白蚁及共生微生物木质纤维素水解酶的种类

白蚁及共生微生物木质纤维素水解酶的种类
3
相　辉　周志华
33
(中国科学院上海植物生理生态研究所　上海　200032)
Lignocellulolytic enzymes in termite and its symbiotic microbes .XI ANG Hui ,ZH OU Zhi 2Hua 33
(Shanghai
Institute o f Plant Physiology and Ecology Chinese Academy o f Sciences ,Shanghai 200032,China )
Abstract T ermites are im portant decom posers of lignocellulose in tropical ecosystems.They com prise a com plex assemblage of diverse species ,roughly divided into s o 2called lower and higher termites with different phag ous characters.T ermites can produce their own endoglucanases (EG )of G HF9,as well as glucosidase.Protistan symbiotic system of lower termite degrades cellulosic com pounds with high efficiency.Diverse lignocellulolytic enzymes are found in this system including G HF5,7and 45.Other related functional genes may include xylanase and pectinolytic related enzymes.Higher termites don ’t harbor flagellate.Fungus 2growing termites efficiently decom pose lignocellulose through their symbiotic relationship with basidiomycete fungi of the genus T ermitomyces.The symbiotic fungi produce cellulose ,xylanase and putative pectinolytic enzymes.They als o produce laccase which might be related to lignin degradation.H owever ,on m olecular level ,studies on lignocellulolytic emzymes of symbiotic fungi are relatively few.Many lignocellulolytic bacteria strains were is olated from termite guts ,divers cellulose genes were als o found recently.Lignocellulolytic enzymes in termite and its symbiotic systems may have potentials for the idea of cellulosic ethanol production by biological process.
K ey w ords termite ,symbiotic flagellate ,fungi ,bacteria ,lignocellulolytic enzymes
摘　要　白蚁是热带生态系统重要的木质纤维素降解者。

白蚁种类丰富,可分成高等白蚁和低等白蚁,食性也具有各自特点。

白蚁自身可以产生纤维素酶,主要是G HF9的内切葡聚糖酶(EG ),也有β-葡萄糖苷酶(G B )。

低等白蚁共生的原虫中已发现丰富的纤维素酶基因,属于G HF5,7和45。

同时还有其他相关功能基因,如木聚糖酶和果胶类物质水解酶。

高等白蚁肠道中没有共生原虫。

高等培菌白蚁可以利用共生蚁巢伞属真菌促进木质纤维素降解,真菌可以产生纤维素酶,果胶质水解酶类、木聚糖酶,同时还产生可能与木质素分解相关的一种漆酶,但是从分子水平,关于共生真菌纤维素水解酶的研究还较少。

白蚁肠道已分离出许多具有木质纤维素降解能力的菌株,最近的研究也发现了大量细菌纤维素酶基因。

白蚁-共生系统丰富的木质纤维素水解酶类为发展生物方法开发纤维素乙醇这一思路提供有价值的资源。

关键词　白蚁,原生动物,真菌,细菌,纤维素水解酶
3中国科学院知识创新工程重要方向项目(K SCX22Y W 2G 2
022);中科院上海生命科学院优秀青年人才领域前沿项目(2007KIP501)。

33通讯作者,E 2mail :zhouzhihua @ 收稿日期:2007212229,修回日期:2008203213
地球上的生物质资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金子塔的最庞大的基层
[1]。

