包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体蛋白的纯化和复性
包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。
沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。
破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。
分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
重复一次。
再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。
12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。
【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体旳纯化和复性总结ﻫ二、包涵体旳洗涤ﻫ1、包涵体旳洗涤问题ﻫ一般旳洗涤措施一般是洗不干净旳,我此前是这样做旳，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解旳物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以始终稀释到合适旳浓度，你可以找到一种合适清除杂质旳措施，其实这就是梯度沉淀旳措施，我觉得比一般旳直接洗脱效果好。
ﻫﻫ包涵体一般难溶解,因此你要注意未溶解旳部分,你可以跑电泳对比，由于有时候难溶解旳就是你旳目旳蛋白，因此每次解决都要把上清和沉淀跑电泳对比,免得把目旳蛋白弄丢了。
ﻫ此外刚解决完旳包涵体好溶解。
冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量旳溶剂。
如果说是不少不溶解旳不是你要旳，那就不用管了。
２、如何得到比较纯旳包涵体对于包涵体旳纯化,包涵体旳前解决是很重要旳。
ﻫ包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质。
洗涤常用1%如下旳中性去垢剂，如Ｔwｅen、Trｉton、Ｌuｂｅｌ和ＮP40等加ＥDＴA和还原剂２-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加5０ mM ＮaCL。
这样提取旳包涵体纯度至少可达50％以上，并且可保持元构造。
也可用低浓度旳盐酸胍或尿素/中性去垢剂/ＥDTＡ/还原剂等洗去包涵体表面吸附旳大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜，使用旳还原剂为0.1-5ｍM。
EDTA为0.1-0.3 mＭ。
去垢剂如Tｒiton X-1０0、脱氧胆酸盐和低浓度旳变性剂如尿素充足洗涤清除杂质，这一步很重要,由于大肠杆菌外膜蛋白Oｍp T(37 KDa)在4-8mｏｌ/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体旳溶解和复性过程中可导致重组蛋白质旳降解。
对于尿素和盐酸胍旳选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强旳可逆性变性作用,所需浓度尿素8－10Ｍ，盐酸胍6-8M。
蛋白纯化蛋白复性
蛋白纯化蛋白复性包涵体的纯化和复性总结关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。
包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。
在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。
在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。
小伙伴们，这是一种正确的态度么？“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。
回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰色的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。
将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。
——看的见的问题是态度本身包涵体蛋白纯化步骤包涵体洗涤包涵体溶解包涵体复性包涵体纯化1、包涵体裂解细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。
细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。
（1） 细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml 溶菌酶、1 mM MgCl 2、20 μg/mlDNase 、1mM PMSF ，混均匀，冰上或者室温放置30 min 。
根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。
向着太阳是向日葵不变的态度（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；在细胞裂解时应该注意：a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。
b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回:包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化与复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点:较高的活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白;折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤:包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等,这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂,如2M尿素在50mM Tris,pH7、0-8、5,1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温与去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片与膜蛋白。
同时,因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl,使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍,主要就是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白分子间的各种化学键,使多肽延伸。
