药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
2015年版中国药典微生物限度检查法
2. 薄膜过滤法
– 除另有规定外，按计数方法适用性试验确认 的方法进行供试液制备。取相当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试液，若供试品所含的 菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照 方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液 中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌 面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡 萄糖琼脂培养基上培养。 – 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.1 总则：
• 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供
试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认
其有效性及对微生物无毒性。 • 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其
对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的
相容性。
1.2计数方法：
• 平皿法 • 薄膜过滤法 • 最可能数法（Most-Probable-Number Method， 简称MPN 法）。
沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培 养基，20～25℃，2～3 天 【10版：改良马丁（琼脂）培养基，23~28 ℃ ，24~48h】 沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂 培养基 ，20～25℃，5～7天 ，或直接获得 丰富孢子 【10版：改良马丁琼脂斜面培养基，23~28 ℃ ，5~7天】
药典三部(2015版)-通则-微生物检查法
1101 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非封闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基胰酪胨15.0g 氯化钠2.5g酵母浸出粉 5.0g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml无水葡萄糖 5.0g 琼脂0.75gL-胱氨酸0.5g 水1000ml硫乙醇酸钠0.5g（或硫乙醇酸）(0.3ml)除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH，使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止污染。
2015版药典三部
第4 级为高风险的原材料。这类原材料主要 包括已知具有生物作用机制的毒性化学物质， 如甲氯蝶呤、霍乱毒素、金黄色葡萄菌素孔 道溶血素、金黄色葡萄菌素肠毒素A 和B 以 及中毒性休克综合征毒素，以及大部分成分 复杂的动物源性组织和体液，如用于细胞培 养基成分的牛血淸、用于细胞消化或蛋白质 水解的动物来源的酶以及用于选择或去除免 疫靶向性成分的腹水来源的抗体或蛋白质。
风险等级分级及用于生产的质量控制要求： 根据辅料的来源、生产以及对生物制品潜 在的毒性和安全性的影响等，将辅料按风 险等级从低到高分为四级，同原材料分等 级，具体参看2015年版药典。
重组人干扰素a2b注射液
3.1原液检定 3.1.6外源性DNA残留量： 应不高于1支/瓶应不高于10ng（通则3407）
菌毒种的索取、分发与运输
应符合《病原微生物实验室生物安全管理 条例》等国家相关管理规定。（删除具体 要求，按国家生物安全相关规定执行，避 免遗漏并保证及时更新）
二、生物制品国家标准物质制备和标定规程
标准物质的种类
1.国家生物标准品，系指用国际生物标准品 标定的，或由我国自行研制的（尚无国际生 物标准品者）用于定量测定某一制品含量、 效价或毒性的标准物质，其含量以毫克（mg） 表示，生物学活性以国际单位（IU）、特定 单位（AU）或单位（U）[增订]表示。
熔封或严封：系指将容器熔封或用适宜的 材料严封，以防止空气与水分的侵入并防 止污染。
阴凉处：系指不超过20℃； 凉暗处：系指避光并不超过20℃； 冷处：系指2~10 ℃； 常温（室温）：系指10~30 ℃；
生物制品的贮藏、运输应符合“生物制品 贮藏和运输规程”的规定。
毒菌种登记程序
第3 级为中等风险的原材料。这类原材料非 药用，包括生物制品生产用培养基成分、非 动物来源蛋白水解酶、用于靶向纯化的单克 隆抗体，以及用于生物制品提取、纯化、灭 活的化学试剂等。这类生物制品原材料的质 量控制要求应高于前两个等级的原材料，为 使其符合生产用原材料的要求，使用时可能 需进一步加工、纯化处理或增加病毒灭活和 （或）去除步骤等。
2015版中国药典微生物限度解析
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
药典三部2015版-通则-1143细菌内毒素检查法
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
2015版药典内毒素检测SOP