天然的木质纤维素材料含有纤维素、半纤维素和木质素等。

其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源。

纤维素是葡萄
糖分子通过β-葡萄糖苷键连接而成的大分子多糖类物质。

天然的纤维素是由多条纤维素分
子链所组成的聚合物,有着复杂的超分子结构。

半纤维素是一种碱溶性的多糖,包括木聚糖、木葡聚糖和愈创葡聚糖,其中木聚糖是最丰富、分布最广的一类。

木质素是一种复杂的不溶性酚
类聚合物。

许多植食动物和腐生生物是木质纤维素的消费者,它们通过摄取这些富含纤维素的物质来供其营养物质和能量,是地球上碳循环的重要枢纽。

腐生生物中的真菌和细菌,它们发展出一系列复杂的纤维素酶系统水解纤维素分子链[1]。

植食动物尤其是高等动物,自身并不产生纤维素酶[2],而依赖肠道共生微生物所产生的纤维素酶进行木质纤维素的消化[3]。

无脊椎动物中一些节肢动物、软体动物和线虫自身能够产生纤维素酶。

尤其引起人们关注的是等翅目白蚁。

白蚁在生态系统尤其热带地区是木质纤维素的重要降解者,在木质纤维素的生物循环中发挥着重要的作用。

白蚁肠道对植物细胞壁多糖的消化能力比大型草食动物瘤胃微生物降解能力要高出30%～40%[4]。

它可以被看作一种小型的生物反应器,由研磨器(称为咀嚼组织的下颚和前胃)、反应池(消化道)、酶和微生物区系,所有这些都被用于木质纤维素的降解[5]。

白蚁这种消化系统的设计相当于工业上的生物质能转化系统,是与其共生微生物紧密合作的结果。

在几千万年的进化过程中,白蚁自身产生多纤维素酶与来自微生物的纤维素酶实现了紧密配合,高度适应了其相应的消化系统[6]。

到目前为止,从白蚁自身、白蚁肠道共生原虫中都发现了纤维素水解酶基因,也分离到了一些具有纤维素降解功能的肠道细菌。

白蚁肠道细菌对纤维素的降解作用一直没有充分的实验证据[7,8],直到最近白蚁肠道细菌对纤维素的降解作用才被证实[9]。

培菌白蚁能够利用真菌来分解木质纤维素。

我国研究者在白蚁肠道微生物多样性及功能上已发表了较好的综述[10～12],本文着重总结分析白蚁共生系统中各种来源纤维素酶的信息,为开发新的纤维素酶资源提供资料。

1　白蚁食性及其共生系统特征概述白蚁属于昆虫纲等翅目,目前全世界共有
3000多种,按照目前多数等翅目分类学者的分类方法,可以分成草白蚁科H odotermitidae、原白蚁科T erm opsidae、澳白蚁科Mastotermitidae、木白蚁科K alotermitidae、齿白蚁科Serritermitidae、鼻白蚁科Rhinotermitidae和白蚁科T ermitidae[13]。

从解剖学和社会组织性上可以将白蚁分为低等白蚁和高等白蚁。

只有白蚁科属于高等白蚁,其余4个科都属于低等白蚁。

尽管如此,高等白蚁种类所占的比例远远高于低等白蚁,约占所有白蚁种类的3Π4。

白蚁一个明显特征就是其食木性,食物范围极广,包括木材(完好的或已腐解的)、植物叶片、腐殖质、杂物碎屑以及食草动物粪便等。

低等白蚁主要食木,而高等白蚁中有些种类能以土壤、真菌为食。

白蚁所有这些食性特点都被认为是木食性的延伸[14]。

食土白蚁约占所有白蚁种类的50%,在热带森林中占优势地位。

这类白蚁研究的很不深入,其食物来源可能有多聚糖、芳香族化合物的聚合物,植物单宁和一些固化的多肽。

食物成分中碳水化合物含量低,多酚类和腐殖质类含量较高,其肠道的前部呈高碱性以促进土壤有机质的溶解和氧化[7]。

高等白蚁中大白蚁亚科Macrotermitinae的种类能够自己培养真菌,作为其营养来源,这类白蚁又称为培菌白蚁。

亚洲和非洲的热带地区大量存在培菌白蚁。

在一些热带干旱地区,这类白蚁消耗超过90%的干木;在相对湿润的热带稀树草原,它们能够矿化初级生物量的20%[7]。

培菌白蚁与其共生真菌关系的模式可以概括为:高龄工蚁收集木质碎屑带回巢内;低龄工蚁取食这些收集入巢的碎屑,初步消化并迅速排便,以这些物质建立起菌圃(fungus garden或fungus comb)来培养真菌。