盐酸胍就是较尿素强的变性剂,它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。
另外,从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体,通常含有一些链间形成的二硫键与链内的非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体,也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成与断裂就是可逆的,直到最有利的蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素较盐酸胍慢而弱,溶解度为用尿素溶解具有不电离,呈中性,成(8-10M)70-90%本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍(6-8M)溶解能力达95%以上,且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性就是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤引言：包涵体蛋白纯化是生物技术和生物制药领域中重要的工艺步骤之一。
通过纯化包涵体蛋白，可以获得高纯度的目标蛋白，为后续的研究和应用提供了基础。
本文将介绍包涵体蛋白纯化的一般步骤，包括细胞破碎、包涵体回收、包涵体溶解、亲和层析和蛋白质再折叠等。
一、细胞破碎：细胞破碎是包涵体蛋白纯化的第一步。
通常使用机械方法（如超声波破碎或高压均质）或化学方法（如洗涤剂破碎）来破碎细胞，释放包涵体蛋白。
需要注意的是，破碎条件应该使得包涵体蛋白能够充分溶解而不会发生蛋白质降解。
二、包涵体回收：包涵体蛋白通常以包涵体的形式存在于细胞裂解液中。
包涵体回收是将包涵体从其他细胞成分中分离出来的过程。
一种常用的方法是通过离心将细胞碎片和其他细胞成分与包涵体分离。
此外，还可以使用过滤、沉淀或超滤等技术来实现包涵体的回收。
三、包涵体溶解：包涵体蛋白在还原条件下通常以不溶性的形式存在。
为了使包涵体蛋白能够溶解，通常需要添加变性剂（如尿素或胍氯酸）和还原剂（如二硫醇）。
通过调节溶解条件，可以使得包涵体蛋白迅速溶解为可溶性蛋白。
四、亲和层析：亲和层析是包涵体蛋白纯化的关键步骤之一。
通过将目标蛋白与亲和层析介质上的亲和配体结合，可以实现目标蛋白的富集和纯化。
亲和配体可以是金属离子、抗体或亲和标签等。
在亲和层析过程中，需要注意选择合适的亲和配体和适宜的洗脱条件，以实现对目标蛋白的高效纯化。
五、蛋白质再折叠：由于包涵体蛋白在还原条件下溶解，其折叠状态通常不完整。
为了使得目标蛋白具有正确的结构和功能，需要对其进行再折叠。
常用的再折叠方法包括逐渐降低变性剂浓度、添加折叠辅助剂和调节pH 值等。
通过适当的再折叠条件，可以使得目标蛋白恢复到天然的折叠状态。
结论：包涵体蛋白纯化是一项复杂的工艺步骤，需要经过细胞破碎、包涵体回收、包涵体溶解、亲和层析和蛋白质再折叠等步骤。
通过这些步骤的有序进行，可以得到高纯度和高活性的包涵体蛋白。
随着生物技术和生物制药的不断发展，对包涵体蛋白纯化技术的要求也越来越高，希望通过不断的研究和创新，能够进一步提高包涵体蛋白纯化的效率和纯度，为生物医药领域的研究和应用提供更好的支持。
6HIS 包涵体蛋白纯化方法
6HIS 包涵体蛋白纯化—复性方法
1．摇500ml菌至OD小于0.5时加IPTG在37℃诱导表达3小时。
2．离心，将沉淀置于-20℃冻融。
(可无)
3．用8M尿素重溶沉淀：先用0.5ml tris-cl buffer 将沉淀吹打成悬浮状，再加入20ml 8M尿素，摇匀，室温于脱色摇床上摇20分钟，充分溶解沉淀。
4．12000rpm,15℃以上离心15分钟。
5．挂柱：取上清与平衡好的镍柱柱料混合，室温于脱色摇床上摇20分钟。
6．WASH:ph8.0尿素（8M）十倍体积
7．洗脱：PH5.0
8．选浓度OD在1.0以上的来透析，透析之前加1mMDTT,两种buffer:
IB solubilization(10×):caps(3-[Cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid) 500mM PH11.0 N-lauroylsarcosine(30%)10×
Sometimes: 3M NDSB(10×)
9．先加到4M 尿素in Tris 50mM，并加DTT到1mM按PH8.5
10. 降至2M, 成分同上，并加150mMNaCl
11. 降到1M 同10
12. 最后透析液：Tris 50mM
NaCl 150mM
DTT 1mM
PH8.2
13.再透析去掉DTT。
重组蛋白包涵体表达的复性和纯化
色谱过程及其分类
• 色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子 形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为 固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程
度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
层析填料的选择
凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography GFC)又称为分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatography SEC），凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量 的测定。
• 包涵体的溶解
目
二硫键
的
次级键
变性剂 去污剂 还原剂
盐酸胍、尿素 SDS、Triton 100 巯基乙醇、DTT
如何使包涵体的构型复原成正确状态？
• 蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状 态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一 级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以 自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。
破碎率较低，常与其他方法结合使用
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
X-press法 固体剪切作用
化 酶溶法 学 破 化学渗透法 碎
酶分解作用 改变细胞膜渗透性
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合
具有高度专一性，条件温和，浆液易分 离，溶酶价格高，通用性差
具一定选择性，浆液易分离，