1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。
2 范围适用于本公司质管部对注射用水的细菌内毒素检验。
3 责任检验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。
4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1仪器、用具4.1.1天平、电热干燥箱、旋涡混合器、恒温水浴锅、反应试管、镊子（金属）、金属盒、移液器具，酒精灯、脱脂棉球、剪刀、砂轮、封口膜，记号笔。
4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。
4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.2.2鲎试剂4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。
λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ≤λc≤2.0λ时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。
每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。
4.4供试品干扰试验按鲎试剂灵敏度复核试验项下，用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数（MVD）的稀释液分别将同一支（瓶）细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的细菌内毒素溶液。
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
药典三部(2015版)通则支原体检查法
精选文档3301支原体检查法主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、比较细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培育法和指示细胞培育法（ DNA 染色法）。
病毒类疫苗的病毒收获液、原液采纳培育法检查支原体，必需时，亦可采纳指示细胞培育法挑选培育基。
也可采纳经国家药品检定机构认同的其余方法。
第一法培育法介绍培育基及其处方⑴ 支原体液体培育基支原体肉汤培育基猪胃消化液500ml氯化钠牛肉浸液（ 1︰2）500ml葡萄糖酵母浸粉酚红pH 值 7.6 ±。
于 121℃灭菌 15 分钟精氨酸支原体肉汤培育基猪胃消化液500ml葡萄糖牛肉浸液（ 1︰2）500ml L- 精氨酸酵母浸粉酚红氯化钠pH 值 7.1 ±。
于 121℃灭菌 15 分钟⑵ 支原体半流体培育基按⑴项处方配制，培育基中不加酚红，加入琼脂～。
⑶ 支原体琼脂培育基按⑴项处方配制，培育基中不加酚红，加入琼脂～。
除上述介绍培育基外，亦可使用可支持支原体生长的其余培育基，但敏捷度一定切合要求。
培育基敏捷度检查（变色单位试验法）⑴菌种肺炎支原体（ ATCC 15531株）、口腔支原体（ ATCC 23714 株），由国家药品检定机构散发。
⑵操作将菌种接于适合的支原体培育基中，经36℃±1℃培育至培育基变体稀释至 10-7～10-9，接种在支原体肉汤培育基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培育基内。
每个稀释度接种 3 支试管，置36℃±1℃培养 7～14 天，察看培育基变色结果。
⑶结果判断以接种后培育基管数的 2/3 以上体现变色的最高稀释度为该培育基的敏捷度。
液体培育基的敏捷度：肺炎支原体（ ATCC 15531 株）应达到 10-8，口腔支原体（ ATCC 23714 株）应达到 10-4。
检查法⑴供试品如在分装后 24 小时之内进行支原体检查可储存于 2～ 8℃；超出24 小时应置 -20℃以下储存。
药典三部-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U （活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（k g·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
版药典三部
15版药典三部含细菌内毒素热原的品种细菌内毒素检查（通则1143）54个品种125个样品Ⅰ预防类A群脑膜炎球菌多糖疫苗P69原液检定细菌内毒素检查应不高于25EU/μg；也可采用热原检查法检查，注射剂量按家兔体重每1kg注射0.05μg多糖。
细菌内毒素检查，每一次人用剂量应不高于1250EU。
稀释剂细菌内毒素检查，应不高于0.25EU/ml.A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗P71原液检定细菌内毒素检查A群、C群多糖均应不高于12EU/ug细菌内毒素检查每1次人用剂量应不超过1250EU稀释剂细菌内毒素检查，应不高于0.25EU/ml.A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗（新增）多糖原液检定细菌内毒素检查，A群、C群多糖均应不高于25EU/ug细菌内毒素检查，每1次人用剂量应不高于500EU。
稀释剂细菌内毒素检查，应不高于0.25EU/ml.ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗P77（新增）原液检定细菌内毒素检查，A群、C群、Y群、W135群多糖均应不高于12.5EU/μg.细菌内毒素检查，每1次人用剂量应不超过1500EU。
