EP6.0-2.6.12微生物限度检查
中国药典微生物限度检查和相关的发展趋势
USP31 General Information/<1196> Phmarmacopeial Harmonization: The following policy statement was approved by the PDG at its September 2002 meeting.
pH6.8/7.6PBS；0.9%NaCl
基/乳糖肉汤培养基
细菌数：营养琼脂，48hrs
霉菌及酵母：玫瑰红钠琼脂， 72hrs,5～7天
需气菌总数：大豆酪蛋白消化物 琼脂，48～72hrs
霉菌及酵母：沙氏葡萄糖琼脂或 马铃薯葡萄糖琼脂，5～7天
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
1、方法和标准的修订与完善
对供试品的前处理和一些检验方法进行了完善；
具有明显的中国特色，与国际差距显著。
计数测定体系的差异：
难以操作，检验繁琐
需气菌总数=细菌数+霉菌及酵母菌？
1000
1000 100
参见：《美英欧药典微生物限度标准的浅析》，苏德模、胡昌 勤、马越，《中国药品标准》，2005年第3期
EP6.0 2.6.12/2.6.13/5.1.4
This general chaper presents 2 sets of tests. The 1st set gives the reference methods for determining compliance with monographs. Reference to this chapter in a monographs therefore implies compliance with the 1st set of tests, unless use of the 2nd set of tests has been authorised. The tests in the 2nd set also constitute official methods of the EP and may be refered to as such, notably in applications for marketing authorisation. It is intended to replace the 1st set by the 2nd set once the monographs concerned have been revised. The 2nd set presents tests developed in co-operation with the JP and USP to achieve harmonised requirements.
欧洲药典-2．6．12非无菌产品的微生物限度检查
2．6．12非无菌产品的微生物限度检查 (有活力的需氧菌总数的计数)本附录给出了两种测试方法第一种给出与专论相符合的相关测试方法除非说明采用第2种测试。
参照本章的内容采用第１种测试方法。
考虑到申请上市许可的需要。
第2种测试方法也是欧洲药典正式方法的组成部分。
一旦相关部分修改，用第２种测试方法代替第１种。
第二种方法为了与日本药局方和美国药典的要求一致A .欧洲药典的方法下述检验方法是对有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌数的计数检查。
这些试验设计主要用来检查样品是否符合药典对微生物限度的要求，用于这一目的时要遵守以下指导原则，包括样品的抽样数选取及结果的解释。
这些试验也可以用于药典中抗菌防腐剂效力的检验(5.1.3)。
它们可进一步用来监测原料质量，药物制剂的微生物质量监测(5.1.4)。
当用于这些目的时，例如生产者用于原料和／或成品的检测或者用于认证过程评价时，进行测试的方法包括抽取样品数及结果的解释是生产者和主管当局间协议中的事项。
检定应该在样品不会被污染的条件下进行。
用来防止污染的预防措施必须不影响在试验中微生物的检出。
如果被检测的产品含有抗菌活性，它必须被充分中和，并证明所用的灭活剂是有效的和对微生物是无毒性的本章描述了薄膜滤过法，培养板记数法测定有活力的需氧菌总数当没有其它方法进行细菌计数时可用最大可能数法。
方法的选择基于产品的性质及预期的微生物数量这些因素。
任何被选用的方法必须被适当地验证。
当5．1．3章或5．1．4章联合应用时，可以使用平皿法(pour—plate)，表面涂布平皿计数法(surface—spread)及薄膜滤过法。
供试品的准备抽样计划：抽样必须遵循明确的抽样计划。
抽样计划由一批样品的数量，与不被接受的高污染产品相关的健康危险，产品的特性，预期污染水平等因素而定。
除另有规定外，取10g或10ml样品或制剂，按上述方法预处理。
