第十六章 抗生素类药物的分析

四、抗生素药物的质量分析
㈠ 鉴别试验
1、官能团的显色反应－特殊基团的反应 2、光谱法－特征吸收 3、色谱法－保留行为 4、生物学方法－抗菌能力
㈡ 检查
1、影响产品稳定性的检查项目－水份、酸 碱度等
2、控制有机和无机杂质的检查项目
3、与临床安全性密切相关的检查项目－异 常毒性、热原等
4、其他检查项目－其他共存组分
◆ 低化学纯度－同系物多、异构体多、降解物多
◆ 活性组分的变异性－生产过程中条件的变化
◆ 稳定性差－不稳定性结构
二、抗生素类药物的分类
1、根据产生抗生素的生物来源分类： 2、根据抗生素的作用对象分类： 3、根据抗生素的作用机制分类：
二、抗生素类药物的分类
4、按化学结构分
β－内酰胺类抗生素(青霉素类、头孢菌素类)
缺点
操作繁琐、费时费力 误差较大
是结构复杂和多组分抗 生素效价测定的首先方 法
㈢ 含量或效价测定
2、物理化学法
HPLC
仪
器
LC-MS
分
析
UV
方
法
容量法
准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少
1、对结构已知或提纯的抗生素 2、需要标准品对照
㈢ 含量或效价测定
3、抗生素活性的表示方法
以效价单位表示，即指每mL或每mg中含 有某种抗生素的有效成分的多少。
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药物分析
第十六章 抗生素类药物的分析
Contents
1
概述
2 β-内酰胺类
3 氨基糖苷类
4 四环素类
5 高分子杂质检查
一、抗生素的定义及特点
是指“生物在其生命活动中产生的，能在 低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机 能的化学物质的总称”
1.聚合物 头孢他啶中聚合物测定
头孢他啶聚合物的测定 分子排阻色谱法
固定相：葡聚糖凝胶G-10 流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液 流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠 对照品溶液：头孢他啶对照品 100µg/ml
第二节 β–内酰胺类
CH2
H2C O
OH HO O O
CH2
HCOH
三、抗生素类药物的细菌耐药性
三、抗生素类药物的细菌耐药性
◆ 1、耐药性的种类
固有耐药性：天然耐药性，由细菌染色体基因决定 获得性耐药性：由于细菌与抗生素接触后，由质粒介导 ，通过该变自身的代谢途径，使其不被抗生素杀灭。
◆ 2、耐药的机制
（1）产生灭活酶，使抗菌药失活 如β-内酰胺酶 （2）抗菌药物作用靶位改变 （3）降低细菌外膜通透性 （4）影响主动流出系统
相对保留时间 1--被测物 2--标准物
r12
tR1 tR2
异构体 相对保留时间 判断
B异构体 0.85 供试液谱图中A异构体的峰面积
A异构体 1.0
与A、B异构体峰面积和之比应
为0.48~0.55。
异Βιβλιοθήκη Baidu体 B
头孢呋辛
异构体 A
3.头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法
固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四 烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干
第二节 β–内酰胺类
3.手性C （旋光性）
﹡﹡ 65
S
1
2
7 N 3﹡
O
4
4.UV
﹡ 7
﹡
6
S
12
O
8N 5
3 4
➢青霉素类：苯环取代基 ➢头孢菌素类：母核有共轭结构
260nm
青霉素的降解反应
H2O/OHˉ 青霉噻唑酸
青霉素酶
青
H2O
HgCl2
青霉酸
霉 pH2
100℃
素 NH2OH
α–青霉噻唑 酰基羟胺酸
展开剂：0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二 钠-丙酮（120：80：3）
供试液：本品 50mg/ml 对照液（1）：本品 0.5 mg/ml 对照液（2）：α-苯甘氨酸 0.5 mg/ml 对照液（3）：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml
结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（ 3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如 显其他杂质斑 点，与对照液（1）所显的主斑点比 较，其颜色不得更深。
第二节 β–内酰胺类
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具有6-APA母核的药物是 A．青霉素钠 B．硫酸庆大霉素 C．盐酸土霉素 D．盐酸四环素 E．头孢克洛