l 细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 l 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，
还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖 等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分 子而聚集，给后步纯化带来困难。 l 洗涤剂：温和的表面活性剂（Triton X-100） 、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等 。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 l 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达 产物为原则。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性得方法操作流程返回:包涵体复性常见问题分析与解决包涵体得纯化与复性总结包涵体折叠复性得方法应具备以下几个特点:较高得活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后能够得到较高浓度得蛋白;折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性得过程通常分为以下几个步骤:包涵体得洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等,这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体得洗涤通常选用浓度较低得变性剂,如2Ｍ尿素在５0mM Trｉｓ,ｐH７。
0－8。
5,1mＭEDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温与去垢剂ＴritonX-100洗涤去除膜碎片与膜蛋白。
同时,因为去垢剂得洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度得尿素或高浓度得NaCｌ,使包涵体得纯度达到50%以上。
包涵体得溶解变性剂如尿素、盐酸胍,主要就是通过离子间得相互作用,打断包涵体蛋白分子间得各种化学键,使多肽延伸。
盐酸胍就是较尿素强得变性剂,它能溶解尿素不溶得包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Saｒkosｙl等也可以破坏蛋白内得疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。
另外,从某些含有半胱氨酸得蛋白质中分离出得包涵体,通常含有一些链间形成得二硫键与链内得非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DＴT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体,也会被复性用得二硫化物置换试剂所取代。
二硫键得形成与断裂就是可逆得,直到最有利得蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素(8－１较盐酸胍慢而弱,溶解度为7用尿素溶解具有不电离,呈中性,成0Ｍ)０－90%本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解得包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍(６-8M)溶解能力达9５%以上,且溶解作用快而不造成重组蛋白质得共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀ﻫ对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体得复性复性就是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展得变性状态恢复到正常得折叠结构,同时去除还原剂确保二硫键正常形成、一般在尿素浓度4Ｍ左右时复性过程开始,到2M左右时结束;盐酸胍可以从4M开始,到1、5M时结束。
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。
His标签蛋白包涵体的变复性及其纯化
His标签蛋白纯化步骤若目的蛋白在上清表达,则使用试剂盒buffer(Novagen His?BindPurification Kit, 70239);若为包涵体,则需自配buffer。
(1)试剂准备①12.5mL 1×charge buffer (1.6mL原液+10.9mLSW)②32.5mL 1×binding buffer (4mL原液+28.5mLSW)③15mL 1×wash buffer (1.9mL原液+13.1mLSW)④15mL 1×Elute bu ffer (3.8mL原液+11.2mLSW)(2)装柱①盖上下盖,轻轻混匀His-bind Resin(若柱子不是首次使用,只需把已再生的柱床小心重悬,同样过夜沉降即可)。
②转移4mLHis-bind Resin至柱中,沿管壁流下,一次性加足,否则胶面会形成断面,影响吸附效果。
③用封口膜封住上口,置4℃冰箱,沉降过夜。
(3)过柱前准备(大约1h)①使胶床上液依重力自动流下。
②待留至床顶时,依次加入以下溶液(用滴管沿管壁小心加入,且要一次性加足)a.7.5mL无菌SWb.12.5mL 1×charge bufferc.7.5mL 1×binding buffer注:各步骤间连接要流畅,勿使胶床干燥(4)上样过程上样时同前一样,要小心贴壁加入,可一次性加满柱子(会使样品流有较大压力),随时可补加样品,使柱子保持满的状态。
(5)洗脱依次加入:①25mL 1×binding buffer ②15mL 1×wash buffer ③15mL1×Elute buffer 收集前8管(首先塞上下面的塞子,室温放置20min,再收集)跑PAGE胶,进行蛋白浓度测定。
(6)柱再生①1×strip buffer配制7.5mL 1×strip buffer:1.9mL原液+5.6mLSW②柱子纯化完后,加入7.5mL 1×strip buffer,洗涤至液面稍高于床顶,用塞子封住下口,直立放置4℃过夜③次日依次加入:5mL 6M盐酸胍0.2N乙酸(57.3g盐酸胍+1.2mL冰乙酸+SW→100mL)5mL SW2.5mL 2%SDS2.5mL 25%无水乙醇2.5mL 50%无水乙醇2.5mL 75%无水乙醇12.5mL 100%无水乙醇2.5mL 75%无水乙醇2.5mL 50%无水乙醇2.5mL 25%无水乙醇2.5mL SW12.5mL 100mM EDTA pH8.0 (1.861gEDTA+50mL SW调pH8.0) 7.5 mL SW7.5 mL20%无水乙醇(加满细柱部分)4℃保存柱子若His标签蛋白为包涵体,则需先进行变复性,步骤如下:①收集菌体(离心,8800rpm,15min),弃上清②PBS洗3遍③40mL(若为400mL菌液)1×binding buffer(非变性)重悬菌体,超声波裂解至菌液变澄清(中途可离心收集沉淀,再次重悬,裂解,以释放更多的杂蛋白)。