稀释剂细菌内毒素检查，应不高于0.25EU/ml.b型流感嗜血杆菌结合疫苗P81多糖检定细菌内毒素检查，应不高于25EU/μg.结合物原液检定细菌内毒素应不高于5EU/μg。
细菌内毒素检查每1次人用剂量应不超过25EU乙型脑炎减毒活疫苗P124成品检定异常毒性细菌内毒素检查（通则1143凝胶限度试验），应不高于50EU/剂疫苗稀释剂细菌内毒素检查（通则1143凝胶限度试验），应不高于0.25EU/ml。
冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）P129成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于50EU/ml（通则1143凝胶限度试验）森林脑炎灭活疫苗P133成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于100EU/ml（通则1143凝胶限度试验）双价肾综合征出血热灭活疫苗（Vero细胞）P137成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于50EU/剂（通则1143凝胶限度试验）双价肾综合征出血热灭活疫苗（地鼠肾细胞）P140成品检定异常毒性细菌内毒素检查应小于50EU/剂（通则1143凝胶限度试验）双价肾综合征出血热灭活疫苗（沙鼠肾细胞）P144成品检定异常毒性细菌内毒素检查应小于50EU/ml（通则1143凝胶限度试验）冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）P147成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于25EU/剂（通则1143凝胶限度试验）冻干甲型肝炎减毒活疫苗P152成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于50EU/剂（通则1143凝胶限度试验）甲型肝炎灭活疫苗（人二倍体细胞）P155成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）P158原液细菌内毒素检查应小于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）半成品检定细菌内毒素检查应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）成品检定异常毒性细菌内毒素检查应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）P161纯化产物检定细菌内毒素检查每10ug蛋白质应小于10EU。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
2015新版药典4部
通则名称 限量检查法 氯化物检查法 重金属检查法 干燥失重测定法 水分测定法 残留溶剂测定法 特性检查法 溶液颜色检查法 澄清度检查法 不溶性微粒检查法 可见异物检查法 崩解时限检查法 片剂脆碎度检查法 溶出度与释放度测定法 含量均匀度检查法 最低装量检查法 粒度和粒度分精布品课测件定法
1100
1400 2000 3000 8000 8001
通则名称 制剂通则
片剂 注射剂 胶囊剂 其他通则 药用辅料 制药用水 国家药品标准物质通则 一般鉴别试验 光谱法 紫外-可见光光度法 红外分光光度法 原子吸收分光光度法
二部原附录名称 ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅧ
ⅠA片剂 ⅠB注射剂 ⅠE胶囊剂
Ⅱ药用辅料
第二增补本 Ⅲ一般鉴别试验 Ⅳ分光光度法 ⅣA紫外-可见光光度法 ⅣC红外分光光度法 ⅣD原子吸收分光光度法
（4）拖尾因子（T） 以峰高作定量参数时，除另有规定外，T值应在0.95~1.05之间。
（5）重复性 用于评价色谱系统连续进样时响应值得重复性能。 采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定 外，其峰面积测量值得相对标准偏差应不大于2.0%；
精品课件
测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂 质限度相当的溶液，作为对照溶液；进样，记录色谱图，必要时，调节纵坐 标范围（以噪声水平可接受为限）使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满 量程的10%~25%。除另有规定外，一般进样不少于3针，通常含量低于0.5%的 杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%~2%的杂质， 峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%。然后， 取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，除另有规定外，供试品溶液的记 录时间，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质 的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，计 算各杂质含量。
药典三部(2015版)-通则-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
2015版《中国药典》无菌、洁净室测定