青霉素在pH =2条件下，易发生分子重排，其产物 是
A．青霉烯酸 B．青霉醛 C．青霉酸 D．青霉胺 E．青霉噻唑酸
CH2
O
HO
O
O
OH
O
O
H2C O
O CH2
HO
OH
O
CH2 O HCOH
CH2 O
OH CH2
O
HO O
H2C O
OH HO
OO CH2
HCOH
CH2
O CH2 O OH
HO O O
O
HO
O
OH
O
CH2
CH2
HCOH
O H2C OH
O
O HO OH
O H2C O
O H2C
HO
O HO
O CH2
HCOH
茚三酮
Δ
蓝紫色
第二节 β–内酰胺类
NH2
O
α
HO
C
+2
HO
H
O
OH
O
CN C
+
O
O
3）双缩脲反应——β–内酰胺类 碱性酒石酸铜
C O + 3 H2O
紫色
NH2
O H
HO C N
CH2 COHN
S
COONa CH3
CH3
CH2 NH2
CO H N
S
HO C N OH
Cu OH 2 CH3
CH3 COONa
四环素类抗生素(四环素、金霉素、土霉素)
抗
氨基糖苷类抗生素(链霉素、庆大霉素、依替米星)
生
大环内酯类抗生素(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素)
素 的
多烯大环类抗生素－(制霉菌素、两性霉素B)
分
多肽类抗生素 (多黏菌素、放线菌素)
类
酰胺醇类抗生素(氯霉素、甲砜霉素)
抗肿瘤类抗生素(丝裂霉素、盐酸多柔比星)
其他抗生素(盐酸克林霉素、磷霉素钙)
CH2 COHN O
S CH3
N
CH3
COOH
青霉素(苄青霉素)
(penicillins)
CH COHN NH2
O
S N
CH3
CH3 COOH
氨苄西林
HO
CH COHN
S CH3
NH2
N O
CH3 COOH
阿莫西林
第二节 β–内酰胺类
CH COHN NH2
O
头孢氨苄
S
N CH3
COOH
CH COHN NH2
O
S
N CH3
COOH
头孢拉定
HO
CH COHN
S
NH2
N
头孢羟氨苄
O
CH3
COOH
S
S
CH2 CONH
ON
头孢噻吩钠
C H 2OC OC H 3
COONa
第二节 β–内酰胺类
一、结构与性质
1. β–内酰胺环(四元环张力+酰胺键 )
干燥条件较稳定，溶液不稳定
青
霉
素
类 酸、碱 、 青霉素酶
某些氧化剂、金属离子、温度
(二)光谱法 UV
NMR
1、 UV法 样品、分解产物
光 谱 图,
max,
min,
E
1% 1cm
,
A
头孢氨苄 λmax = 262nm 青霉素V钠 A280nm/A264nm = 1.30～1.50
苯 唑 青 霉 素H 苯 唑 青 霉 烯 酸 A339nm Cu2+
第二节 β–内酰胺类
2、IR法 以阿莫西林为例
HCOH
HO CH2
O
HO O
O
H2C O
O H2C O
葡聚糖凝胶 立体网状结构图
原理——“分子筛”
1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用 1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；重复性用对 照品溶液、流动相B测定。 N不低于900，拖尾因子 0.75~1.5，峰面积的RSD应小于5.0% 2）测定方法
单峰信号
多重峰信号
多重峰信号
2：3
：
5
第二节 β–内酰胺类
(三)呈色反应 1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环
β–内酰 NH2OH·HCl 羟肟酸 Fe3+ 显色
胺类
NaOH
H+
S ON
S H 2N OH H C l O C N H
NHOH
2）茚三酮反应——α-氨基
S
O
C NH
NH
3+
Fe 3 O
（红、棕、褐）
第二节 β–内酰胺类
4）变色酸-硫酸反应
CH2 COHN O
HS2SOC4H 3
N Δ CH3
HCHO
COOK
变色酸
（缩合）
显 色
5）重氮苯磺酸反应——酚羟基
C 6 H 5 O H （重偶氮合苯 ）磺 酸 橙 黄 色
6）铜盐反应——头孢氨苄的专属反应
HA c Cu SO4 N a OH 橄 榄 绿 色
第二节 β–内酰胺类
7）硫酸-甲醛反应(BP)
氨 苄 西 林 水湿润 硫酸-甲醛 水浴加热 呈 暗 黄 色
青霉素钾和青霉素钠呈红棕色 (四)焰色反应——K+、Na+
焰色→鲜黄色
Na+ + 醋酸氧铀锌→↓黄
焰色→紫色
K+ + 0.1%四苯硼钠 →↓白
第二节 β–内酰胺类
三、有关物质与检查(聚合物、有关物质、异构体等)
CH2
O
HO
O
CH3 O
OH O
CH2 O OH
OH O
O CH2
HO O O
CH2 OH
CH2
HCOH
HCOH
CH2
HO O O OH O CH2
CH2
CH2 O OH HO
O
O
HO
