第13章流式细胞分析技术

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细菌学检验-13-流式细胞技术

液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点：多数字化适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点：分辨率高
选配多种波长和类型激光器
可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、准确、灵敏、定量

流式细胞技术在中医药治疗肿瘤研究中的应用

１流式细胞技术在现代医学研究中的应用
１４肿瘤疾病的诊断和血液系统疾病的撩查与分．型利用各种标本中细胞ＤＮＡ含量的测定，以可帮助诊断或鉴别良恶性肿瘤。免疫表型对于急性白血病的诊断、型、分预后判断、测微小残留病变及检预测复发具有重要的意义１５在血栓与止血研究中的应甩ＦＭ用于单个．ｃ或亚群血小板中的血小板糖蛋白（）ＧＰ的测定，于优
抑制治疗过程中免疫抑制剂和环孢素的用量，作并
为疗程的监控指标。
的物理、学特性的生物学研究方法。化其分析结果客
观，确，计学精度高，且具有快速、量、参准统而定多数等特点，已成为现代细胞生物学、疫学、免肿瘤学、血液学等领域不可缺少的研究手段。国自８我Ｏ年代初引进ＦＭ以来，生物医学领域得到了广泛的Ｃ在应用，越来越多地应用于中医药研究的领域。文且本仅就近年来ＦＭ在中医药治疗肿瘤系统疾病研究Ｃ领域中的应用做一回顾。
亚群的方法。１３组织配型与监控移植物的排斥反应．人体脏
２１单昧中药或中药有效成分对肿瘤细胞的影响．李贵新等采用流式细胞技术、ＴＣ等技术观ＲＰＲ察了淫羊藿甙（ａｒｎＩＡ，朝鲜淫羊藿中提取ｉｒｉ，Ｃ从ｃ的中药单体）人急性早幼粒白血病细胞ＨＬ．０的对６影响进行了观察，果显示：Ｃ在体外可诱导结ＩＡＨＩ６０凋亡，一并可下调相关基因ｂｌｃ一２和ｃｍｙ — ｃ基因ｍＲＮＡ蛋白的表达水平一毛海婷等应用流式细。胞术和荧光探针标记技术检测了淫羊藿甙对人高转移肺癌细胞膜的影响，结果表明淫羊藿甙可提高高

流式细胞法原理

流式细胞法原理
流式细胞法原理介绍如下：
流式细胞法是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。

这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。

流式细胞法的工作原理是在细胞分子水平上，通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。

这种方法利用标记有荧光染料的特异性单克隆抗体对细胞表面的抗原进行染色，使每个细胞都带有特定的荧光信号。

这些荧光信号可以反映出细胞的各种特性，如细胞表面抗原的表达量、细胞大小、颗粒度等。

通过高速流动的液流系统，这些细胞被逐一送入检测区域，被光电倍增管等检测器检测到。

根据这些参数，可以将不同性质的细胞分离开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。

此外，流式细胞仪通常以激光作为发光源。

经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。

这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。

通过对这些信号的测量和分析，可以获取细胞的多种参数，进而对细胞进行定性和定量分析。

总的来说，流式细胞法是一种高效、快速、准确的生物学技术，广泛应用于免疫学、肿瘤学、血液学、药理学等领域的研究和临床诊断。

流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征

流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速分析单个细胞的多参数特性的强大技术。

该技术通过标记特异性抗体与细胞表面或内部抗原的结合，结合流式细胞仪的高通量分析能力，使我们能够精确测量细胞群体的表型特征。

在生物医学研究中，流式细胞术广泛应用于细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、信号转导等多个领域。

本文旨在利用流式细胞术分析佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导人急性单核细胞白血病细胞系THP-1分化为巨噬细胞的表型特征。

我们将通过流式细胞术检测分化过程中细胞表面标志物的表达变化，如CDCD68等，以及细胞内分子如肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-1β等的表达情况，从而全面揭示PMA诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化的分子机制。

通过本文的研究，我们期望能够为深入理解巨噬细胞分化过程中的分子事件提供新的视角，并为开发针对巨噬细胞相关疾病的治疗策略提供理论依据。

本文还将探讨流式细胞术在细胞分化研究中的应用价值，以期为生物医学领域的研究人员提供有益的参考。

二、材料与方法1 细胞系：人单核细胞系THP-1，购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。

2 试剂：佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA），购自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗，购自Gibco公司；流式细胞术抗体，包括但不限于CDCDHLA-DR等，购自BD Biosciences或eBioscience公司。

3 仪器：流式细胞仪（如FACS Canto II，BD Biosciences）；二氧化碳培养箱；离心机；倒置显微镜。

1 细胞培养：THP-1细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2的条件下培养。

(完整版)细胞生物学知识点总结

细胞生物学目录第一章绪论第二章细胞生物的研究方法和技术第三章质膜的跨膜运输第四章细胞与环境的相互作用第五章细胞通讯第六章核糖体和核酶第七章线粒体和过氧化物酶体第八章叶绿体和光合作用第九章内质网，蛋白质分选，膜运输第十章细胞骨架，细胞运动第十一章细胞核和染色体第十二章细胞周期和细胞分裂第十三章胚胎发育和细胞分化第十四章细胞衰老和死亡第一章绪论1.原生质体：被质膜包裹在细胞内的所有的生活物质，包括细胞核和细胞质细胞质：细胞内除核以外的原生质，即细胞中细胞核以外和细胞膜以内的原生质部分原生质体：除去细胞壁的细胞2.结构域：生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域3.装配模型：模板组装，酶效应组装，自组装4.五级装配：第一级,小分子有机物的形成第二级，小分子有机物组装成生物大分子第三级,由生物大分子进一步组装成细胞的高级结构第四级,由生物大分子组装成具有空间结构和生物功能的细胞器第五级，由各种细胞器组装成完整细胞6.支原体：目前已知的最小的细胞第二章细胞生物的研究方法和技术1.显微镜技术：光镜标本制备技术、2.光镜标本制备技术步骤：样品固定、包埋与切片、染色3.电子显微镜种类：透射电子显微镜，扫描电镜，金属投影，冷冻断裂和冷冻石刻电镜，复染技术，扫描隧道显微镜4.细胞化学技术：酶细胞化学技术，免疫细胞化学技术，放射自显影5.细胞分选技术：流式细胞术6.分离技术：离心技术，层析技术，电泳技术第三章质膜的跨膜运输1.细胞功能：外界与通透性障碍，组织和功能定位，运输作用，细胞间通讯，信号检测2.膜化学组成：膜脂，膜糖，膜蛋白3.膜脂的三个种类：磷脂，糖脂，胆固醇4.脂质体用途：用作生物膜的研究模型，作为生物大分子与药物的运载体5.膜糖功能：细胞与环境的相互作用，接触抑制，信号转导，蛋白质分选，保护作用。

