细胞培养工作流程
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细胞培养工作流程-标准化文件发布号:(9556-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
细胞培养工作流程
一、Vero细胞复苏流程
1、准备
1.1工作地点检查:
检查台面、地面是否洁净,确认无不相关物品。
1.2设施检查:
确认空调、传递窗工作状态完好。
1.3层流罩准备:
开启层流罩,观察其运行是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。
1.4操作工具和试剂检查:
检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密,是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物,瓶表面是否有裂纹,瓶塞是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液。
1.5复苏用水准备:
(1)融化种子用溶液:按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。
(2)百级内消毒种子用水:1L/1支种子准备36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。
1.6操作人员进入层流罩:
穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟后方可操作。
1.7溶液使用前处理:
辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液
辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧,充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液,放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶
(T175)盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近,将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0.3~0.4 ml/cm2),拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领
依据种子库管理规定进行支领,依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整,后续操作各项用量按比例调整。
4、种子速溶
种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时,在液氮罐颈部停留几秒,核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后,迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液(1000ml /支种子),顺时针不停摇动直至融化,将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面,放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中,百级内操作人员取出擦干。
5、移种
操作人员左手拿冻存管,右手打开,用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出,缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中,拧紧瓶盖。
6、培养
辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内(细胞贴壁80%)进行换液。
7、清场
将废液倒入下水道,废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间,层流罩内用75%酒精消毒,再用纯水清洁整个房间。
8、复苏后观察
第二天观察培养液颜色(PH)是否正常,在显微镜下观察细胞形态数量。
9、换液
换液前准备与复苏前相同。观察培养液颜色是否正常,有无漏液,看细胞是否生长良好。用消毒剂擦拭表面后放入层流罩,操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。
辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面,操作人员将翻塞翻开,再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部,左手拧开瓶盖,轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口,并将其在火焰外焰旋转1圈后,放置盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近,将生长液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0.3~0.4
ml/cm2)。拧紧瓶口,平放到恒温室培养。最后按规定清场
二、细胞传代流程
1、准备
1.1工作地点检查:
检查台面、地面是否洁净,确认无不相关物品。
1.2设施检查:
确认空调、蠕动泵工作状态完好。
1.3层流罩准备:
开启层流罩,观察其运行是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。
1.4操作工具和试剂检查:
检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密,是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物,瓶表面是否有裂纹,瓶塞是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
细胞传代用液体:MEM液,新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液、0.01MPBS溶液、细胞消化液(含0.25%的胰蛋白酶溶液)。
2、传代1操作
2.1配液
向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、
7.5%NaHCO3。辅助人员盖紧瓶口,在瓶身用记号笔注明用量、日期等,混匀待用。
注意事项:无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方,否则弃用。
2.2洗涤
辅助人员将PBS打开,用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶打开,将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶,倒入量:30ml/ T75 cm2瓶。(加量:0.2~0.4 ml/cm2)盖上盖子,PBS交由辅助人员盖紧塞子,标记用量、日期。操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项:倒废液时注意不能污染瓶口。
2.3消化
辅助人员将消化液瓶口打开,将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底,(消化液加量:0.02~0.04 ml /cm2)盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好,标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶,使细胞消化液铺满整个细胞面,静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶,使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中,盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5~10分钟。
注意事项:细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜,操作完成后马上盖好盖子。室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液,避免细胞脱落。
2.4悬液制备