低龄工蚁还取食主要由无性孢子组成的菌丝节(fungus nudoles)。

高龄工蚁主要取食菌圃较老的部分,是被真菌降解的植物材料。

不同种类所搜集的木质纤维素材料有所不同,例如, Macrotermes属的种类可能搜集枝叶碎屑[15,16],而土白蚁属似乎主要收集木材[17,18]。

在蚁巢里,白蚁是蚁巢伞纯培养的管理者。

蚁巢伞菌丝生长速度远远落后于蚁巢内的其他菌物,如炭角菌属Xylaria等,因此在竞争中往往处于劣势,而白蚁能不断地清除菌圃上的杂菌,并且从口中分泌出抑制其他菌物的化学物质,保障蚁
巢伞菌丝在竞争中占据有利地位[19,20]。

另外,白蚁的排泄物和分泌物中可能含有蚁巢伞子实体形成所必需的化学成分。

不过,白蚁的活动对蚁巢伞来说并不总是有利,白蚁的取食和其他生命活动对蚁巢伞子实体的形成起着抑制的作用。

总之,培菌白蚁与其共生真菌之间有着密切的互惠和互相制约的关系。

白蚁的肠道分为前肠、中肠、后肠。

后肠结构复杂,分为P12P5区,其中P3区显著膨大。

简单的讲,这一部分相当于哺乳动物的瘤胃,大量的微生物栖息在此,降解纤维素和半纤维素,发酵产生短链脂肪酸,其中主要为乙酸,供白蚁的营养。

低等白蚁后肠栖息有大量的鞭毛虫,与低等白蚁建立了紧密的共生关系。

这些鞭毛虫绝大部分都具有吞噬木质颗粒的能力,并产生大量丰富的纤维素酶,与白蚁自身的纤维素酶系统相互合作,可能形成相对独立的二元纤维素消化系统[21,22],也可能是紧密的一元消化系统[23],维持白蚁的营养。

高等白蚁肠道内没有共生的鞭毛虫,很多研究都认为它们对纤维素的降解主要靠自身分泌的纤维素酶来完成[7,24,25],但是近年来的研究认为细菌可能也参纤维素分子的降解[8,26]。

2　纤维素酶的种类和功能
纤维素酶是一类降解纤维素成葡萄糖的多组分酶的总称。

根据酶的性质与功能,可将纤维素酶分成内切葡聚糖酶(endoglucanases, endo21,42β2glucanase,EG)、外切葡聚糖酶(ex oglucanases,ex o2β21,42glucanase,C1)和β-葡萄糖苷酶(β21,42glucosidase,BG)。

内切葡聚糖酶主要作用于非结晶态纤维素和水溶性纤维素衍生物,随机水解糖苷键,将其分解成葡葡糖或纤维二糖、纤维三糖和其他寡聚糖。

外切葡聚糖酶包括纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,1, 42β2D2glucan cellobiohydrolase,C BH[27]和外葡萄糖水解酶(ex oglucohydrolase,1,42β2D2glucan glucohydrolase)2种成分,分别从多聚糖链的非还原端释放出纤维二糖和葡萄糖。

纤维二糖水解酶和外葡萄糖水解酶分别作用于晶状纤维素和可溶性纤维糊精。

β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和水溶性纤维糊精水解成葡萄糖[28,29]。

按照蛋白质的氨基酸序列拓扑结构信息,纤维素酶归属为葡萄糖基水解酶家族(glycosyl hydrolases family,G HF)[30]。

从Carbohydrate2Active Enzymes database(C AZ y)(http:ΠΠw w ΠfamΠacc-G H.html)数据库获得的信息来看,现有的110个葡萄糖基水解酶家族中,含有纤维素酶成员的家族有14个(表1),分别为G HF1,G HF3, G HF5,G HF6;G HF7,G HF9,G HF12,G HF16, G HF44,G HF45,G HF48,G HF51,G HF61和G HF74。