6.膜蛋白类型：整合蛋白，外周蛋白，脂锚定蛋白7.膜蛋白功能：运输蛋白，酶，连接蛋白，受体（信号接受和传递）8.不对称性的研究方法：冰冻断裂复型，冰冻蚀刻9.膜流动性研究方法：质膜融合，淋巴细胞的成斑成帽效应，荧光漂白恢复技术10.膜流动性的重要性：酶活性，信号转导，物质运输，能量转换，细胞周期11.影响膜脂流动性的因素：脂肪酸链，胆固醇，卵磷脂/鞘磷脂比值12.影响膜蛋白流动的因素：整合蛋白，膜骨架，细胞外基因，相邻细胞，细胞外配体、抗体、药物大分子13.膜骨架的主要蛋白：血影蛋白，肌动蛋白和原肌球蛋白，带4.1蛋白，锚定蛋白14.转运蛋白质包括：载体蛋白，通道蛋白15.协同运输的方向：同向协同，反向协同第四章细胞与环境的相互作用1.细胞表面结构：细胞外被、膜骨架、胞质溶胶2.细胞外被功能：连接，细胞保护，屏障3.糖萼：由细胞表面的碳水化合物形成的质膜保护层，又称为多糖包被。

流式细胞分析技术

ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成电脉冲信号。
14
滤光片
分色反光镜
15
PMT 滤光片
荧光和散射光检测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
16
数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型）量化成像分析流式细胞仪质谱流式细胞仪
单激发光；4个荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个荧光检测通道
Coulter EPICS XL
6
量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
11
经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或侧向散射光
样本流
前向散射光单个细胞流
12
液流系统形成单个细胞流示意图
13
光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜光束成形器；透镜滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本

流式细胞实验原理及应用

流式细胞实验原理及应用首先，样品准备是流式细胞实验的关键步骤之一、细胞需处于悬浮液中才能通过流式细胞仪。

样品准备包括细胞分离、洗涤和调整浓度等步骤。

通常，细胞样品从组织或培养物中分离，离心沉淀后经过洗涤去除细胞培养液中的残留物，最后将细胞悬浮于缓冲液中。

其次，细胞标记是流式细胞实验的核心步骤之一、在流式细胞实验中，细胞表面或内部的特定分子可以通过适当的标记物进行标记，以便在流式细胞仪中进行检测。

常用的细胞标记方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和利用特定的抗体与细胞表面受体结合等。

通过流式细胞实验，我们可以通过标记特定分子表达来研究细胞的功能、状态和变化。

最后，细胞检测是流式细胞实验的最后一步。

通过流式细胞仪，可以对标记的细胞进行检测和分析。

流式细胞仪通过激光束照射样品中的细胞，测量细胞发射的荧光信号和散射光等物理性质，从而获得与细胞特性有关的数据。

这些数据可以用于定量和定性分析，例如分析细胞表面标记物的表达水平、颗粒物的大小和形状等。

流式细胞实验在生命科学研究中有着广泛的应用。

它可以用于研究细胞的免疫表型，例如探究免疫细胞亚型的分布和功能状态。

同时，流式细胞实验还可用于分析细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖和细胞分化等生理过程。

此外，流式细胞实验还可应用于肿瘤学研究和临床诊断，如肿瘤细胞表面标记物的检测和癌症患者的免疫监测等。

总之，流式细胞实验是一种快速、准确的细胞检测和分析技术。

它通过针对特定分子的标记和仪器的测量，实现对单个细胞的定量和定性分析。

由于其高通量、高灵敏度和高特异性的特点，流式细胞实验被广泛应用于细胞学、免疫学、遗传学等领域，并为相关研究提供了有力的工具和方法。

第13章遗传病的诊断

第十三章遗传病的诊断遗传疾病的诊断是一项复杂的工作，几乎涉及各个临床学科。

它既有与其他疾病相同的诊断方法，也有其特殊的诊断方法。

遗传疾病诊断除了一般临床诊断方法外，还需要用一些遗传学特殊方法。

主要内容包括病史采集、症状与体征、家系分析、染色体检查、生化检查、基因诊断等。

遗传学诊断方法既可对已出现症状的患者进行诊断，也可对症状前和出生前的患者的进行诊断。

本章详细介绍了各种遗传疾病的诊断方法和技术，并对现症患者的诊断技术、症状前的诊断技术、产前诊断技术进行了详细说明；本章还重点介绍了基因诊断学的发展、策略、常用技术、应用、问题和展望等问题。

一、基本纲要1．了解遗传病诊断的常规临床诊断方法。

2．了解系谱分析方法和注意事项。

3．了解遗传病生化学诊断的基本方法。

4．掌握细胞遗传学诊断的基本方法和技术。

5．掌握基因诊断的基本原理和主要方法。

6．掌握现症患者诊断、症状前诊断、产前诊断的基本方法。

7．了解基因诊断技术的应用。

二、习题（一）选择题（A 型选择题）1．家系调查的最主要目的是。

A．了解发病人数 B．了解疾病的遗传方式 C．了解医治效果D．收集病例 E．便于与病人联系2．不能进行染色体检查的材料有。

A．外周血 B．排泄物 C．绒毛膜 D．肿瘤 E．皮肤3．生化检查主要是指针对的检查。

A．病原体 B．DNA C．RNA D．微量元素 E．蛋白质和酶4．症状前诊断的最佳方法是。

A．基因检查 B．生化检查 C．体征检查 D．影像检查 E．家系调查5．羊膜穿刺的最佳时间在孕期周时。

A．2 B．4 C．10 D．16 E．306．绒毛取样法的缺点是。

A．取材困难 B．需孕期时间长 C．流产风险高D．绒毛不能培养 E．周期长7．基因诊断与其他诊断比较，最主要的特点在于。

A．费用低 B．周期短 C．取材方便D．针对基因结构 E．针对病变细胞8．当时，可考虑进行基因连锁检测方法进行基因诊断A．基因片断缺失 B．基因片断插入 C．基因结构变化未知D．表达异常 E．点突变9．核酸杂交的基本原理是。