包涵体纯化复性指南
关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化.一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？3、酵母的破碎4、超声破碎的条件选择5、如何鉴定细菌超声破碎的程度6、细菌裂解的DNaseI7、超声裂解细菌是否完全？二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题2、如何得到比较纯的包涵体三、关于包涵体的溶解：1、请教GST包涵体溶解2、包涵体的溶解3、有关包涵体的溶解问题4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？四、包涵体的复性1、包涵体如何复性2、包涵体的复性23、包涵体复性34、SOS!!各位包涵体复性高手5、大家来谈谈包涵体复性问题6、包涵体复性形成聚集物7、复性中蛋白析出！8、包涵体复性液配方9、什么叫复性成功10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功五、包涵体的纯化复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。
（注：当然也可以先纯化然后再复性———一般多采用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行———比如柱上复性。
）六、综述以及其他1、蛋白复性和纯化在线资料2、综述细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
包涵体复性方法-李
1、上清中亲和层析纯化蛋白（整个纯化过程在低温下操作）：
全菌采用50 mM Tris(pH8.0)，150 mM NaCl，20 mM Imidazole，2 mM DTT 含1% TritonX-100，1 μg/mL Pepstatin A，1 μg/mL Leupeptin 超声裂解，同时以50 mM Tris(pH8.0)，150 mMNaCl，20 mM Imidazole，2 mM DTT 缓冲液平衡Ni-IDA 亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 分析检测；
2、包涵体通过亲和层析纯化蛋白
包涵体采用50 mM Tris (pH8.0)，150 mM NaCl 含1% Triton X-100，2 mM EDTA，2 mM DTT洗涤后，以50 mM Tris(pH8.0)，150 mM NaCl，8 M Urea，20 mM Imidazole，2 mM DTT 缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA 柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 分析检测。
3、经Ni-IDA 亲和层析纯化分析，收集纯度较高的梯度，将其加入到处理后的透析袋中，4 ℃环境下，透析到缓冲液［1×PBS(pH 7.4)，4 mM GSH，0.4 mM GSSG，2 mM EDTA，0.4 M L-Arginine，1 M Urea，2 mM DTT］中复性（搅拌，换一次液，不加搅拌一晚上换2次，），复性后最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，20% Glycerol，2 mM DTT 溶液约6-8 h。
透析复性结束后，上清用0.22μm 滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。
包涵体制备,变复性,纯化
制备包涵体1、超声破碎细胞2、4 ℃，12000rpm，离心10 m in, 弃上清收集包涵体.3、所得的包涵体加入1\10 体积的体积分数为1% TritonX-100液洗涤2 次4、4 ℃、12 000 rpm、离心2 m in, 沉淀即为包涵体,包涵体蛋白的变性复性方法一1、在上述包涵体中加入19、7 mL 缓冲液A (50 mmol\L Tris-HCl, 0.5 mmol\LEDTA , 0.5mmol\L DTT , 50mmol\L NaCl, 5 % 甘油) 和0.3mL 20% N-十二烷基肌氨酸钠贮存液2、剧烈搅动重悬，25OC下磁力搅拌2-3h使沉淀缓慢溶解3、4 ℃，12 000 rpm、离心10 m in, 弃沉淀4、加入PEG-6000 (终体积分数为0、2% )、氧化型谷胱甘肽(终体积分数为1mmol\L )、还原型谷胱甘肽(终浓度为2 mmol\L ),静置2h5、以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.方法二1、在上述包涵体中加入5mL 浓度为8mol\L 的尿素剧烈搅动, 25 ℃下用磁力搅拌器不断搅拌2～ 3 h 使沉淀缓慢溶解.2、4 ℃,12 000 rpm、离心10m in, 弃沉淀3、所得上清加入15mL pH8、0 的PBS 溶液(使尿素的浓度降低以利于复性) 以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.检测1、取出30 uL 备用2、向30 uL样品中加入7、5 uL 的5 倍LSB上样缓冲液, 100℃沸水处理5～10 min, 离心后取5 uL 上清上样, SDS-PAGE 检测相关试剂Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂），常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。
包涵体蛋白纯化
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
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包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决
包涵体的纯化和复性总结
包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：
包涵体的洗涤
包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，
pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解
变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比
尿素（8-10M）
较盐酸胍慢而弱，溶解度
为70-90%
用尿素溶解具有不电离，呈中
性，成本低，蛋白质复性后除去不会
造成大量蛋白质沉淀
溶解的包涵体可选用多种色谱
法纯化
盐酸胍（6-8M）