从原料中或从制剂包装中随机地选取样品。
根据样品(原料或制剂)的特性，必要时可从多个包装中取样，混合后，得到所需检品量。
EP6-2.6.12 非无菌样品的微生物检测定稿
非无菌样品的微生物检测——总好氧活菌计数（EP6）2.6.12 非无菌样品的微生物检测（总好氧活菌计数）这章有两套测试方法。
第一套给出的鉴定方法与原来专论中的方法保持一致。
在专论研究中参考此章，一般采用第一套方法，除非准许使用第二套方法。
第二套方法也是欧洲药典的官方方法，也可以作为参考，值得注意的是在上市授权申请时的使用。
一旦药典中相关专论的修订完成，那么计划用第二套方法代替第一套方法。
第二套方法已经与JP和USP达成一致要求。
A、欧洲药典方法这里描述的方法允许对好氧嗜温细菌和好氧真菌的定量计数。
检测主要是为了确定药典专论中提及的物质是否符合药典专论规定的微生物要求。
当为了此目的而应用该方法时，应遵循下述指导，包括取样数目和按照下述规定进行的结果解释。
这些测试方法可用于《抗微生物防腐剂的有效性》（5.1.3），也可用于原料的质量监控，并与《微生物学特性》（5.1.4）指导原则联合使用。
如果是用于这类目的时，比如生产商对原材料和/或成品的监控或者是工艺验证，那么包括取样数目和结果解释在内的检测过程，都应是生产商与主管部门的协议问题。
本检测必须在特定的条件下进行，以避免供试品在检查过程中受意外污染；同时所采取的措施必须对检测所涉及的微生物无影响。
如果供试品具有抗菌活性，必须充分中和这些活性。
如果实验中用到了灭活剂，必须证明它们对微生物有效并且无毒。
按照专论所述，用薄膜过滤或者平皿计数法测定总好氧活菌数。
最大概率法（MPN）是用于细菌计数的，当没有其他方法时可以采用此法。
对于方法的选择，要根据各种因素，如供试品的特性和预计微生物数目。
所选择的任何方法都必须经过合理验证。
当与5.1.3或5.1.4联合使用时，可以使用倾注平皿法、表面铺展法，或者薄膜过滤法。
供试品的准备取样方法取样必须遵守规定的取样方法，取样方法取决于一些因素如批量、被高度污染后的供试品所引起的健康危害、供试品的性质和预计污染水平。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml，取样应在上述防范污染的措施下进行。
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程一、引言。
微生物限度检查是指在制药生产过程中，对原料药、辅料、中间体、制剂等药品进行微生物检查的一项重要工作。
微生物限度检查的目的是为了保证药品的质量和安全，防止因微生物污染而引起的药品变质和危害患者健康的风险。
本操作规程的目的是规范微生物限度检查的操作流程，确保检查结果准确可靠。
二、适用范围。
本操作规程适用于制药企业进行微生物限度检查的操作人员，包括检验员、操作人员等。
三、术语和定义。
1. 微生物限度，指药品中允许存在的微生物的最大数量，通常以菌落形成单位（CFU）或细菌总数来表示。
2. 微生物限度试验，是指对药品中的微生物进行检查的一种实验方法，包括细菌总数、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霉菌和酵母菌等指标。
3. 标准菌株，指已经鉴定并保存在实验室中的具有代表性的微生物菌株。
四、操作流程。
1. 样品准备。
（1）取样品，按照规定的取样方法，从所检查的药品中取得代表性样品。
（2）样品处理，根据检测要求，对样品进行必要的处理，如稀释、均质等。
2. 培养基制备。
（1）准备培养基，根据检测要求，准备所需的培养基，包括琼脂培养基、液体培养基等。
（2）灭菌处理，对培养基进行高压蒸汽灭菌处理，确保培养基的无菌状态。
3. 菌种接种。
（1）接种方法，根据检测要求，选择适当的接种方法，包括平板法、涂布法等。
（2）接种数量，根据微生物限度试验的要求，按照规定的接种数量接种标准菌株。
4. 培养条件。
（1）温度控制，根据不同的微生物菌种，控制培养的温度，通常为30-35摄氏度。
（2）培养时间，根据微生物限度试验的要求，培养一定的时间，通常为24-48小时。
5. 菌落计数。
（1）观察菌落，根据培养基上的菌落形成情况，进行菌落计数。
（2）结果判定，根据菌落计数的结果，判定样品中微生物的数量是否符合规定的限度要求。
五、质量控制。
1. 内部质量控制，每批次微生物限度试验前，进行内部质量控制，确保实验条件的稳定性和可靠性。
微生物限度检查
微生物限度检查1. 简介微生物限度检查是一项重要的检验项目，用于评估食品、药品、化妆品和环境样品中微生物污染的程度，以确保产品的安全性和质量。
微生物污染可能导致食品腐败、药品失效或产生有害物质，对人体健康造成潜在风险。
本文将介绍微生物限度检查的目的、方法以及常见的微生物指标和其相关要求。