表1　C AZ y数据库公布的纤维素酶信息
纤维素酶功能来源
G HF1BG细菌;古菌;真菌;植物;等翅目,鞘翅目,鳞翅目
G HF3EG;C1,C BH;BG细菌;古菌;真菌;植物
G HF5EG;不确定细菌;古菌;真菌;原生动物;线虫
G HF6EG;C BH;不确定细菌;真菌
G HF7EG;C BH,C BH’3;不确定真菌;原生动物
G HF9EG;C BH;BG;不确定细菌;真菌;植物;尾索动物;甲壳类;蜚蠊目,等翅目G HF12EG;不确定细菌;古菌;真菌
G HF16不确定细菌
G HF44EG;不确定细菌;软体动物
G HF45EG;不确定细菌;真菌;原生动物;软体动物;线虫;鞘翅目
G HF48EG;C BH,C BH’;不确定细菌;真菌;鞘翅目
G HF51EG;不确定细菌
G HF61EG;不确定真菌
G HF74EG;不确定细菌;真菌
3与C BH不同,C BH’从纤维素分子的还原性末端释放出纤维二糖。

这些糖基水解酶家族中有很多种纤维素酶都无法确定功能。

也有一些序列显示的是纤维素酶基因的前体,可产生不同功能的纤维素酶或者其他分解木质纤维素的酶类,如木聚糖酶,不过木聚糖酶信息没有列在本表中。

在G HF7和G HF48中含有与之前定义的纤维二糖水解酶不同的另一类还原型纤维二糖水解酶,它从纤维素分子的还原性末端释放出纤维二糖。

从表1可以看出,EG酶是已报道的种类最为丰富的一类纤维素酶,并且广泛存在于各种生物中。

已报道的来自细菌和真菌的纤维素酶种类非常丰富,几乎每个家族都有它们的成员。

其中G HF6,G HF12,G HF16,G HF51,G HF61和G HF74的纤维素酶为细菌、古菌或者Π和真菌所特有。

昆虫中发现的纤维素酶分别属于G HF1,G HF9, G HF45和G HF48。

其中白蚁自身的纤维素酶有2类,一类是BG酶,属于G HF1,另一类是EG 酶,属于G HF9。

来自白蚁共生鞭毛虫的纤维素酶种类比较多。

这部分内容将在下面详细叙述。

3　白蚁及其共生系统的纤维素酶种类和特点
311　白蚁自身分泌的纤维素酶
白蚁自身是否能够产生纤维素酶曾一度引起质疑,直到1998年Watanabe等人首次从黄胸散白蚁中克隆到了来自白蚁的纤维素酶基因,白蚁自身能够产生纤维素酶的假说才得到肯定[31]。

白蚁分泌纤维素酶的部位主要有唾液腺和中肠。

较为原始的低等白蚁其分泌器官主要为唾液腺,高等白蚁主要是中肠,而低等白蚁的进化种类鼻白蚁科白蚁则在唾液腺和中肠都具有很高的酶活力[32]。

到目前为止,从NC BI 的geneBank数据库上获得的信息来看,公布的来自白蚁自身的纤维素酶蛋白质序列总共有50条(表2),几乎都是属于G HF9的EG酶,与来自共生原虫的EG酶系统学关系离得很远。