方法适用性试验中 的修订
——两种培养基接 入试验菌的调整
22
2010年版
2015年版
1.硫乙醇酸盐流体培养基 ——金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 （4种菌）→（9支） 2.改良马丁培养基 ——白色念珠菌、黑曲霉 （2种菌）→（5支）
1.硫乙醇酸盐流体培养基 ——金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、生孢梭菌 （3种菌）→（7支） 2.胰酪大豆胨液体培养基 ——枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉 （3种菌）→（7支）
6
逐版发展提高的主要部分：
实验环境、设施的无菌保证 培养基品种及适用性检查要求 检验数量、检验量的增加 检验方法和仪器发展 验证试验要求 培养时间保证受损微生物的生长 结果判断规定 取消复试、及重试的规定
发展宗旨：加强检验的过程控制、提高方法的检出率、 保证检验结果的可靠性。
局限性
微生物污染可以发生在生 产、储存、运输、货架、 使用等环节 任何时段， 产品中微生物的污染可以 是不均匀的。
8
比较项目
实验环境要求
2010
总体1000级、局部100级
USP35
应在无菌条件下进行
EP7.0
应在无菌条件下进行
人员要求
培养基、培养 条件与时间
具备微生物专业知识，并经过 无菌技术培训
1
2
无菌检查的起源 无菌检查的发展历史 无菌检查法的发展宗旨
3
与静脉输液的起源和应用有关
——1665年，欧洲勃兰登堡候国御医约翰▪西吉斯 蒙德▪埃尔斯霍尔茨发表了《新灌药法及其方式方 法》 ——1831年，西欧霍乱肆虐，为了拯救在死亡线 上挣扎的病人，苏格兰医生赖特大胆启用静脉输 液疗法，他将大量煮沸过的食盐水静脉输注给霍 乱病人使大部分病人得救。 ——赖特在实践中观察到了输液产生的“注射热” ——随着显微镜的发明和微生物的发现，人们开始 了输液无菌检查的研究。
细菌内毒素控制及检测(通则1143)培训试题及答案
细菌内毒素控制及检测(通则1143)培训试题及答案细菌内毒素的控制和检测是非常重要的，以下是一些相关的培训试题和答案。
一、单选题（每题4分，共20分）1.细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准。
用于凝胶法时，其内毒素含量小于多少？答案：C。
0.015EU/ml。
2.常用的去除可能存在的外源性内毒素的耐热器皿是什么？答案：B。
干热灭菌法（250℃、30分钟以上）。
3.细菌内毒素的成分是什么？答案：B。
脂多糖。
4.当供试品溶液本身为强酸、强碱，或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时，排出干扰的方法是什么？答案：A。
将供试品的pH值调节至6.0~8.0.5.细菌内毒素检查法主要依靠什么来检测细菌内毒素？答案：D。
C因子。
二、多选题（每题4分，共20分）1.无菌药品附录中规定，必要时，物料的质量标准中应当包括哪些检查项目？答案：ABCD。
微生物限度、细菌内毒素、热原、培养基的外观。
2.细菌内毒素的活性单位的表达方式包括哪些？答案：AB。
EU、IU。
3.细菌内毒素检查时常见的干扰因素包括哪些？答案：ABCD。
含有螯合剂、含有某些抗凝因子、含有葡聚糖类物质、含有干扰作用的小分子。
4.对于存在内毒素污染的物质或器具，可以选择哪些方法去除？答案：ABCD。
加热法、酸碱法、蒸馏法、吸附法。
5.热原污染的途径是什么？答案：ABCD。
注射用水、从原辅料中带入、从、用具、管道和装置等带入、制备过程中的污染。
三、判断题（每题4分，共20分）1.除菌过滤和湿热灭菌已经被证明不能有效地除去内毒素。
答案：√。
2.在使用凝胶法进行限度检测的情况下，当使用新批号的鲎试剂时，可不进行鲎试剂灵敏度复核试验。
答案：×。
1、细菌内毒素的成分是什么？细菌内毒素的成分是脂多糖。
2、当供试品溶液本身为强酸、强碱，或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时，排出干扰的方法是什么？将供试品的pH值调节至6.0~8.0.3、细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化，来检测细菌内毒素的什么？细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化凝固酶原，来检测细菌内毒素。
版药典三部
15版药典三部含细菌内毒素热原的品种细菌内毒素检查（通则1143）54个品种125个样品Ⅰ预防类A群脑膜炎球菌多糖疫苗P69原液检定细菌内毒素检查应不高于25EU/μg；也可采用热原检查法检查，注射剂量按家兔体重每1kg注射0.05μg多糖。
细菌内毒素检查，每一次人用剂量应不高于1250EU。
稀释剂细菌内毒素检查，应不高于0.25EU/ml.A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗P71原液检定细菌内毒素检查A群、C群多糖均应不高于12EU/ug细菌内毒素检查每1次人用剂量应不超过1250EU稀释剂细菌内毒素检查，应不高于0.25EU/ml.A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗（新增）多糖原液检定细菌内毒素检查，A群、C群多糖均应不高于25EU/ug细菌内毒素检查，每1次人用剂量应不高于500EU。
稀释剂细菌内毒素检查，应不高于0.25EU/ml.ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗P77（新增）原液检定细菌内毒素检查，A群、C群、Y群、W135群多糖均应不高于12.5EU/μg.细菌内毒素检查，每1次人用剂量应不超过1500EU。
