料和医药研究领域。
而在生物制造和药物发现领域，它也是一个重要工具，可以解决很多实际问题。
DNA重组技术概述
一、重组DNA技术相关概念
（一）DNA克隆 克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,
DNA重组技术概述
路漫漫其悠远
少壮不努力，老大徒悲伤
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
基因表达的分子生物学基础
原核细胞的基因是由成 百上千个核苷酸对组成 的。组成基因的核苷酸 序列可以分为不同区段。 在基因表达的过程中， 不同区段所起的作用并 不相同。有的区段能够 转录为相应的信使RNA， 进而指导蛋白质的合成， 也就是说能够编码蛋白 质的区段叫做编码区。 有的区段不能转录为信 使RNA，也就是说不能 编码蛋白质的区段叫做 一个典型的原核细胞基因结构示意图 非编码区。
顺序称为回文结构（palindrome）。
识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或 八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、 平头或钝性末端、配伍末端。 。
５’ ３’
５’ ３’
３’５’ ５’ ３’
３’ ５’ ５’ ３’
３’ ５’
３’ ５’
(三)目的基因
目的基因：用来扩增作研究或生产某一 种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人 们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的 DNA(target DNA)。
1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证 明了DNA是遗传信息携带者。 2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人 提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质 自我复制的机制。 3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗 传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗 传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为 cDNA的制备奠定了基础。
DNA重组技术PPT课件
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史密斯在研究流感嗜血杆菌从噬菌体 P22接受DNA的机制时，于1968年发现了一 类新的限制酶，它们分别在特定部位切断 DNA分子，因此可用以研究DNA分子中核 苷酸的顺序和用于DNA重组技术。
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基因载体（简称载体）
主要是质粒和温和噬菌体（见转导）两类。
➢ 1952年，英国微生物遗传学家W．海斯和美国微生物遗传学家 J．莱德伯格等在首先认识到大肠杆菌的F因子是染色体外的遗 传因子。
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基因工程
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DNA重组技术发展简史
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重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究 • 限制性核酸内切酶（简称限制酶） • 基因载体（简称载体）。
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限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用
阿尔伯 Wemer Arber 瑞士生物学家 巴塞尔Biozentrum大学
DNA重组技术
徐纪茹
2011-03-01
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概述
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转化
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接合
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转 导
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融源性转换
DNA重组技术ppt课件
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
分子生物学技术之DNA重组技术
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•
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•
•大肠杆 菌 pSC101 质粒载体 示意图。
•
•是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种 严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒 的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。
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•
• 2、ColE1质粒载体
•第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生 具有粘性末端的小片段。
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•
•图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及
其酶切末端。
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•
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• 松弛型复制控制的多拷贝质粒。
• 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或 是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质 的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制， 细胞的生长也随之停止。
• 而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每
个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到
1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。
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•
•AmpR
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•
•优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。 不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外 源DNA片段，操作起来仍较为便利。