数据库中只发现1种BG酶,属于G HF1,来自恒春新白蚁Neotermes koshunensis。

目前没有发现白蚁自身的C1酶。

各种白蚁EG酶的相似度比较高,最低也在65%以上。

对所有这些序列进行系统学分析发现,鼻白蚁科EG酶与所有高等白EG酶聚为一类,而其他低等白蚁EG 酶聚为一类,与白蚁的进化关系相一致。

和植物及其他昆虫的EG酶一样,白蚁EG酶只有催化域(C D)而没有纤维素结合域(C BD)以及2个结构与之间的连接链[33]。

K hademi等人对高山象白蚁EG酶进行三维结构解析,这也是首次解析昆虫纤维素酶的三级结构。

研究发现G lu412、Asp54和Asp57是保守的氨基酸残基,在底物结合处有一个Ca2+结合位点[34]。

该酶的最适pH是516,随着pH的增加,位于催化域的G lu412发生转动,从疏水环境转至亲水环境,这可能是导致活性降低的一个原因。

尽管这种EG酶在白蚁体内大量产生并且种类丰富,并且充分的咀嚼也许可以部分的补偿C BD 甚至C1酶的作用,但是仍不能说明白蚁仅可以依赖它们就可以充分降解纤维素。

大量证据表明,至少在低等白蚁,肠道共生原生动物也发挥了重要作用。

另外,虽然目前从白蚁自身克隆的BG酶序列非常少,但是我们对来自中国不同地点的多种鼻白蚁科白蚁和高等白蚁进行酶活力测定(未发表数据),结果表明白蚁的BG 酶活力很高,尤其有趣的是,比起其他酶活性头部比躯干部显著低,甚至达到可以忽略的程度,而BG酶活力在白蚁头部其活力竟与躯干的相当,这说明白蚁自身的BG酶活力是很高的。

312　低等白蚁肠道共生原生动物产生的纤维素水解相关酶类
低等白蚁共生鞭毛虫在木质纤维素降解中发挥重要的作用。

所有白蚁共生鞭毛虫均属于原生动物动鞭毛纲Z oomastig ophorea中的3个目,即毛滴虫目T richom onadida、超鞭虫目Hypermastigida和锐滴虫目Oxym onadida[40]。

它们产生的纤维素水解相关的酶非常丰富。

从NC BI中G eneBank数据库中搜索到216条序列,其中只有28条可以确定功能(表3)。

其余序列都只能确定其所属的糖基水解酶家族而没有确定其功能特点。

这些序列来自H.sjoestedt、恒春新白蚁、达尔文澳白蚁和黄胸散白蚁,所属
表2　G eneBank中收录的白蚁纤维素酶基因
科白蚁纤维素酶序列数参考文献原白蚁科T erm opsidae Hodotermopsis sjoestedti EG4[32]
日本湿木蚁Hodotermopsis japonica EG1[6]
澳白蚁科M astoterm itidae达尔文澳白蚁Mastotermes darwiniensis EG8[6,35,36]木白蚁科K aloterm itidae恒春新白蚁Neotermes koshunensis EG3[32]
BG2[6,37]
树白蚁G lyptotermes sp.EG1[35]
鼻白蚁科Rhinoterm itidae黄肢散白蚁Reticulitermes flavipes EG1[38]
黄胸散白蚁Reticulitermes speratus EG7[31,35]
台湾乳白蚁Coptotermes formosanus EG5[39]
Coptotermes acinaciformis EG1—
白蚁科T erm itidae台华歪白蚁Sinocapritermes mushae EG3[32]
高山象白蚁Nasutitermes takasagoensis EG10[32,35]
Nasutitermes walkeri EG1[35]
黑翅土白蚁Odontotermes formosanus EG3[32]
表3　NC BI上收录的已知功能的白蚁共生原虫纤维素酶基因
白蚁宿主共生原虫所属家族功能序列数参考文献
R.flavipes未知G HF7C12[23] C.formosanus P seudotrichonympha grassii G HF7C BH5[39] R.flavipes未知G HF7EG1[23] C.formosanus P.grassii G HF7EG10[41] C.formosanus Holomastigotoides mirabile G HF7EG3[41] cteus未知G HF7EG2[41] M.darwiniensis未知G HF45EG4[36] C.formosanus Spirotrichonympha leidyi G HF5EG1[42]
的家族有G HF5,G HF7,G HF10,G HF11,G HF43和G HF45。