流式细胞技术原理

流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种用于研究和分析单个细胞的技术。

它通过将细胞悬浮在缓冲液中，并通过微细孔的流式细胞仪以高速连续地将细胞流过激光束，测量细胞在激光束中散射的光信号和特定标记物的荧光信号，以获得关于细胞的生物学特征的信息。

流式细胞技术的原理基于光学散射和荧光信号的检测。

当细胞经过激光束时，细胞与激光相互作用，导致光的散射。

流式细胞仪利用多个探测器测量不同散射角度的光信号，可以获得散射光的前向散射、侧向散射和散射角分布等信息，从而了解细胞的形态、大小和内部结构。

除了散射光信号，流式细胞技术还可以使用荧光标记物来检测特定分子或细胞成分。

在实验前，通过染色、标记或转染等方法，可将细胞表面或内部的特定分子标记为荧光物质。

流式细胞仪通过选择性的激发和检测荧光发射，可以分析标记物的存在和数量，以识别不同类型的细胞和进行更深入的功能研究。

整个流式细胞技术的过程还包括样本准备、数据采集和数据分析等步骤。

样本准备通常包括细胞的收集、处理和染色等，以确保流式细胞仪能够准确地检测和分析细胞。

数据采集则是将细胞的散射和荧光信号转化为电信号，并记录下来以供后续分析。

数据分析则是根据所需的细胞参数和荧光标记物的特征，利用计算机软件对数据进行处理、解释和可视化等操作。

总结起来，流式细胞技术通过测量细胞的散射和荧光信号，可以获得关于细胞形态、大小、内部结构、功能和标记物等信息。

它广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学等领域，为研究细胞和发现新的治疗方法提供了有力的工具。

医学免疫学实验

第一章免疫学概要1.免疫：免疫是指机体免疫系统识别“自身”与“非己”抗原，并通过面已经打排除抗原异物，以维持机体生理平衡的功能。

2.免疫防御：免疫防御是指机体排斥外源性抗原异物的一种免疫保护功能，这是机体不受外来物质干扰，保持物种纯洁的生理机制。

3.免疫自稳：免疫自稳是指机体识别和清除自身衰老残损的组织、细胞的能力，是机体维持正常内环境稳定的重要生理机制。

4.免疫监视：免疫监视是指机体识别和清除病毒感染的细胞和异常突变细胞的一种生理功能，借以监视和抑制恶性肿瘤在体内生长。

5.TCR：TCR即T细胞抗原受体，是T细胞表面特异性识别和结合抗原的结构。

6.SIg：即B细胞表面的膜免疫球蛋白，为B细胞的抗原受体，是B细胞特异识别和结合抗原的结构。

7.免疫细胞：是指参与免疫应答或免疫应答有关的各类细胞，主要有免疫活性细胞、嗜酸性粒细和嗜碱性粒细胞及组织中的肥大细胞等。

8.CD：CD即白细胞分化抗原，是白细胞（还包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟和记过过程中的不同阶段出现或消失的细胞表面抗原标志。

9.APC：APC即抗原呈递细胞，也称为免疫辅佐细胞，能将抗原信息呈递给T细胞，从而使T细胞活化。

主要有单核巨噬细胞和树突细胞两大类。

10.外周免疫器官：包括淋巴结、脾和黏膜相关淋巴组织等，是免疫细胞聚集和免疫应答发生的场所。

11.中枢免疫器官：中枢免疫器官又称一级免疫器官，包括骨髓、胸腺。

中枢免疫器官是免疫活性细胞的产生、增值和分化成熟的场所，对外周淋巴器官发育和全身免疫功能起调节作用。

12.ADCC：ADCC即抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。

当IgG类抗体与靶细胞表面相应抗原表位特异性结合后，可通过其IgGd Fc段与NK细胞表面Fc受体结合，定向非特异性杀伤靶细胞。

填空题：1.免疫功能主要是免疫防御、免疫自稳和免疫监视。

2.世界上第一例成功的疫苗是E.Jenner发明的牛痘苗，可预防天花。

3.淋巴细胞包括T细胞、B细胞和大颗粒淋巴细胞（NK细胞）。

第13章尿液分析技术和相关仪器习题

第十三章尿液分析技术和相关仪器首页习题习题参考答案习题名词解释选择题简答题一、名词解释1．尿干化学分析试剂带2．试剂带的反射率3．尿11项分析仪4．尿液分析仪光学系统5．尿液分析仪的调校6．影像式尿沉渣分析仪7．流式细胞术尿沉渣分析仪8．尿沉渣细胞的识别分析9．前向散射光脉冲宽度二．选择题【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。