•具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择 记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增， 每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体 DNA的制备提供了极大的方便。
dna重组技术名词解释
DNA重组技术名词解释
DNA重组技术是一种利用分子生物学技术对DNA分子进行人工改造的方法。
下面是一些常见的相关术语解释：
•重组DNA（rDNA）：是通过将不同源的DNA分子在体外进行重新组合而获得的DNA分子。
重组DNA技术是DNA重组的基础，用于插入外源基因到目标生物体中。
•限制性内切酶（restriction enzyme）：是一类酶，能够识别DNA序列并在特定的位点上切割DNA链。
限制性内切酶在DNA重组中起到关键作用，用于切割DNA和插入外源DNA。
•载体（vector）：是DNA分子，在重组DNA技术中被用来携带外源基因并将其导入到目标生物体中。
常见的载体包括质粒、噬菌体等。
•基因克隆（gene cloning）：是利用重组DNA技术将目标基因复制多份，使得其在目标生物体中得以表达和传递。
基因克隆有助于研究基因功能、获得目标基因的大量表达产物等。
分子生物学中的DNA重组技术与应用
分子生物学中的DNA重组技术与应用DNA重组技术是分子生物学的一项重要技术手段，它通过对DNA分子的剪裁、重组、克隆等操作，实现了DNA分子的人工改造和设计。
随着分子生物学的发展，DNA重组技术越来越成熟，逐渐应用于生物工程、基因治疗、疫苗研究等方面。
本文将从技术原理、应用领域和发展趋势等方面谈谈分子生物学中的DNA重组技术。
一、技术原理DNA重组技术基于DNA分子的特性，利用酶切、连接、克隆等手段实现DNA分子的改造和设计。
其中最核心的技术是酶切和连接技术。
酶切技术利用酶的特异性剪切作用，将DNA分子剪成特定的片段，从而实现对DNA分子的定向切割。
连接技术则利用连接酶的作用，将两个不同的DNA片段连接在一起，实现新的DNA分子的构建。
这些手段可以实现DNA分子的全长或部分重组，从而改变其基本的生物学性质。
二、应用领域DNA重组技术已经被广泛应用于研究和应用领域，其中应用研究领域包括基因克隆、基因表达、基因工程等方面。
生物医药领域应用DNA重组技术已成为常规的技术手段，应用于基因治疗、疫苗研究、抗体工程等方面。
1. 基因克隆基因克隆是DNA重组技术最早和最为广泛应用的领域之一。
通过DNA引物的设计和PCR扩增技术，可以从DNA库中克隆出感兴趣的DNA分子。
通过引入一系列的酶切、连接等操作，可以将目标DNA分子构建成所需的分子。
2. 抗体工程抗体工程是近年来DNA重组技术的新热点。
通过克隆、改造、表达不同来源的抗体基因，可以获得多种高效且特异性的嵌合抗体。
这些抗体可以被广泛应用于生物学研究、临床诊断和治疗等领域。
3. 基因治疗基因治疗是DNA重组技术的另一个热门应用领域。
通过引入具有特定生物学功能的DNA分子，可以治疗多种遗传性和获得性疾病。
目前已经有多种基因治疗药物获得了FDA的批准。
4. 疫苗研究疫苗研究是利用DNA重组技术来克隆、表达和改造多种病原体蛋白的新领域。
通过此类技术可以获得高效、稳定和可控性的病毒样颗粒，这些病毒样颗粒可以用作疫苗制剂的候选物。
DNA重组技术分子生物学-图文
DNA重组技术分子生物学-图文第一章DNA重组技术讨论4个问题：1.什么是基因工程——基因工程的概念。
2.为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。
（包括3大理论和3大技术准备）3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）4.基因工程的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。
第一节概一.现代科学技术发展的特点述（一）科学技术加速发展和急剧变革1.当代科学发展成指数增长趋势，全世界发表科技论文6000－8000/天，平均1篇/10.8秒问世。
2.人类科技知识在19世纪半衰期是50年，现在是3－5年（终身教育学习）。
3.1973年，CohenGroup第一次实现了细菌遗传性状的转移terr+nerr→terrner，导致基因工程技术诞生，至今不到30年，人类已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。
（克隆羊多利1997－2003，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）tetrnerPclolRb-3rtetrnertetrOnertetrnerCohenGroup第一次实现了细菌遗传性状转移示意图一.现代科学技术发展的特点(二)科学技术发展的综合化1.19世纪中叶，科学和技术是二者分离的，它们各有独自文化传统，它们的发展往往是脱节的。
2.科学回答“是什么”“为什么”，技术回答“做什么”“怎么做”。
当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体现科学。
3.当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。
突破是线性的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有一代科技成果。
融合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。
二．基因工程的概念（一）基因（gene）：从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。
分子生物学教案-DNA重组及重组DNA技术
學習內容
一、自然界的基因轉移與基因重組
1．結合作用
2．轉化及轉導作用
3．轉座
4．基因重組
二、重組DNA技術
1．重組DNA技術相關的概念
2．重組DNA技術基本原理
三、重組DNA技術與醫學關係
1. 疾病基因的發現，發展新藥物
2. 基因診斷與治療
學習要求
一、熟悉自然界基因轉移及重組的方式。
結合、轉化及轉導、轉座、基因重組。
二、掌握重組DNA技術的相關概念，基本原理。
限制性內切酶概念及作用特點。
熟悉常用載體及特點。
目的基因的獲取及與載體連接的方法。
三、熟悉重組體的導入受體細胞及篩選方法。
基因克隆表達技術。
四、熟悉重組DNA技術在醫學中應用。
重组dna技术的主要步骤
重组dna技术的主要步骤
重组DNA技术，顾名思义就是利用先进的分子生物学技术，通过可重组DNA来改变生命体的基因组成，从而达到一定的治疗或者研究目的。
具体来说，重组DNA技术主要包括以下几个步骤：
1. DNA片段的制备
首先，需要从不同来源中提取目标DNA，包括人、动物、植物、细菌等等。
一般来说，利用DNA电泳和酶切等技术可将DNA分离和切割成不同大小的片段。
2. DNA片段的连接
将不同来源的DNA片段进行互相连接，使新的DNA构建成为完整的基因，这个过程中需要用到DNA连接酶。
3.外源DNA的插入
在DNA连接完成后，需要将新的DNA插入到宿主细胞中，一般采用电转化或者病毒载体等方法。
这样，就可以让宿主细胞在分裂生长中
继承新的基因组成。
4.筛选和鉴定
完成DNA插入后，需要对宿主细胞进行筛选和鉴定，以确认是否达到预期，例如涉及到治疗目的的，需要保证插入的新基因没有负面的作
用和反应，同时还需要对新基因的表达和功能进行一定的检测和评估。
总之，重组DNA技术是目前分子生物学领域中的一项重要技术，在治疗癌症、传染病等方面有着广泛的应用前景。
虽然存在着一定的道德
和伦理问题，但只要合理使用和监管，相信它将会成为人类健康和生
命发展的重要基石。
分子生物学课后习题答案
第一章绪论☐DNA重组技术和基因工程技术。