由于已知的G HF10,G HF11和G HF43成员中没有纤维素酶成员,估计这些酶具有降解其他大分子多糖的功能。

从纤维素酶的序列信息来看,G HF7中的序列数达到最高,共65条。

并且在现有已知功能的纤维素酶基因中,只在G HF7家族发现了外切葡聚糖酶,来自黄肢散白蚁和台湾乳白蚁。

这可以说明G HF7家族的纤维素酶在低等白蚁共生原虫中分布广泛,并且种类丰富。

在台湾乳白蚁共生原虫P seudotrichonympha grassii中克隆到来自G HF7的2种纤维素酶,即C BH酶和EG 酶[39,41]。

G HF7蛋白折叠成一面凸起一面凹陷的β2折叠加层结构,EG酶和C BH酶的差别在于加层中的活性位点的位置[39]。

这种C BH酶的发现说明白蚁后肠有能力消化结晶状的纤维素。

并且序列分析暗示这种酶能够分泌到胞外,进而充分和食物碎屑结合,因此原虫发挥的降解天然纤维素的作用可能更显著于白蚁自身的能力[39]。

所统计的这些序列没有包括提交的EST序列,因此大量候选的纤维素相关基因还没有包括在内。

在最新发表的关于黄胸散白蚁肠道系统的环境cDNA文库中[22],9%的EST 序列属于糖基水解酶类,G HF7的C BH酶类似物竟高达411%,是肠道高表达的酶类,G HF7的EG酶占211%。

并且发现了属于G HF3的BG酶,而已报道的来自白蚁的BG酶则属于G HF1。

此外还发现了丰富的木聚糖基因和其他多糖水解酶的基因(例如,阿拉伯糖苷酶、甘露糖苷酶、阿拉伯呋喃糖酶),这些主要是降解果胶物质的酶类。

没有发现降解木质素的基因。

研究结果暗示G HF7的C BH酶是后肠发挥主要作用的酶,在与其他丰富的纤维素水解酶类相互作用,后肠共生生物有能力独自完成结晶纤维素颗粒的降解[22]。

这些研究都指出原虫即使在低等白蚁纤维素降解的独立的二原系
统中,仍然发挥着主要的作用。

低等白蚁如此大程度的依赖共生原虫,我们很难相信食木的高等白蚁仅依靠自身分泌的纤维素酶便能完成自身的营养需求。

313　高等培菌白蚁共生真菌的木质纤维素水解酶类
大白蚁亚科的种类所培养的真菌属于担子菌门的蚁巢伞属Termitomyces,又称鸡枞菌属,它们与这类培菌白蚁形成紧密的共同进化关系[43]。

并且已有大量的实验从表型上证明了该类真菌很大程度上促进培菌白蚁对木质纤维素的消化[3,44～47]。

关于共生真菌对于白蚁宿主的作用有3种假说:(1)降解木质素;(2)提供木聚糖酶和纤维素酶;(3)作为白蚁的营养,尤其是氮源。

假说(2)引起了一些研究者的兴趣[48],然而目前NC BI G eneBank中还没有明确已知功能的来自蚁巢伞属真菌的纤维素酶和木聚糖酶基因。

只是最近一篇关于M.gilvus共生蚁巢伞属真菌的研究报道了一批来自该菌的纤维素酶基因、木聚糖酶基因的EST序列,收录于日本的DNA Data Bank数据库(http:ΠΠw w w. ddbj.nig.ac.jpΠWelcome2e.html)[49]。

该研究测序的EST序列中,果胶水解酶类占大多数,同时还有属于G HF6、7的C BH酶,G HF5、44、61的EG酶和属于G HF1、3的BG酶。

其实,假说(1)也是非常值得关注的,天然木质纤维素中木质素的存在阻碍着纤维素的降解,尤其在木质纤维素资源丰富的生态系统中,木质素的降解便成为碳循环的限速步骤[7]。