1．尿蛋白定性干化学检测法只适用于检测（）A．清蛋白B．球蛋白C．糖蛋白D．黏蛋白E．核蛋白2．用尿液分析仪检测门诊患者尿液时，常采用下列哪种尿标本（）A．晨尿B．随机尿C．清洁剂尿D．3小时尿E．24小时尿3．尿液分析仪检测后质量控制主要指（）A．严格规范的实验操作B．对报告的审核、签发C．正确的尿标本收集D．有效的标本标记E．在规定的时间内完成操作4．有关尿液分析仪质控的表达，下列说法中错误的是（）A．质控物成分应稳定B．选择质控物时，最好使用多项复合控制品C．在一天内最好使用统一份质控物D．使用不同批号的试剂带前均需做质控E．使用不同批号的试剂带前不需做质控5．同普通光学显微镜方法相比，下列哪项不是影像式尿沉渣分析仪的优势（）A．速度快捷B．精确度高C．有散点图报告D．分析标准定量度E．视野清晰6．流式细胞尿沉渣分析仪定量参数不包括（）A．精子B．红细胞C．白细胞D．上皮细胞E．细菌7．流式细胞尿沉渣分析仪标记参数不包括（）A．病理管型B．小圆上皮细胞C．红细胞D．结晶E．类酵母细胞8．尿液分析仪检测尿蛋白，下列说法中错误的是（）A．黄疸尿对结果有影响B．混浊尿对结果无影响C．对清蛋白敏感D．尿液酸碱度影响检测结果E．多种药物可以影响结果9．下面关于尿液分析仪的叙述中，错误的是（）A．此类仪器采用球面分析仪接受双波长反射光B．尿试剂带简单、快速、用尿量少C．尿蛋白测定采用指示剂蛋白误差原理D．细胞检查不可替代镜检E．尿葡萄糖检查的特异性不如班氏定性法10．下述中不符合尿干化学试剂带反应原理的是（）A．粒细胞中的酯酶作用于重氮盐而产生颜色反应B．细菌可将硝酸盐还原为亚硝酸盐C．pH知识及对尿中清蛋白特别敏感D．尿中葡萄糖用特异性酶法测定E．尿红细胞检测一般应用隐血试验原11．下述中不符合尿液分析仪10项检测试剂带内容的是（）A．白细胞酯酶B．亚硝酸盐C．pHD．比重E．球蛋白12．尿干化学试剂带测定隐血试验，下列说法中错误的是（）A．试剂带只对完整的红细胞起反应B．试剂带对尿中游离血红蛋白、肌红蛋白都呈阳性反应C．镜检尿中红细胞数与试剂带阳性关系相关但并不一致D．维生素C对本试验有抑制作用E．菌尿可使测量结果呈假阳性13．尿干化学试剂带测定尿糖，下列说法中错误的是（）A．试剂带法比班氏法特异性高B．维生素C可产生假阴性反应C．试剂带法比班氏法灵敏度高D．测定结果跟尿液与试剂膜块反映的事件无关 E．过氧化物可产生假阳性结果14．尿干化学试剂带测定比重，下列说法中错误的是（）A．干化学尿比重测定，pH变化范围为6.2～7.0B．最适合测定比重范围在1.000～1.004的新生儿尿液C．尿液中蛋白质浓度增加将使比重增加D．尿素含量大于10克/升，比种结果减低E．尿比重检测是尿液分析的常规检测项目之一15．尿干化学试剂带测定尿酮体，下列说法中错误的是（）A．本法对酮体各组分的灵敏度相同B．测定时硬是用新鲜尿液C．试剂带受潮，可使尿酮体检测出现假阳性结果D．尿中苯丙酮可出现假阳性结果E．干化学尿酮检测采用硝基铁氰化钠法16．下述中哪项不属于尿干化学分析前质量控制的内容（）A．正确的尿标本收集方法B．有效的尿标本标记C．适宜的防腐剂D．规定的时间内完成检测E．检测报告的审核．签发17．世界上第一台尿液分析仪出现在（）A．20世纪50年代B．20世纪60年代C．20世纪90年代D．20世纪70年代E．20世纪80年代18．尿液分析仪试剂带的结构是（）A．2层，最上层是塑料层B．3层，最上层是吸水层C．4层，最上层是尼龙层D．5层，最上层是绒制层E．4层，最上层是吸水层19．尿液分析仪试剂带空白块的作用是（）A．消除不同尿液标本颜色的差异B．消除试剂颜色的差异C．消除不同光吸收差异D．增强对尿标本的吸收E．减少对尿标本的吸收20．尿液分析仪分析原理一般采用（）A．三波长分析法B．双波长分析法C．单波长分析法D．原子吸收分析法E．气相色谱法21．尿液分析仪的结构主要由（）A．4部分构成B．5部分构成C．3部分构成D．6部分构成E．2部分构成22．关于尿液分析仪的安装，下列说法中错误的是（）A．应安装在清洁、通风的地方B．应安装在稳定的水平实验台上C．应安装在足够空间便于并与操作的地方D．仪器接地良好E．应安装在恒温、恒湿的地方23．关于尿液分析仪使用的注意事项，下列说法中错误的是（）A．保持仪器清洁B．使用干净的取样杯C．使用新鲜的混合尿D．试剂带浸入尿样时间为2秒E．试剂带浸入尿样时间为20秒24．尿液分析仪的维护与保养，下列说法中错误的是（）A．使用前应仔细阅读说明书B．仪器要由专人负责C．每天测试前应对仪器全面检查D．开瓶未使用的尿试剂带，应立即收入瓶内盖好瓶盖E．仪器可在阳光长时间照射下工作25．流式细胞术尿沉渣分析仪的工作原理是（）A．应用流式细胞术和电阻抗B．应用流式细胞术和原子发射C．应用流式细胞术和气相色谱D．应用流式细胞术和液相色谱E．应用流式细胞术和原子吸收26．UF-100型尿沉渣分析仪使用的荧光染料是（）A．铬黑T和靛蓝B．菲啶和羧花氰C．铬黑T和菲啶D．羧花氰和铬黑TE．菲啶和铬黑T27．Sedtron自动尿沉渣分析仪，使用的放大倍数为（）A．100倍和300倍B．200倍和400倍C．100倍和400倍D．200倍和300倍E．150倍和300倍【X型题】每题的备选答案中有两个或者两个以上正确答案。