DNA重组技术又称基因工程技术，目的是将不同DNA片段（基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。
DNA重组技术有着广泛的应用前景。
首先，DNA重组技术可以用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体，提高产量，降低成本。
其次，DNA重组技术可以用于定向改造某些生物的基因结构，使他们所具有的特殊经济价值或功能成百上千倍的提高。
☐请简述现代分子生物学的研究内容。
1、DNA重组技术(基因工程)2、基因表达调控(核酸生物学)3、生物大分子结构功能(结构分子生物学)4、基因组、功能基因组与生物信息学研究第二章遗传的物质基础及基因与基因组结构☐核小体、DNA的半保留复制、转座子。
核小体是染色质的基本结构单位。
是由H2A、H2B、H3、H4各两分子生成八聚体和由大约200bp的DNA构成的。
核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一步。
DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。
因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。
转座子是存在染色体DNA上的可自主复制和移位的基本单位。
转座子分为两大类：插入序列和复合型转座子。
☐DNA的一、二、三级结构特征。
DNA的一级结构是指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。
DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。
分为左手螺旋和右手螺旋。
DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。
分子生物学原理：DNA重组和重组DNA
➢ 技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
目录
➢DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具 有 自 我 复 制 能 力 的 DNA 分 子 —— 复 制 子 (replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛 选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增 提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 重组DNA (recombinant DNA) 。
然分泌的蛋白----TAL effector，以及TAL效应核 酸酶
目录
近些年常见的基因编辑技术
➢ CRISPR/Cas9 规律成簇间隔短回文重复序列 细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的
获得性免疫防御机制
目录
四、原核细胞的多种基因转移方式
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互 接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转 移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接 合作用(conjugation)。
目录
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
基因片段
重组信号序列
➢ 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基 因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片 段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧 均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基 因rag (recombination activating gene)共有 两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。
分子生物学-DNA重组
分子生物学-DNA重组(总分：567.00，做题时间：90分钟)一、名词解释(总题数：22，分数：44.00)1.同源重组(homologous recombination)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(依赖于大范围的DNA同源序列的联会，联会的部分不受限制，重组可发生在联会部分的任何位置上。
在重组过程中，两条染色体或2个DNA分子相互交换对等的部分。
)解析：2.一般重组(general recombination)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(即非特异重组或同源重组。
)解析：3.位点特异性重组(site-specific recombination)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(在能识别特定的核苷酸序列的重组酶作用下，DNA分子间的重组。
重组分子间不一定要求碱基配对，即使是碱基配对也只有少数几个碱基形成异源双链体。
这种重组最初是从x噬菌体基因组进入和离开宿主菌染色体的途径中发现的。
)解析：4.转座重组(transposition recombination)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(重组发生在序列不相同的DNA分子间，在形成重组分子时往往依赖于DNA的复制而完成重组过程，而不依赖于DNA序列间的同源性。
重组DNA技术分子生物学
成的．与mRNA互补的DNA。 基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物
体整套遗传信息的所有DNA序列。
重组DNA技术分子生物学
(三)载体
一.表达载体(expression vector): 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多 肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二.克隆载体(Cloning vector): 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。
筛
筛选重组体
重组DNA技术分子生物学
分
总
目的基因 基因载体
体切Biblioteka 技 术路线接
重组体
转 筛
重组DNA技术分子生物学
表
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
重组DNA技术分子生物学
重组DNA技术分子生物学
第三节
重要的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
Hind Ⅲ
DNA重组技术PPT课件
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酶的切割可以有两种方式：即粘性末端和平末端
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端 的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸 的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
第二类(II型)限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶.
Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
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限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株 用d，即Hind。
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① 质粒/载体
质粒(Plasmid)基本概念 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
特别是在完成人类基因组测序计划后，DNA重组技术与其它技 术相结合，将为功能基因组的研究提供强大的技术支持；通 过此方法可以对单个或多个基因的功能进行研究；
结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产 品，如胰岛素、干扰素等药物以及疫苗等。
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在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而
言。
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四、限制性核酸内切酶的作用
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有 回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基 和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切 割的特异性不同，结果有三种不同的情况：
DNA连接酶
连接两个DNA分子或片段
多核苷酸激酶
催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端 标记探针
末端转移酶
在3’末端加入同质多聚物尾
SI核酸酶，绿豆核 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变
酸酶
为平端
DNA端酶Ⅰ
降解DN完A整，版课在件双ppt 链DNA上产生随机切口23
第二节 重组DNA载体
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二、限制性核酸内切酶的命名
按酶的来源的属、种名而定，取属名 的第一个字母与种名的头两个字母组成的 三个斜体字母作略语表示；如有株名，再 加上一个字母，其后再按发现的先后写上 罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株 （Haemophilus influenzae d）中先后分离 到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、 HindⅡ和HindⅢ。
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基因工程属于生物技术范畴，广义的生物技术指任 何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物 品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技 术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。一般认 为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工 程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术 的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术 的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生 物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。 生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细 胞融合技术最为突出。蛋白质工程则是在基因工程 基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学 辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开 创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新 时期，被称为第二代基因工程。
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以 Eoor 为例：
5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’
3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'
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②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例：
5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp OHG…3’
Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白 质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别
序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要 ATP供给能量。
Ⅲ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成，仅需
Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切
断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常
第九章 DNA重组技术
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对多数生物来说，基因本质是DNA，基 因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列 的重新组合和建造，所以基因工程的核 心就是人工的DNA重组（
重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才 有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。 纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克 隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。 所以DNA重组和分子克隆是与基因工程 密切不可分的，是基因工程技术的核心 和主要组成部分。重组DNA、分子克隆 甚至成了基因工程的代名词。
理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：
①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自 主复制能力。
②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。
③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主 细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的 限制性核酸内切酶位点。
④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组 操作。
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第一节 工具酶
一、限制性核酸内切酶的概念
核酸酶可分为两类：核酸外切酶是从核酸的一 端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切 酶则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸 链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并 将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异 的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切 断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲 基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基 化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异 的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细 胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身 的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信 息的稳定。
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三、限制性核酸内切酶的分类
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情 况不同，分为三类：
Ⅰ类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成，兼具 有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识 别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点 以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类 酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
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DNA重组技术中最常用的工具酶
酶
主要用途
限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链
DNA聚合酶Ⅰ 或 其大片段 （Klenow）
①缺口平移制作标记DNA探针 ②合成cDNA 的第二链 ③填补双链DNA3’凹端 ④DNA 序列分析
耐热DNA聚合酶 聚合酶链反应（PCR） （Taq DNA聚合酶
3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ 3’…GOH pACGTC…5
③产生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ为例：
5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGp OHCGA…3’
3’…AGC↑GCT…5’Nru Ⅰ3’…AGCOh pGCT…5’
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⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或 携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分 离出来。这才介于克隆操作。