虽然假说(1)的实验证据仍不充分[46,47,50],但使得培菌白蚁其相对于其他白蚁种类而更显特殊。

因为大多数食木白蚁基本不能消化木质纤维素中的木质素,只是在结构上有一些不显著的变化[7,51]。

而在Macrotermes属白蚁中,共生真菌可能促进木质素的降解[46,47]。

在几种培菌白蚁共生真菌中都检测到酚类物质氧化酶———漆酶(laccases)的活性,并且Macrotermes属白蚁该酶的活性高于其他属,这可能间接的暗示了漆酶与木质素降解的关系,从M.gilvus的菌圃中得到了该酶基因lcc122的全长序列[50]。

Johjima等人对M.gilvus共生蚁巢伞属真菌建立的cDNA文库结果发现,漆酶基因类似物的EST数量较多,也从现象上给予了一定的支持[49]。

总之,从已有的资料来看,共生蚁巢伞属真菌中含有丰富的木质纤维素降解相关酶类的基因,它们对于白蚁寄主的营养发挥了重要作用,然而目前所发掘的基因还非常有限而且研究的很不深入。

314　肠道细菌产生的纤维素水解酶
白蚁肠道细菌多样性非常丰富,并且绝大部分都是未培养种类。

白蚁肠道菌的研究显示,白蚁肠道的优势菌有拟杆菌门(Bacteroides)、厚壁菌门(Firmicutes)(梭菌目Clostridiales占优势)、螺旋体门(S pirochaetes)及变形菌门(Proteobacteria)[52～54]细菌,不过优势菌因白蚁种类而有所差别。

虽然目前被广泛认可的观点是白蚁肠道细菌的作用更多的是在纤维素降解产物的后期发酵产酸过程,但是越来越多的具有木质纤维素降解功能的肠道细菌不断的被分离出[55～61],如从白蚁肠道中分离到一些能够降解木质纤维素的细菌,如厚壁菌门的芽胞杆菌属Bacillus和类芽孢杆菌属Paenibacillus[61]、还有研究分离到一些放线菌Actinomycetes,α变形菌α2 proteobacteria和拟杆菌门的屈挠杆菌科Flexibacteriaceae的细菌[58]。

正是由于绝大多数肠道细菌的难培养性,所以分离白蚁肠道细菌进而高效降解纤维素这一思路受大很大的限制。

这些研究一方面至少说明肠道细菌基因组中也蕴藏着丰富的纤维素降解相关酶的基因库,而另一方面,可能暗示人们目前对白蚁肠道细菌多样性和功能的了解还远没有真正揭示其在白蚁肠道中的代谢过程和作用。

尤其对于食木而不培养真菌的高等白蚁,肠道细菌可能对于纤维素的降解发挥重要作用。

最近的一项针对2种高等白蚁的研究强调了这一观点的可能性[8]。

该研究发现2种食木高等白蚁后肠降解结晶纤维素的酶活性占全部肠道的59%,并且用抗生素处理白蚁后,后肠纤维素酶活性也降低,从而证明肠道细菌对结晶纤维素的降解作用。

尤其令人兴奋和信服的是,新近在《Nature》杂志上发表的一篇高等白蚁肠道微生物结构与功能的文章
中[9],利用原基因组学研究,对该属的另一种高等白蚁后肠微生物结构和功能基因进行了较为全面的普查,首次为肠道微生物降解纤维素的观点提供了基因水平上有力的证据。

该研究发现了一系列新的木质纤维素降解相关酶类基因,所覆盖的糖基水解酶家族高达46个,几乎都是新的序列[9]。

该研究说明了白蚁肠道细菌纤维素基因资源的丰富性,暗示白蚁,尤其是高等白蚁肠道细菌在木质纤维素水解过程中发挥了重要作用。

目前对白蚁肠道细菌纤维素酶的深入研究仍然在进行中[52,62],发掘的来自白蚁肠道细菌的纤维素酶基因并没有很多报道,同时这些细菌纤维酶基因的高表达需要适宜的诱导表达条件。