流式细胞术双标记法检测实体肿瘤DNA含量,细胞周期及Ki67表达

流式细胞术双标记法检测实体肿瘤DNA含量,细胞周期及Ki67表达一垂壅!墨翌!堂兰!塑流式细胞术双标记法检测实体肿瘤DNA含量,细胞周期及Ki67表达孙晓非,何丽海林z,廖海-彤哆0,中山医科大学肿瘤防治中心1内科2检验科.广东广州510060关键词:z三盟周期增殖桩抗原;苎盐蜜中国分类号:R730.4文献标识码:B文章编号:1000—467x(2000)07～0729—02本研究主要利用瘴式细胞术DNA/Ki67双标记法同时检测恶性实体肿瘤细胞的DNA含量,细胞周期和Ki67的表达和周期分布,并探索其相互之间和与病理组织学分级的关系.1材料与方法1.1材料1999年2—8月,经我院病理确诊的新鲜恶性实体唐标本87伪.按病理组织学分级,高分化肿瘤9例.中度分化肿瘤24例,低分化肿瘤54倒.标本置于RPMI1640培养液内,4℃保存,24 小时内制备成单细胞悬液.1.2方法12l单细胞悬液制备:上述标本用PBS冼净后剪成1咖碎块,置于100 目不锈铜网上轻辗,边以PBS缓滴.收集滴下的液体后用200目尼龙膜过滤后,I500r/rain离心5min,PBS冼两次,去上清沉淀细胞加70%乙醇固定, 4’E冰箱保存1.22KJ67和DNA双染色:将上述乙醇固定的标本PIIS洗两次后,去陈上清,将细胞悬渡分成两管.一管加20l FITC.MsIgG,另一管加20FLIT..Ki67.置于4避光30min.PBS洗两次,弃陈上清,分别加人50p.IRNase 酶(1mg/m1),450P1(50p.g/m1)染料,行DNA染色,常温避光30min.200 目尼龙膜过滤后,即可上机检测123流式细胞术检测:利用流式细流式细胞术PA胞仪FASCalibur(美国BD公司)进行免疫荧光检测.每次测定均正常人外周血淋巴细胞为DNA二倍体参照标准. Nodfit软件进行I)NA分析,全部标本cv值均在8%以下.Cellquest软件行Ki67含量分析.每份标本分析30000个细胞,细胞在波长488nm处被氲离子激光激发,P1的红荧光和FITC的绿荧光分别通过585nm和530nm滤光片收集13统计数据用SPSS统计学方法进行处理2结果2,1DNA倍体DNA指数(DI1:l,为正常二倍体细胞.DI>l或<l则为异倍体细胞. 87例实体瘤病人中异倍体发生率为40.23%.22S期细胞百分比全组87例肿瘤S期细胞百分比0%～24%(528%±4,85%)见表l,表2.表1异倍体,S期细胞百分比和Ki67与病理组织学分级注:高分化与中分化肿癌Kib7:P<0.O1,S期:P<005高分化与低分化肿瘤Ki67;P<0.O1,S期:P<001中分化与低分化肿瘸Ki67:P>005,S期:P>0.05表2异倍体和二倍体肿■的S期细胞百分比和Ki67表达一蛊收稿日期:1999—1l一09;修回日期:2000—01一o4★通讯作者:Tel:86—20—87765368—5212Fax:86—20—87761547E—mail;zsesun@2lc/1.co111FL2一Area圉I二倍体中度分化食管鳞癌Ki67/DNA双参数流式细胞术分析A:同型阴性对照.B:Ki67/DNA双染色图,横坐标是DNA含量.纵坐标是Ki67阳性细胞百分比.730孙晓非,等流式细胞术双标记法检删实体肿瘤DNA含量,细胞周期及Ki67表达2.3增殖核抗原Ki67的表达30例正常人外周血淋巴细胞K167阳性表选为0%～6%(4.3%±15%)全部肿瘤的阳性表达范围0.5%～87%f1736%±16.6%)见表1,表2.K167与DNA的关系见图1.3讨论奉研究利用流式细胞术的双标记法在同一标本行Ki67/DNA染色结果与国内外许多学者的报道相似.Ki67是一种细胞的增殖核抗原.在细胞周期G,.S,Gz/M期表达,反映细胞的增殖活性.1,21o本研究中,Ki67与S期细胞一样.中度分化和低分化肿瘤中Ki67阳性表达比高分化肿瘤高,统计学七有明显差异.然而,中度分化和低分化肿瘤之间Ki67阳性表达统计学无明显差异.异倍体肿瘤与二倍体肿瘤之间Ki67阳性表达统计学上无明显差异.流式细胞术是一种定量指标,检测标本全部细胞中K167阳性细胞的百分比,故仅能作为标本中各种细胞增殖的参考指标,如标本存在反应性增生,炎症的情况下,K167阳性细胞可增加.流式细胞术DNA/Ki67双染色法可在双参数点图上观察到K167的含量及其在细胞周期的分布(图1),有助于对细胞周期动力学的了解…:本研究是利用流式细胞术Ki67/DNA双标记法同时检测肿瘤细胞DNA 含量,细胞周期分析,增殖核抗原Ki67 的表达等参数.作为一种方法而言,此法能在24小时内获得以上参数,方法简便,快速.有助于对肿瘤细胞生物学特性的了解.本研究的病例均为新病例,所获取的参数与临床疗效与预后的关系尚需要时间进行随访观察及进一步的研究.[参考文献lll】GerdesJLiL.S4’h[ueterc,a1.Imman0bi~henfiealandmole(ular biologiceharaclerJzaliontheU pmliferatlon-~iamdnuclear~ligenthatisdefinedhvmono,10=ml[标签:快照]。

流式细胞技术与流式细胞仪

收稿日期:1999-12-23流式细胞技术与流式细胞仪何克健(安徽医科大学附属医院医学工程部,安徽合肥 230022)文章编号 1002-2376(2000)05-0006-03 中国分类号 TH773 文献标识码 B摘要流式细胞技术在细胞定量检测方面是最先进检测技术,流式细胞仪在临床和科研领域得到广泛运用。

关键词流式细胞技术细胞检测概述:分析细胞学是细胞定量分析的学科,流式细胞技术(Flow Cy tometer,FCM)是分析细胞中的一个重要领域,该技术为细胞学研究手段之一,能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个染色体的分析,而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。

这种以流动的方式(相对静态方式)测量细胞与传统的用荧光镜检测细胞比较,具有速度快,精度高,准确性好的特点,可以说FCM是目前最先进的细胞定量分析技术。

该仪器在医学和基础生命科学中得到广泛应用。

也就是说流式细胞术已应用于免疫学,生物学等临床医学和基础医学研究领域。

下面做一简单介绍。

细胞凋亡是当前研究的热点之一,检测凋亡有多种方法,FCM的优点是:(1)能快速客观高灵敏度地进行多参数地测定样本细胞中的生物学变化。

(2)定量测定凋亡指数,可同时测定凋亡细胞与细胞周围的关系。

(3)同时测定细胞增殖率与死亡率,从而可了解肿瘤的增长速度。

(4)测定单细胞为基础的凋亡相关基因蛋白的变化以探讨凋亡分子机制与细胞周期的关系。

(5)从治疗过程中肿瘤细胞死亡速率可早期了解药物的疗效。

随着FCM 凋亡检测方法的敏感性和特异性不断的提高,有望做到更客观地反映凋亡这一复杂的现象。

血液学研究的主要内容是血液和骨髓,而这两者均为天然的单细胞悬液,并且易于反复采集,这正符合FCM的标本要求。

细胞流式术在这里起的作用是:(1)对细胞内部参量的检测,利用细胞对光的散射,可获得有关细胞大小(与前向角散射有关)和粒度的信息(与侧向角散射有关)。

(2)细胞外部参量的检测。

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)

抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广 biotin-avidin不适合弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图双参数二维点图等高图二维密度图三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4
第四节凋亡检测
1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。可参看文章： /content/cell/20040914791.htm /content/cell/20040914792.htm
2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。 3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。
4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的 GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞或WBC上出现CD55或/和CD59的减少，可诊断为PNH。