2. 目的微生物限度检查的主要目的是确定样品中存在的微生物数量和种类，以评估产品是否符合相关法规和标准的微生物要求。
通过检查微生物限度，可以判断产品是否受到过度污染，同时也可以用于监控生产过程和验证清洁措施的有效性。
3. 方法3.1 样品处理在进行微生物限度检查之前，需要对样品进行适当的处理。
处理的方式包括稀释、均质和过滤等。
样品处理的目的是消除潜在抑制因素，使微生物能够在培养基上生长。
3.2 培养基和培养条件微生物限度检查通常使用一系列特定的培养基，以促进特定微生物的生长和检测。
常用的培养基包括营养琼脂、大肠杆菌选择性琼脂、沙门氏菌选择性琼脂等。
在选择培养基时，需要根据待测微生物的生长特性和养分要求进行合理选择。
培养条件包括温度、pH值和培养时间等，对于不同的微生物有着不同的要求。
在进行微生物限度检查时，应该根据标准操作程序严格控制培养条件，以确保检测结果的准确性和可比性。
3.3 统计学方法微生物限度检查的结果通常以菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）来表示。
为了获得可靠的结果，需要根据统计学方法进行合理的菌落计数。
常用的统计学方法包括扩展计数法、减少平均法和最概然数法等。
4. 常见的微生物指标和要求微生物限度检查通常包括总大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等指标。
下面是常见的微生物指标和其相关要求：4.1 总大肠菌群总大肠菌群是一类常见的肠道微生物，并不是所有菌群都具有病原性，但它们的检测可以反映样品是否受到了粪便或污水等污染。
常见的检测方法包括最概然数法和膈动法。
食品中总大肠菌群的限度一般为每克或每毫升不得检出。
欧洲药典 10.0 2.6.13 非无菌产品的微生物检测 特定微生物的检测
04/2010:206132.6.13.非无菌产品的微生物检测: 特定微生物的检测（4）1.介绍以下描述的几项检测可用于检测不得存在或限量存在的特定微生物，这些微生物可在规定的条件下检出。
设计这些检测,主要用于鉴定一种物质或制剂是否符合一个已建立的微生物质量规定。
用于此目的时，可按如下规定确定取样数量，判定结果。
如果能证明它等同于药典的方法，可采用替代性的微生物的检测程序（包括自动化的方法）。
2 .一般性操作规程按通用章节2.6.12所述制备样品。
若供试品有抑菌性活性，需按通用章节2.6.12所述尽可能的减少其抑菌性或中和。
如果样品制备过程中使用了表面活性剂，则必须按通用章节2.6.12所述证明表面活性剂对微生物的无毒性和它与所使用的钝化剂的相容性。
3. 培养基的促生长性和抑制性以及检测的适用性必须验证在有供试品存在的条件下检测方法检出微生物的能力。
如果检测过程或产品发生了变化，且该变化可能影响检测的结果，则需证明其适用性。
3-1. 检测菌株的制备使用稳定的标准检测菌株混悬液或按以下规定制备。
采用种子菌培养保持技术，确保原代菌连续传代不超过5次。
3-1-1.需氧的微生物。
将每种细菌检测菌株分别在大豆酪蛋白消化物肉汤培养基或大豆酪蛋白消化琼脂培养基上于30 - 35 ℃培养18 - 24小时。
将白色念珠菌的检测菌株在分别在萨布罗右旋糖琼脂培养基上或萨布罗右旋糖肉汤培养基上于20 - 25 ℃培养2 - 3天。
－金黄色葡萄球菌如：ATCC 6538，NCIMB 9518，CIP 4.83或NBRC 13276；（4）本章已通过药典协调，见章5.8.药典协调－铜绿假单胞菌如：ATCC 9027，NCIMB 8626，CIP 82.118或NBRC 13275；－大肠杆菌如：ATCC 8739，NCIMB 8545，CIP 53.126或NBRC 3972；－肠道沙门菌：血清型为salmonella enterica subsp.enterica serptype typhimutium,如ATTC 14028，或其替代品salmonella enterica subsp.enterica serotype abony如NBRC 100797，NCTC 6017或CIP 80.39;－白色念珠菌如：ATCC 10231，NCPF 3179，IP 48.72或NBRC 1594；用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH 7.2的磷酸缓冲溶液配制供试混悬液。
微生物限度检查操作规程
微生物限度检查操作规程《微生物限度检查操作规程》一、目的微生物限度检查是用于确认产品是否符合微生物水平要求的一种分析方法。
本操作规程的目的是制定微生物限度检查的操作步骤，确保检查结果的准确性和可靠性。
二、适用范围本操作规程适用于所有需要进行微生物限度检查的产品，包括食品、医药和化妆品等。