OH
O
O
CH2
CH2
HCOH
CH2 O
OH HO O O
CH2
CH2
O
HO OH
O CH2 O
O CH2
OH HO
O
3180cm-1
N-H
β–内酰胺 C=O
1780cm-1
3470cm-1 O-H
1250cm-1 C-O
1690cm-1 仲酰胺C=O
第二节 β–内酰胺类
头孢利定的NMR鉴别法(JP16)
取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱 时，应显示
δ3.8 附近 δ6.9～7.5
δ7.9～9.0
测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释
至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤 过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克 拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸 0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中 C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。
阿莫西林克拉维酸钾片
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐
缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶 液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为 0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于 3.5
进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B 。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得 超过0.3%。
第二节 β–内酰胺类
✓ 主成分自身对照法 ✓ 面积归一化法 ✓ 限量法 ✓ 自身对照外标法
2 异构体：
头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查
固定相：ODS 流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38） 1）头孢呋辛酯Δ3-异构体的制备：头孢呋辛酯对 照品+流动相 头孢呋辛酯Δ3-异构体。 2）系统适用性试验：各异构体之间的R>1.5，以 头孢呋辛酯A异构体计算n>1500。
降 失
解 效
头
孢
菌
素
类
酸 、内碱酰 、胺胺 酶类
降 失
解 效
第二节 β–内酰胺类
2.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性
好，有机碱盐难溶于水。
CH2 COHN O
S CH3
N
CH3
COOK
CH2
C OH N O
S N
CH3
CH3 C OOH
NH2
普鲁卡因青霉素
C2H5 2 NCH2CH2OOC
㈢ 含量或效价测定
Potency:是指每ml或每mg中含有某种 抗生素有效成分的多少 U/mg
1、微生物检定法
比浊法 方法
管碟琼脂扩散法－抑菌圈
是以抗生素对微生物的杀伤或 抑制程度为指标来判断效价的 一种方法
㈢ 含量或效价测定
1、微生物检定法
灵敏度高、需用量少 适用范围广－纯品、不纯品、已知的和新的 优点 可一次测定同类型抗生素的总效价－无需分离纯化 与临床的应用要求一致
pH4
青霉烯酸
青霉醛 青霉胺
CO2
第二节 β–内酰胺类
二、Identification
(一)色谱法 HPLC (tR)
TLC (Rf)
1、TLC法
对 供
照 试
品 品相同条件
比
较R
f
和
斑
点
颜
色
2、 HPLC法
对 供
照 试
品 品相 同条件
比
较t
R
第二节 β–内酰胺类
二、Identification
IR
第二节 β–内酰胺类
3.UV 青霉素钠（钾）的吸收度检查： 供试液 1.80mg/ml， 结果判断：A280不得大于0.10
4.有机溶剂 第一法(偏光显微镜法)
5.结晶性 第二法(X射线粉末衍射法)
第二节 β–内酰胺类
四、Assay
碘量法 汞量法 酸碱滴定法 羟肟酸比色法
HPLC法
第二节 β–内酰胺类
效价用单位（U）或微克（μg）表示
第二节 β–内酰胺类
＊＊
氢化噻唑环
6-aminopenicillanic acid, 6-氨基青霉烷酸 简称6-APA
青霉素类
＊＊
7-aminocephalosporanic acid, 氢化噻嗪环 7-氨基头孢菌烷酸
简称7-ACA
头孢菌素类
第二节 β–内酰胺类