流式细胞术在白血病中应用

病例二（续1）
2008.11 化疗第20个月： FCM：未见明显表型异常的残留白血病细胞。（未附图）基因：未做。 2009.09 化疗第30个月： FCM：可见残留，在CD45dim/-区域可见约1.87%的CD10+CD19+CD20-细胞和约1.55%的HLA-DR+CD19+CD34+细胞，考虑为残留白血病细胞。（见右图）基因：未做。
Outline of Leukemic Diagnosis
Primary leukemi
a
Induction
Leukemic cells
1012 100%
Morphology: 1-5%, Cytogenetics: 1-5%, Flow cytometry: 0.1-0.01%, RT-PCR: 0.01-0.001%
病例二（续2）
2010.03 化疗+DC-CIK 第36个月： FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析， CD45阴性略向原始延伸的分布区域可见异常细胞群体，与有核红细胞无分界，共约占有核细胞的89%，主要表达HLA-DR、CD10、 CD15、CD19、CD20、CD22、CD34、CD38、 cCD79a、TdT。提示：结合病史，考虑急性B 淋巴细胞白血病（普通型B-ALL）复发。基因：ALL基因筛查示TSL/ERG阳性，其余均阴性。
白血病分子诊断的意义
白血病初发
系统诊断
MICM诊断
异常标记
免疫/遗传学靶标
精确诊断准确预后指导治疗科研资料
残留监测靶向治疗
WHO血液肿瘤新分类实验技术平台
实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生物学实验技术平台以及掌握这类实验技能并具有专业知识的人员。

流式细胞仪的基本知识和用途

流式细胞仪（Flow Cytometry）1 流式细胞仪的概念及其发展历史1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。

流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。

流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。

其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。

1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。

1953年Crosland-T aylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。

其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。

近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。

宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。

这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。

由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。

此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。

细胞生物学：第13章细胞周期与细胞分裂

第一节细胞周期与细胞分裂
一、细胞周期cell cycle
定义：是指连续进行有丝分裂的细胞从一次分裂结束开始到第二次分裂结束为止的顺序变化过程。
细胞周期时相组成: G1期
间期(interphase) S期
G2期 M phase (Mitosis)
标准的细胞周期：4时期
细胞周期和细胞类群在正常的情况下, 一个完整的细胞周期应包括四个时期，但在多细胞机体中, 细胞的分裂行为有所差异。可将真核生物细胞分为三类: 周期中细胞 (cycling cell)：
1）选择同步化：从不同时期细胞中挑选有丝分裂选择法：单层培养时，分裂期细胞易脱落密度梯度离心法：不同时期细胞的体积和重量差异
2）诱导同步化：用药物诱导细胞同步
DNA合成阻断法：TdR和羟基尿等DNA合成抑制剂将细胞抑制在DNA合成期，去除抑制剂即可同步
分裂中期阻断法用秋水仙素等药物抑制细胞分裂器的形成，阻断在细胞分裂中期，去除抑制剂即可同步
遗传学的第二大定律：独立分配规律
（4）末期I、胞质分裂I和减数分裂间期：
末期I的细胞变化主要存在两种类型：
1.完全逆转到间期核的状态, 染色体要去凝集、重新形成核被膜，形成两个子细胞核；
2.没有完全回复到间期阶段，而是立即准备第二次减数分裂；
2. 减数分裂期II
第二次减数分裂与有丝分裂过程非常相似，分为前期II、中期II、后期II、末期II和胞质分裂II，最后形成4个单倍体子细胞。
双线期(diplotene)
重组结束，同源染色体相互分离，而在非姊妹染色单体之间的某些部位仍联系在一起，这种仍联系的部位称为交叉（chiasma）
非姊妹染色单体之间存在多个交叉