稀释剂细菌内毒素检查，应不高于0.25EU/ml.b型流感嗜血杆菌结合疫苗P81多糖检定细菌内毒素检查，应不高于25EU/μg.结合物原液检定细菌内毒素应不高于5EU/μg。
细菌内毒素检查每1次人用剂量应不超过25EU乙型脑炎减毒活疫苗P124成品检定异常毒性细菌内毒素检查（通则1143凝胶限度试验），应不高于50EU/剂疫苗稀释剂细菌内毒素检查（通则1143凝胶限度试验），应不高于0.25EU/ml。
冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）P129成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于50EU/ml（通则1143凝胶限度试验）森林脑炎灭活疫苗P133成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于100EU/ml（通则1143凝胶限度试验）双价肾综合征出血热灭活疫苗（Vero细胞）P137成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于50EU/剂（通则1143凝胶限度试验）双价肾综合征出血热灭活疫苗（地鼠肾细胞）P140成品检定异常毒性细菌内毒素检查应小于50EU/剂（通则1143凝胶限度试验）双价肾综合征出血热灭活疫苗（沙鼠肾细胞）P144成品检定异常毒性细菌内毒素检查应小于50EU/ml（通则1143凝胶限度试验）冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）P147成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于25EU/剂（通则1143凝胶限度试验）冻干甲型肝炎减毒活疫苗P152成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于50EU/剂（通则1143凝胶限度试验）甲型肝炎灭活疫苗（人二倍体细胞）P155成品检定异常毒性细菌内毒素检查应不高于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）P158原液细菌内毒素检查应小于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）半成品检定细菌内毒素检查应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）成品检定异常毒性细菌内毒素检查应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）P161纯化产物检定细菌内毒素检查每10ug蛋白质应小于10EU。
2015版药典细菌内毒素检查法干扰试验
11
3 干扰试验浓度的计算 按照中国药典2015年版提供的公式计算最大有效
稀释倍数，计算方法如下： 3.1 选用灵敏度为：0.25EU/ml时： MVD=CL/λ=1×0.5/0.25=2倍 3.2 选用灵敏度为：0.125EU/ml时： MVD=CL/λ=1×0.5/0.125=4倍
27
然后用样品西咪替丁氯化钠注射液 的4倍稀释液稀 释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支 管混合均匀连同该混合液即可得到含内毒素分别为 0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml， 含样品西咪替丁氯化钠注射液 浓度为4倍稀释液的 标准内毒素对照溶液（干扰试验系列）。
9
举例: 1 试剂和样品 鲎试剂（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司， 灵敏度：0.25EU/ml） 细菌内毒素检查用水 细菌内毒素工作标准品（中检院提供） 西咪替丁氯化钠注射液 （【规格】50ml:西咪替 丁0.2g与氯化钠0.45g P349）
10
2 限值的确定 内毒素限值L=0.50EU/ml（2015年版《中国药典》
0.5ml 1.2ml 1.2ml
80EU/ml
1.8ml 1.5ml 1.2ml 1.2ml 8EU/ml 2EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml
1.2ml 1.2ml
0.3ml
1.2ml
1.2ml
0.3ml
0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml
23
5.3 干扰试验系列的制备方法 ①、鲎试剂为0.25EU/ml样品浓度为2倍稀释的干扰试 验系列溶液的制备：
25
图示
0.6ml
0.50EU/ml0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml
2015版药典修订版
2015版药典修订版注射用A型肉毒毒素Zhusheyong A Xing Roudu DusuBotulinum Toxin Type A for Injection本品系用A型肉毒结晶毒素经稀释，加入稳定剂后冻干制成。
1基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合现行版《中国药典》三部“凡例”的有关要求。
2制造2.1 菌种生产用菌种应符合现行版《中国药典》三部“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.1 名称与来源生产用菌种为产毒力高的A型肉毒梭菌Hall株。