4　应用现状和前景展望
能源危机和环境问题威胁着世界各国,开发新的清洁能源成为一个日益迫切的需求。

白蚁-
途径将可能成为生物质能源———纤维素乙醇的开发所借鉴的模型。

目前,实现纤维素生物降解转化成可再生能源,有2种思路[63]:(1)寻找高活力的纤维素酶,分离优质菌株正是遵循该思路。

目前应用于工业生产的纤维素酶制剂主要来自真菌[64]发酵。

如前所述,白蚁肠道细菌绝大多数是难培养的,从这条思路所能发现的纤维素酶非常有限,尽管如此,对已发掘的白蚁肠道内有木质纤维素降解能力的菌株的深入的动态研究甚至遗传改造也可能会使其成为有生产实践价值的工程菌。

而从白蚁共生真菌鸡枞菌与白蚁特殊的共生关系上来看,培养该真菌的条件是苛责的。

这些难培养性,相当程度上源于人们对这些共生菌的认识和研究远远落后[43]。

随着研究手段的改善,培养条件的不断尝试,功能基因的不断开发,也许会产生具有生产实践意义的蚁巢伞工程真菌。

(2)通过定向进化和分子改造的方法筛选重组型高比活的纤维素酶。

人们已经利用基因工程技术将纤维素酶的基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中以期得到新的高比活力的重组型纤维素酶。

目前就白蚁共生系统的纤维素酶,发掘的功能基因主要为白蚁自身、其共生原生动物、共生真菌的真核基因,这类真核基因的体外高效表达仍存在一定的困难。

不过随着不断深入的基因改造,高效的纤维素酶的低成本开发是有可能的[65]。

已有的研究可以看出白蚁细菌纤维素降解功能基因资源是丰富的。

随着肠道细菌元基因组和相关的分子生物学手段的逐渐展开,相信大量细菌的功能基因会被发掘。

细菌群落结构与功能基因的联系也会逐渐被揭示。

不同食性特点的白蚁及其共生微生物会具有不同的特点。

因此,未来的研究可能需要了解不同栖息特性白蚁体内纤维素酶的组成特点,全面获取白蚁纤维素酶的基础信息,进一步加强白蚁纤维素酶基因结构的研究。

结合生物信息学技术预测相关基因的功能,彻底阐明白蚁利用纤维素的理化途径以及纤维素酶在白蚁体内的分泌机制。

在全面掌握各类型白蚁纤维素酶特性的基础上,筛选出具有较高活性纤维素酶的白蚁种类,为开发高活性的纤维素酶基因工程菌株创造条件。

利用纤维素酶分解自然界中的纤维素类物质,生产工业燃料,弥补世界石油和天然气资源的不足,为人类经济的进一步繁荣和发展开辟新的能源途径。

参　考　文　献
1　T omme P.,W arren R.A.,G ilkes N.R.Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi.Adv.Microb.Physiol.,1995,37(1):1～
81.
2　F oley B.In:K nox B.,Ladiges P.,Evans B.et al.(eds.), Biology,2nd.Heterotrophic nutrition in animals.R oseville
Australia:M cG raw2Hill,2001.486～515.
3　M artin M.M.,M artin J.S.Cellulose digestion in the m idgut of the fungus2growing term ites M acrotermes natalensis:the role of
acquired digestive enzymes.Science,1978,199(4336):1453
～1455.
4　Lam T.B.,Iiyama K.,S tone B.A.H ot alkali2labile linkages in the walls of the forage grass Phalaris aquatica and Lolium
perenne and their relation to in vitro wall digestibility.
Phytochemistry,2003,64(2):603～607.
5　Brune A.T erm ite guts:the w orld’s smallest bioreactors.Trends Biotechnol.,1998,16(1):16～21.
6　Lo N.,T okuda G.,W atanabe H.,et al.Evidence from multiple gene sequences indicates that term ites ev olved from
w ood2feeding cockroaches.Curr.Biol.,2000,10(13):801～
804.。