流式细胞仪的原理和用途

流式细胞仪（Flow Cytometry）之青柳念文创作1 流式细胞仪的概念及其发展汗青1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线活动的细胞或生物微粒停止疾速定量测定和分析的仪器，主要包含样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的收集和分析技术等.流式细胞仪以流式细胞术为实际基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶.流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术.其特点是：丈量速度快、被测群体大、可停止多参数丈量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数丈量，且在统计学上有效.1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜停止计数，并用光电记录装置丈量的设想.1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中活动规律设计了活动室.其后又颠末Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不竭改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理毗连及多参数数据的记录和分析、创始了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用.近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标识表记标帜、软件开辟等方面的工作，以扩展FCM的应用范畴和使用效果.宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作.这本书非常详细地先容了流式细胞术的汗青、布局、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人.由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术.此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来讲，这本书太复杂太深奥.谢小梅主要先容了流式细胞仪在生物工程中的应用.杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用.本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言先容了掌握流式细胞仪检测技术必须懂得的一些原理，并对今朝市场上的主流型号停止了客观的性能概括.2 流式细胞仪的工作原理和技术指标2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：活动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中活动室是仪器的核心部件.这四大部件共同完成了信号的发生、转换和传输的任务.活动室和液流系统活动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常常使用光学玻璃、石英等透明、稳定的资料制作.设计和制作均很精密，是液流系统的心脏.样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包抄在样品外周后从喷嘴射出.为了包管液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s.由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上.活动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动.激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才干发出荧光供收集检测.常常使用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器.光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定.汞灯是最常常使用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合.氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强.免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器.将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器.例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm持续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半.为使细胞得到平均照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近.因此需将激光光束经透镜会聚.光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD.λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径.色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ.为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片.带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过.例如使用525nm带通滤片只允许FITC （Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过.长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另外一特定波长的光线反射.在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采取二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开.光电管和检测系统经荧光染色的细胞受合适的光激发后所发生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而停止丈量的.光电倍增管（PMT）最为常常使用.PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高.光电倍增管的增益从10到10可持续调节，因此对弱光丈量十分有利.光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不克不及太大.一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安.此外要注意对光电管停止暗适应处理，并注意杰出的磁屏蔽.在使用中还要注意装置位置分歧的PMT，因为光谱响应特性分歧，不宜互换.也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好.从PMT输出的电信号仍然较弱，需要颠末放大后才干输入分析仪器.流式细胞计中一般备有两类放大器.一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器.线性放大器适用于在较小范围内变更的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA丈量等.另外一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常常使用对数关系.在免疫学丈量中常使用对数放大器.因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光丈量中，用对数放大器收集数据易于诠释.此外还有调节便当、细胞群体分布形状不容易受外界工作条件影响等优点.计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器.多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的.对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目.多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用.计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数.存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，停止数据处理和分析，最后给出成果.除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置.2．1．1 信号的发生、转换和传输在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不竭地压入活动室，形成一股稳定地持续的液流，包管了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激光照射区.激光照射区又称丈量区，是指液流与激光束垂直相交的点.当细胞携带荧光素标识表记标帜物（每种物质携带的标识表记标帜物分歧吗?）通过激光照射区时，发生代表细胞外部分歧物质、分歧波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360°平面角发射，发生散射光和荧光信号.散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，因此被称为细胞的物理参数或固有参数.散射光又包含前向角散射和测向角散射.前向角散射与被测细胞直径的平方紧密亲密相关，测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精密布局和颗粒性质的信息.荧光信号也有二种；一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另外一种是颠末特异荧光素标识表记标帜后的细胞受激发照射后得到的荧光信号.在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采取二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开.经荧光染色的细胞受到适合的光激发后发生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而停止丈量的.最常常使用的光电转换器是光电倍增管（PMT）.从PMT输出的电信号需要颠末放大后才干输入分析仪器.流式细胞仪中一般备有两类放大器.一类是线性放大器，其输出信号与输入信号成线性关系.线性放大器适用于在较小范围内变更的信号以及代表生物学线性过程的信号，如DNA丈量等.另外一类是对数放大器，其输出信号和输入信号之间成常常使用对数关系.在免疫学丈量中常使用对数放大器.放大后的电信号被传送到计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保管在计算机上.保管在计算机上的数据可在脱机后再停止数据处理和分析.参数（例如：细胞的大小、形态、质膜和细胞外部布局）丈量原理流式细胞仪可同时停止多参数丈量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号.丈量是在丈量区停止的，所谓丈量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点.液流中央的单个细胞通过丈量区时，受到激光照射会向平面角为2π（360°）的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同.散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞外部布局紧密亲密相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关.未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可操纵分歧的散射光信号对不经染色活细胞停止分析和分选.颠末固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然分歧于活细胞.散射光不但与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的平面角等非生物因素有关.在流式细胞术丈量中，常常使用的是两种散射方向的散射光丈量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射.这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度.一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验标明在小平面角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可以差别很大，尤其需要注意.侧向散射光的丈量主要用来获取有关细胞外部精密布局的颗粒性质的有关信息.侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出活络反映.在实际使用中，仪器首先要对光散射信号停止丈量.当光散射分析与荧光探针结合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞.光散射丈量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群.荧光信号主要包含两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞外部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色连系上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光分歧.自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和丈量.在免疫细胞化学等丈量中，对于连系水平不高的荧光抗体来讲，如何提高信噪比是个关键.一般说来，细胞成分中可以发生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强.减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽可以选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采取电子抵偿电路，将自发荧光的本底贡献予以抵偿.2．1．2 流式细胞仪分选原理其实不是所有的流式细胞仪都具有分选功能.流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的.由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成平均的小液滴.根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中.使用分歧孔径的喷孔及改变液流速度，可以会改变分选效果.从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间.切确测定延迟时间是决议分选质量的关键，可根据详细要求停止适当调整.2．1．3 数据的显示和分析数据处理主要包含数据的显示和分析.单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析.单参数直方图是由X、Y 二方向组成的二维平面图.横座标X是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”（Channel No．）来暗示.选择的放大器类型分歧，标度分歧.纵座标Y通常暗示被测细胞的相对数目.正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图.对曲线图的诠释应该详细问题详细分析.除直方图外，数据显示方式还包含二维点图、二维等高图、假三维图和列表形式等.二维点图也是比较常常使用的数据显示类型.它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决议，点的位置标了然细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值.二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图.数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类.当被检测的生物学系统可以用某种数学模子时则多使用参数方法.非参数分析法不必对显示的图像做任何假设，也不采取数学模子，分析程序可以很简单，也可以很复杂.临床医学较常使用非参数分析法.2．2 流式细胞仪性能的技术指标流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光活络度、适用样品浓度、分选纯度等.荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小间隔，通常常使用变异系数（CV值）来暗示.现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于2.0%.荧光活络度反映了仪器探测最小荧光光强的才能.一般用荧光微球上可测出的FITC 的最少分子数来暗示.今朝仪器都可达到1000左右.仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml.分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目.一般分析速度为5000～10000，分选速度节制在1000以下.流式细胞仪丈量的数据是相对值，因此需要在使用前对系统停止校准或标定.流式细胞仪的校准有二个目标，即仪器的准直调整和定量标度.通常使用尺度微球作为非生物学尺度样品，鸡血红细胞做为生物学尺度样品.3 主流流式细胞仪型号及其特性先容今朝拥有市场较大份额的公司是美国的BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter公司（原称号Coulter）和德国的Partec公司.3．1 BD公司流式细胞仪先容BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter），即荧光激活细胞分选器.其型号种类比较齐全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean.现在市场上供应的型号有五种：FACSCount（小型流式细胞仪）、FACS CAlibur（流式细胞仪）、FACSA ria（流式细胞分选仪）、FACSV antage SETM（多色分析和高速分选流式细胞仪）、LSR II （数字化分析型流式细胞仪）.FACSCount为切确计数淋巴细胞CD3，CD4，CD8相对数而设计的.FACSCalibur是全自动多色流式系统，偏重于临床，其整体设计帮忙临床医生疾速实现惯例免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，兼具分选功能.配备有二根激光管，可同时检测4个荧光参数.可识别粘联细胞.BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪，获取速度达70，000细胞/s，分析速度达50，000/s.使用石英杯活动检测池固定光路校准技术.使用三种激光，多色分析，分析参数可达15色.两管或四管分选，可使用多种规格的收集管.液流监测系统白动监测液流断点，检查堵塞，实现了细胞分选的无人操纵.配件BDACDU装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞.FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪.六色荧光分析系统，点对点分选，配置FACS Diva数字化系统，提供全面的配套试剂.速度和功能优于FACSV antage.BD LSR II是LSR的数字化升级版，其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之间，是专为生命迷信研究设计的台式机.配备固定校准的紫外激光，四种激光平面空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比较易学易用.3．2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪先容Beckman- Coulter公司生产的流式细胞仪以Profile（早期，现已停产）和EPICS系列为代表，近些年又推出了Cytomics FC500系列.EPICS系列是大型流式细胞仪，今朝市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号，其中ALTRA具有分选功能，适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析.Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小，可自动停止5种颜色的分析，适用于免疫学检测，如人类HIV诊断.特别是FC500MPL的独特设计可以在同一系统上使用12×75mm的离心管和24或96孔的平板.特别适合工作量大的实验室.这二个公司主要针对医学研究和临床工作停止设计和生产，其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检测的许多范畴，如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等.这二个公司的流式细胞仪价格昂贵，我国主要购买、使用的单位基本上都是一些医疗机构.3．3 Partec公司流式细胞仪先容与BD和Becman-Coutler公司的产品相比，德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小，造价低，易操纵，便于携带，适合植物学研究，适合遥远地区和发展中国家.德国Partec 公司的产品分为三类：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族（Galaxy为早期产品，已停产）.CCA家族包含细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I.它是单或双参数的台式小型机，可以停止一些惯例分析，如核DNA测定（检测倍性或细胞周期）、细胞计数、细胞凋亡.它的特点是体积小，易操纵，价格低，检测范围广，可以检测多种荧光素（如PI、DAPI、Fluorescein）发出的荧光.PAS家族包含粒子分析系统PAS、粒子分析系统III（PAS-III）和倍性分析仪PA-II.提供三种激光器的三种组合，可检测十余种荧光染料.最多可检测和记录八个独立荧光参数.倍性分析仪PA可以在2分钟内自动丈量植物的倍性水平，检测异倍体.可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物资料停止分析.在大多数植物中，异倍体染色体的检测分辨率为±1条染色体.PA-I使用HBO-100汞灯，属于弧光灯，可发生紫外激发光和蓝光.PA-II中增加了488nm氩离子激光器，可以检测几乎所有的荧光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等.汞灯发光是电流颠末气体时，气体电离发生的.它能提供最佳的激发波长.CyFlow（R）SL配备三种激光管，可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程节制、生态学等研究.如HIV扫描中免疫标识表记标帜细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等.它使用l2 V直流电，特别适合遥远地区和发展中国家.国际上20世纪80年月开端将流式细胞仪检测应用到植物的研究中（Galbraith，1983），众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、疾速的检测DNA含量的方法（Michaelson，1991）.应用范围主要是操纵流式细胞仪研究属内、属间多种植物的DNA含量（Baird，1994；Jacob，1996；HALL，2000）和倍性水平（Costich，1993；Meng，2002）、检测体细胞杂种（Pfosser，1995；Keller，1996）和游离小孢子培养再生株（Kim，2003）的DNA含量.过去我国应用这一检测技术的植物研究工作者百里挑一，且大多是在国外实验室完成的.研究内容包含植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等.植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是Partec公司的产品，也有少量是BD公司生产的流式细胞仪.BD公司的产品主要定位于医学研究与应用，与Partec产品相比，不太适合从事植物染色体倍性的鉴定.主要体现在不克不及提供植物样品制备技术/试剂，数据获取软件可同时检测到的倍性数目少.鉴于今朝我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪，在下一篇中将会对操纵BD流式细胞仪停止植物倍性检测的技术和技巧做详细陈述.如何选择流式细胞仪自七十年月出现第一代流式细胞仪以来，随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不竭发展，现代流式细胞仪已今非昔比，制造工艺、功能、切确度有了质的飞跃.流式细胞仪生产厂商推出各种分歧型号的流式细胞仪来知足用户的分歧需要.现生产流式细胞的厂商全球至少有六家，各厂商产品又有分歧的系列，各具特点.如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型，我们还需从分析应用出发，评估自己的需求来决议什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己.⑴、DNA倍体分析DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目.由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞分歧，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系.DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛.特别地，它可暗示出细胞毒性药物对细胞作用过程.这些DNA检测还可与细胞概况标记物标识表记标帜同时停止，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标记物的细胞显示其生长周期情况.所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常常使用的染料为PI，DAPI.流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片.⑵、细胞生存才能实验使用Heochest 33342染料与DNA特异性连系，后因细胞活力分歧，染料的连系程度也各异，故可评估细胞的活性度.流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片.⑶、计数外周血中检测网织红细胞使用TO染料可以特异性地与RNA连系，连系系数高达3000，故具有很好的性价比.流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量相对计。