2.1.2种子批的建立应符合现行版“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.3 种子批的传代主种子批应不超过5代，工作种子批应不超过10代。
2.1.4 种子批菌种的检定采用明胶琼脂半固体培养基、血琼脂平板培养基、卵黄琼脂平板培养基。
菌种应具有典型的形态、培养和生化特性，应产生不低于1.0×105LD50/ml的A型肉毒毒素。
2.1.5种子批保存原始种子批、主种子批和工作种子批均应冻干保存于8℃以下，工作种子批也可接种于明胶琼脂半固体培养基，8℃以下保存。
2.2毒素原液2.2.1生产用种子启开工作种子批菌种复苏后，在明胶琼脂半固体培养基上扩增培养，制备生产用种子。
2.2.2产毒培养基采用含胰酶消化酪蛋白（来源！猪源性？牛源性？非疯牛病疫区？）、酵母透析液（或酵母浸出粉）、葡萄糖培养基，或经批准的其他适宜培养基。
2.2.3接种和培养生产用种子接种产毒培养基后，在适宜温度培养一定时间。
每瓶取样镜检，应无杂菌，经除菌过滤，即为原制毒素，其毒力应不低于1.0×105LD50/ml。
2.2.4结晶毒素2.2.4.1 纯化及结晶原制毒素可经酸沉淀、离子交换柱层析、硫酸铵浓缩和透析及自然结晶等程序（工艺），或用经批准的其他适宜方法进行纯化。
纯化毒素经自然结晶后即为结晶毒素。
2.2.4.2 保存于2～8℃避光保存。
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药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
式确定：
L=K/M
式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；
K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/
（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；
M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、
mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体
表面积按1.62㎡计算。
注射时间若不足1小时，按1小时计算。
供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重
剂量（M）。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
用以下公式来确定MVD：
MVD=cL/λ
式中L为供试品的细菌内毒素限值；
c为供试品溶液的浓度，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml。
如需计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使
用公式c=λ/L；
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的
内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml标示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。
取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支。
其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程中应避免收到振动，造成假阴性结果。
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
λc=ant ilg（∑X/n）
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。
反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；
n为每个浓度的平行管数。
当λc在0.5～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对
B 2λ/供试品溶液 2
C 2λ/检查用水 2
D 无/检查用水 2
的初始稀释倍数）。
若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时，则判定供试品不符合规定。
当供试品溶液的所有平行管均为阳性，可记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照
所用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及
试验必须符合以下三个条件方为有效：
⑴系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；
⑵用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%～200%的范围内；
⑶阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间。
结果判断若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。
若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。