溶解能力达95%以上，且
溶解作用快而不造成重组蛋白
质的共价修饰
成本高、在酸性条件下易产生沉
淀、复性后除去可能造成大量蛋白质
沉淀
对蛋白质离子交换色谱有干扰
包涵体的复性
复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束；盐酸胍可以从4M开始，到1.5M 时结束。
复性方法主要采用稀释复性，透析复性和柱上复性，具体对比如下：
复
性技
术
简介优点缺点
稀释复性用折叠缓冲液快速稀释溶解的包涵
体蛋白质溶液，达到降低变性剂浓度的目的，使去折叠的蛋白质进行再折叠简单
慢
蛋白会被稀
释到很低浓度
体积增加较
大，变性剂稀释速
度太快，不易控制
透析复性通过逐渐降低外透液浓度来控制变
性剂去除速度
简单
不增加体
积
慢
使用大量缓
冲液
不适合大规
模操作，无法应用到生产规模
分子筛层析分子筛效应可将蛋白质和小分子变
性剂分离，实现溶液交换和蛋白质的折叠
在一步操
作中直接进行
自动化复性并
纯化
样品体积受
限
离子交换层析减少导致蛋白质聚集的分子间相互
作用，可将蛋白质结合在分离介质上，达到溶液中变性剂浓度的稀释和蛋白质的折叠
快速并简
单
直接进行
自动化
应避免使用
与离子交换自相
反电荷的添加
复性的检测
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1.凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然
状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2.光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，
利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3.色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4.生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反
映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5.黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴
露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6.免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，
比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
蛋白复性过程的添加剂
1.共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，
此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2.二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键
打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3.分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠
的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。
有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。
不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4.0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体
的形成。
5.甘油：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
6.辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体
等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
案例介绍
包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析
材料和设备
Tiss-Tearor?匀浆器
透析袋（Spectra/Por?6）
阳离子交换柱
SDS-PAGE电泳装置
试剂
缓冲液A（1000mL）
1mol/L Tris-HCl（PH 7.9）50mL，50mmol/L
0.5mol/L EDTA 1mL，0.5mmol/L
5mol/LNaCl 10ml，50mmol/L
甘油50mL，5%
缓冲液A+50%甘油
脱氧胆酸钠（DOC）
N-十二烷基胺酸钠（SKL）
操作程序
用N-十二烷基胺酸钠溶解包涵体沉淀
1.加18mL缓冲液A和2mL 20% DOC储存于包涵体沉淀中。
用组织破碎器充
分重悬沉淀，室温下静置至少10min。
2.悬液于4℃、13000r/min离心10min。
弃去上清（注意留样，样品C），
为确保沉淀得到充分洗涤，再次按步骤一的操作重悬沉淀。
将悬液分成俩个相等的部分，编号#1和#2，于4℃、13000r/min离心10min。
3.对#1管中的沉淀，加19.7mL的缓冲液A和0.3mL的20%SKL储液。
剧烈
搅动使沉淀慢慢溶解。
然后静置30min。
4.#1管中溶解的蛋白悬液，置于4℃、13000r/min离心10min。
收集上清液，
弃去沉淀。
透析除去去污剂使可溶性蛋白重折叠
1.对溶解的物料进行蛋白定量测定（制作标准曲线时，必需用含有0.3% SKL
的牛血清蛋白）。
用缓冲液A+0.3% SKL稀释，将溶解的蛋白浓度调至1mg/mL。
2.用缓冲液A将溶解蛋白制备液稀释10倍，使蛋白终浓度约为0.1mg/mL，
SKL终浓度约为0.03%。
3.4℃下，溶解蛋白制备物（约200mL），用2000mL缓冲液A透析8h（每
4h，取150uL样品，用HPLC测定去垢剂含量），同时充分搅拌。
然后换新鲜缓冲液并重复。
离子交换层析
1.从透析袋中移出经透析的蛋白质溶液，4℃、8000r/min离心20min，除去
所有聚集物。
2.留上清（样品J），加载于POROS 50S阳离子交换柱，作为后一级的分级分离。
3.用缓冲液A洗涤层析用的介质，然后将其倾入带适配器接头的玻璃柱中，装成一总体积为5mL的层析柱。
用缓冲液A+1mol/L NaCl洗柱。
并用缓冲液A平衡柱子。
4.如透析是在低盐环境下进行，则可在室温下以4mL/min的流速直接将蛋白样品加载于层析柱上。
5.用缓冲液A洗柱15min，然后在60min内，以4mL/min的流速，进行梯度洗脱（0-1mol/L NaCl/缓冲液A）。
检测260nm和280nm处的吸收，分部收集4mL 组分。
6.SDS-PAGE电泳分析各组分，并合并峰组分进行进一步分析。
合并的组分可通过对缓冲液A+50%透析，制备后储存。