三、操作步骤1. 准备工作：清洁实验室工作台面和仪器设备，准备所需的培养基和试剂，并确保仪器设备的正常运转。
2. 取样：按照产品的取样标准，从不同批次或不同位置进行取样，并确保取样的代表性。
3. 样品制备：将取样的产品进行样品制备，包括稀释、搅拌和过滤等步骤，以便于后续的微生物检查。
4. 培养：将样品接种在适当的培养基上，根据不同的微生物种类和要求进行培养，并进行恒温培养一定时间。
5. 计数：在培养一定时间后，对培养基上的菌落进行计数，并按照标准方法进行结果的记录和确认。
6. 结果判定：将检查结果与产品的微生物限度标准进行比对，根据结果作出是否合格的判定。
7. 结果记录：将微生物限度检查的结果进行记录，包括样品信息、操作步骤、检查结果和判定等信息，并将结果报告给相关部门或供应商。
四、注意事项1. 操作人员应具备一定的微生物检测知识和操作技能，严格按照操作规程执行。
2. 实验室应保持清洁、卫生，并进行定期消毒和验证。
3. 实验室设备应定期维护和校准，确保设备的准确性和可靠性。
4. 所使用的培养基和试剂应符合相关标准，存放在干燥、阴凉、避光的环境中。
5. 检查结果应及时报告，并根据结果采取相应的控制措施。
以上就是《微生物限度检查操作规程》的主要内容，希望能够帮助大家更好地进行微生物限度检查，确保产品质量和安全。
欧洲药典EP6.0细菌内毒素 (中文)
2.6.14 细菌内毒素本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus——血细胞提取物（amoebocyte lysate）制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。
该检查包括三种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；第二种为浊度法（基于内源性底物断裂后，产生的浊度变化）；最后一种为显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
这一章阐述了下面6种方法：方法A：凝胶法：限度试验方法B：凝胶法：半定量试验方法C：动态浊度试验方法D：动态显色法方法E：终点显色法方法F：终点浊度法检测时，可用6种方法的任一种进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以专论中的方法A的测定结果为准。
试验操作过程应防止内毒素的污染。
仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
注：这一章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。
内毒素储备标准溶液的制备用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRP。
内毒素以国际单位（IU）表示。
IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。
注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。
根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。
内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。
得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。
供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。
微生物限度检查操作规程
微生物限度检查操作规程1、目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作以保证结果的准确性。
2、范围适用于成品、原辅料、包材及纯化水的检验。
3、职责质检部负责制定本规程，质检部微生物限度检查人员负责本规程的具体实施。
4、工作程序4.1微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物标准时，应按规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
另外，本方法不适于活菌制剂的检查。
本试验应在洁净工作台高效层流保护下进行。
4.1.1计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
4.1.2计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