凋亡细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析

凋亡细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析细胞凋亡是细胞的生物学程序，它的发生是维持肿瘤恶性发展和移植排斥的重要因素。

研究凋亡细胞的特征及其机制对于深入了解癌症的发生发展过程而言，具有重要的意义。

目前，研究凋亡细胞特征的常用方法为细胞形态学观察、流式细胞术检测各种凋亡指标等。

流式细胞术分析是目前研究凋亡细胞特征的最常用方法之一，用于定量检测凋亡细胞的线粒体膜电位（MMP）及其相关的细胞表面抗原的变化。

线粒体膜电位是指线粒体中的膜的电位，是一种特定的电势，是细胞正常运行的必要条件之一。

线粒体膜电位的变化是细胞凋亡的重要指标，可以反映线粒体功能的改变。

线粒体膜电位的改变会导致细胞周期节奏的失调，促进细胞凋亡的发生。

细胞凋亡可以通过细胞分裂周期节奏的破坏来诊断，其调节因子主要是线粒体膜电位（MMP）。

凋亡细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析是一种工艺简单、灵敏度高的技术，可以快速、准确地检测凋亡细胞的线粒体膜电位及其相关的细胞表面抗原。

首先，细胞标记为流式细胞检测用的特定抗原，如细胞凋亡标记的细胞表面抗原（e.g., phosphatidylserine）；接着，将标记的细胞移植到流式细胞分析仪中，然后用流式细胞仪扫描凋亡细胞及其相关标志，最后检测线粒体膜电位及其他细胞表面抗原。

此外，利用流式细胞术可以观察不同细胞凋亡表型之间线粒体膜电位的差异，反映细胞凋亡性质的变化，从而深入了解凋亡机制。

凋亡细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析非常有用，它可以定量检测特定细胞凋亡的标志，从而提供明确的诊断依据。

截至目前，研究者们已经实现了利用流式细胞术来检测细胞凋亡状态的变化，包括检测线粒体膜电位及其他细胞表面抗原的变化。

流式细胞仪的分析和检测方法不仅可以定量检测凋亡细胞的线粒体膜电位，而且可以检测凋亡细胞的形态特征，如细胞大小、形状、色素沉积等。

总之，凋亡细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析是一种实用的技术，可以快速、准确地检测凋亡细胞的线粒体膜电位及其相关的细胞表面抗原。