菌液制备按表1 规定程序培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3〜5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0. 9%无菌氣化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2〜8℃,在验证过的贮存期内使用。
阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
欧洲药典EP6.0细菌内毒素 (中文)
2.6.14 细菌内毒素本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus——血细胞提取物（amoebocyte lysate）制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。
该检查包括三种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；第二种为浊度法（基于内源性底物断裂后，产生的浊度变化）；最后一种为显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
这一章阐述了下面6种方法：方法A：凝胶法：限度试验方法B：凝胶法：半定量试验方法C：动态浊度试验方法D：动态显色法方法E：终点显色法方法F：终点浊度法检测时，可用6种方法的任一种进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以专论中的方法A的测定结果为准。
试验操作过程应防止内毒素的污染。
仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
注：这一章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。
内毒素储备标准溶液的制备用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRP。
内毒素以国际单位（IU）表示。
IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。
注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。
根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。
内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。
得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。
供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。
[EP}EP6 2.6.1 无菌检查 中文版
2.6 生物检查2.6.1 无菌检查无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
在本文的最后，有如何采用检查法检查无菌的指导。
微生物污染的预防无菌检测试验应该在无菌的环境下进行。
通过预防，我们可以避免微生物对试验的污染。
同时，这些预防也应该不会对检查的微生物有影响。
工作的环境应该定期进行检查，进行合适的对照试验（遵循比如欧共体指示中的或GMP中的要求）。
培养基及孵化温度培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的通过生长促进试验的现成的培养基。
以下培养基适用于无菌检查。
硫乙醇酸盐流体培养基是厌氧菌检查的首选培养基，同时，它也可用于需氧菌检查。
大豆消化酪蛋白脉琼脂培养基适用于霉菌和需氧菌检查。
也可以使用。
其他通过细菌生长促进试验以及验证试验的培养基。
硫乙醇酸盐流体培养基L -胱氨酸 0.5克 颗粒琼脂（水分含量不超过百分之十五） 0.75克 氯化钠 2.5克 葡萄糖 一水/无水 5.5克/5.0克 酵母膏（水溶性） 5.0克 胰酶蛋白胨 15.0克 琉基乙酸钠 0.5克 或琉基乙酸 0.3毫升 新配制的刃天青钠溶液 1.0毫升 （1 g / L的 刃天青钠）纯水 1000毫升 灭菌后培养基的pH值应为 7.1 ± 0.2将L -胱氨酸、琼脂、氯化钠、葡萄糖、酵母膏以及胰酶蛋白脉与纯水混合，加热至完全溶解。
然后往溶液中加入琉基乙酸钠或琉基乙酸使溶解，必要时，加入1M氢氧化钠调节溶液的pH，使灭菌后的pH 值为7.1士0.2。
如需过滤，再次加热溶液不必沸腾，趁热用浸湿的滤纸过滤，加刃天青钠溶液并混和均匀，将培养基转移至适宜的可给出培养基表面深度比例的容器中，这样，在培养期结束时，显示的氧化层颜色变化不得超过培养基深度的1/2。
采用有效的方法对培养基进行灭菌。
如果贮存，应贮存在温度介于2-25℃、无菌密闭的容器中。
欧洲药典EP6.0-2.6.12微生物限度
2.6.12非无菌产品的微生物限度检查（总的需氧菌菌落计数）本章包括两种检验方法。
第一种方法给出的是测定适用性的参考方法。
因些在一个专论中依照本法就意味着依从第一种方法，除非特别指出要使用第二种方法。
第二种方法也是欧洲药典的官方组成部分，并且值得注意的是第二种方法特别适用于销售认可。
一旦该相关专论被修订就意味着将用第二种方法替代第一种方法。
第二种方法包含日本药典和美国药典的共同部分使其能够协调。
A．欧洲药典方法该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是以审疑的态度为了测定一种物质按照欧洲药典的检测方法是否符合微生物的特定限定要求。
如果是以这种目的来测定的话，根据下述方法，包括所需的样品数和按照下面方法来解释结果。
该法也用来测定药典所描述的抗菌保留的有效性（5.1.3）。
此外，该法也可以用来监测原料质量同时也可以用来作为微生物质量检测的指导方针（5.1.4）。
如果是用来指导以下目的，如生产厂家的原料检测和/或终产品的检测或终点判定，则包括所需样品数和结果解释的试验方法就必须在生产厂家和主管当局之间达成一致。
执行该方法所设计的实验条件就必须避免所测产品受到意外污染。
避免污染所采取的措施不侧够影响任何所测的微生物。
如果所测产品有抗菌活性，则该产品活性必须补充分中和掉。
如果因为该种目的使用灭活剂则必须证明该灭活剂对微生物的有效性和无毒性。
测定总的需氧微生物数通过微孔滤膜法或专论中所描述的平板菌落计数法。
当没有其它方法可以釆用来测定细菌数时保留最大可能数（Most Probable Number, MPN）.选择哪种应该根据产品的特性和可预计的微生物数等因素来选择。
任何选择的方法必须通过合理的验证。
当根据5.1.3或5.1.4使用时，可以使用平板浇注法和表面扩散法，和微孔滤膜法。
样品制备：抽样检验方法：所选样品必须遵循抽样样品规则。
抽样检验的结果依赖于下列因素：如样品批号，不可接受的高污染产品的健康危害，产品特性，可预料的污染程度等。
欧洲药典EP6.0-2.6.12微生物限度
欧洲药典EP6.0-2.6.12微生物限度2.6.12非无菌产品的微生物限度检查（总的需氧菌菌落计数）本章包括两种检验方法。
第一种方法给出的是测定适用性的参考方法。
因些在一个专论中依照本法就意味着依从第一种方法，除非特别指出要使用第二种方法。
第二种方法也是欧洲药典的官方组成部分，并且值得注意的是第二种方法特别适用于销售认可。
一旦该相关专论被修订就意味着将用第二种方法替代第一种方法。
第二种方法包含日本药典和美国药典的共同部分使其能够协调。
A．欧洲药典方法该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是以审疑的态度为了测定一种物质按照欧洲药典的检测方法是否符合微生物的特定限定要求。
如果是以这种目的来测定的话，根据下述方法，包括所需的样品数和按照下面方法来解释结果。
该法也用来测定药典所描述的抗菌保留的有效性（5.1.3）。
此外，该法也可以用来监测原料质量同时也可以用来作为微生物质量检测的指导方针（5.1.4）。
如果是用来指导以下目的，如生产厂家的原料检测和/或终产品的检测或终点判定，则包括所需样品数和结果解释的试验方法就必须在生产厂家和主管当局之间达成一致。
执行该方法所设计的实验条件就必须避免所测产品受到意外污染。
避免污染所采取的措施不侧够影响任何所测的微生物。
如果所测产品有抗菌活性，则该产品活性必须补充分中和掉。
如果因为该种目的使用灭活剂则必须证明该灭活剂对微生物的有效性和无毒性。
测定总的需氧微生物数通过微孔滤膜法或专论中所描述的平板菌落计数法。
当没有其它方法可以釆用来测定细菌数时保留最大可能数（Most Probable Number, MPN）.选择哪种应该根据产品的特性和可预计的微生物数等因素来选择。
任何选择的方法必须通过合理的验证。
当根据5.1.3或5.1.4使用时，可以使用平板浇注法和表面扩散法，和微孔滤膜法。
样品制备：抽样检验方法：所选样品必须遵循抽样样品规则。
微生物限度检验操作指导书
微生物限度检验操作指导书1.0目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。
2.0适用范围适用于公司微生物限度检验。
3.0职责化验室负责人：对本规程的实施负责。
检验人员：严格按照本规程执行检验操作。
4.0参考文件《中国药典》2015版5.0抽样照《取样标准操作规程》进行。
6.0内容6.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。
检查时，按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
6.1.1设备、仪器及用具6.1.1.1设备微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱（30～350C）、生化培养箱（20～250C）、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。
6.1.1.2仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。
6.1.1.3用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.1.2试液6.1.2.1消毒液A．0.1%新洁尔灭溶液B．75%乙醇溶液6.1.2.2稀释液、试剂及配制A．pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。
B．聚山梨酯80C．无菌十四烷酸异丙酯D．pH6.8无菌磷酸盐缓冲液6.1.3培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基6.1.4操作方法6.1.4.1试验前准备6.1.4.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头（1ml、10ml）、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。
每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
6.1.4.1.2开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。
微生物检测-EP
2.6.12无菌产品的微生物检测：微生物计数检测1.简介下述方法能够对在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌进行定量计数。
该检查主要是为了确定某种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。
当以此为目的时，按照下面给出的规定进行，包括所需的样品数量以及按照下文规定的要求对结果进行描述。
此方法不适用于微生物作为有效成分的产品。
若使用了其他的微生物程序，包括自动方法，则应提供其等同于药典方法的证明。
2.一般步骤检测必须在设定的条件下进行，以避免外来的微生物污染。
为避免此污染所采取的预防措施必须不影响微生物在检测中将要表现出的特性。
若产品具有抗菌活性，则必须除去或中和。
如果因此而是用了钝化剂，则必须证明其有效性及对微生物无毒性。
如果在处理样品时使用了表面活性剂，必须证明其对微生物无毒性及与证明其所使用的钝化剂的兼容性。
3.计数方法用薄膜过滤法和平皿计数法。
最大机率法（MPN）一般来说最不准确的微生物计数方法。
但是对于生物负荷非常小的确定的产品来说可能是最适合的方法。
对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素。
所选择的方法必须能够用足够的样品来判断出其是否符合标准规定。
必须证明所选择的方法的适用性。
4.促进生长试验、计数方法的适用性和阴性对照4.1总体要求必须证明检测方法检测产品中微生物的能力。
如果检测操作或产品有变更，且该变更能够影响检测结果，则必须证明其适用性。
4.2菌株的准备使用菌株的标准稳定悬浮液或参照以下方法制备。
使用种子库维护系统（种子库系统），以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物不大于5个片段。
按照表2.6.12-1的描述分开培养每一细菌和真菌的菌株。
使用PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或PH7.2硫酸盐缓冲液制备悬浮液。
如果要制备A.brasiliensis孢子悬浮液，可在缓冲液中加入0.05%聚山梨酯80。
配好的悬浮液需在2小时内使用，如果在2-8℃贮存，则在24小时内使用即可。
EP2.6.12非无菌药品微生物检验-微生物总数试验
2.6.12 非无菌产品的微生物检查-微生物计数试验（B.HARMONISED METHOD欧日美三方协调方法）1 介绍本试验适用于可以在有氧环境下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数。
本试验方法主要是用于一种物质或者制剂的微生物检测，以判断它的微生物质量是否符合已建立的质量标准。
如本方法用于上述目的的话，需要按下面的描述进行操作，包括取样量和结果判断。
本方法不适用于以活微生物为活性成分的产品。
如果经证明，其他的微生物检查方法（包括自动化方法）和药典方法相当，也可以使用。
2 一般要求在能够防止外来微生物污染的环境条件下进行检测。
所采取的防微生物污染措施必须对待测产品中已有的微生物无影响。
如果待测产品具有抑菌活性，则应该尽可能地将抑菌活性成分除去或者中和。
如果使用灭活剂，则必须证明该灭活剂的功效及其对微生物不存在毒性。
如果样品制备使用了表面物质，应证明其对微生物没有毒性以及其与使用的灭火剂的兼容性。
3 计数方法按照规定使用平皿法或薄膜过滤法。
最大可能数法(MPN)是准确度最低的方法，但是对于微生物负荷量很低的产品确是最适合的方法。
方法的选择取决于产品的性质和规定的微生物限度等因素。
所选用的方法必须能够测定足够的样品量以判断产品的微生物质量是否与质量标准相符合。
同时必须证明所选用方法的适用性。
4培养基促生长试验，计数方法适用性和阴性对照4.1 总则必须证明所选用的方法具有能够检测待测物质中微生物的能力。
如果试验条件或者产品发生了变化并可能影响到检测结果，则方法的适用性需要确认。
4.2 试验菌株的制备使用稳定的标准菌悬液或者按照下述方法进行制备。
应该采用种批培养维护技术（种源批次系统）以保证用于接种的活微生物的传代次数不超过五代。
按照表2.6.12-1所示培养每一种细菌和真菌菌株。
使用pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液或者pH 7.2磷酸盐缓冲液配制试验用悬液；对于制备黑曲霉孢子悬液，可在缓冲液中加入0.05％聚山梨醇酯80。
微生物限度检查法操作规程
2023 WORK SUMMARY
微生物限度检查法操 作规程
REPORTING
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目录
• 介绍 • 微生物限度检查法操作规程 • 注意事项 • 常见问题及解决方法 • 未来展望
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培养条件
设定适宜的培养温度、湿 度、pH等条件，以保证微 生物的正常生长。
培养时间
根据不同微生物的生长周 期和特点，确定适宜的培 养时间，以保证微生物充 分生长。
微生物培养
培养基选择
根据待检测微生物的种类 和数量，选择适宜的培养 基，确保能够满足微生物 生长的需求。
培养条件
设定适宜的培养温度、湿 度、pH等条件，以保证微 生物的正常生长。
实验环境防护
实验过程中应保持室内空气流通，避 免尘埃、细菌等污染。
实验器材防护
实验器材应保持清洁、干燥、无菌， 使用前应进行灭菌处理。
实验试剂防护
实验试剂应妥善保管，避免污染和交 叉污染。
实验后的清理与消毒
实验器材清理
实验结束后，应对实验器材进行 清洁、灭菌处理，并妥善保管。
实验环境清理
实验结束后，应对实验环境进行清 洁、消毒处理，保持室内空气流通。
行微生物检测和控制。
PART 02
微生物限度检查法操作规 程
PART 02
微生物限度检查法操作规 程
样品采集与处理
01
02
03
采样原则
在无菌条件下进行，避免 交叉污染和环境对样品的 污染。
采样方法
根据不同样品类型，采用 适宜的采样方法，如随机 采样、分层采样等。
样品处理
将采集的样品进行预处理， 如粉碎、混合、稀释等， 以便进行后续的微生物培 养和计数。
引用标准 EP2.6.12和2.6.13
目的：建立微生物限度检查法标准操作程序。
2 范围：用于原辅料、包装材料、中间产品以及成品的微生物限度检验。
3 责任:质量部。
4 内容4.1 引用标准: EP2.6.12和2.6.134.2 方法提要:通过对试样在不同条件下的微生物培养，检查试样受到微生物污染程度情况。
微生物限度检查法系检查非灭菌原料药及其原、辅料受到微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30℃～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为20℃～25℃。
检验结果的报告以1g、1mL、10 mL或10cm2为单位报告。
4.3样品的制备取样方法:产品取样必须依照规定的采样方法取样。
在每批样品中取三个样品并分别检查。
4.3.1水溶性产品：在pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中稀释10g 或10ml产品。
一般准备1：10稀释倍数，作为供试液。
不过，根椐产品的特性或必要的敏感性也可做成其它的比例的。
如果已知此产品有抗微生物活性，可加入灭活剂到稀释液中。
如果需要调节pH值，调至pH值约为7，如果需要进一步稀释，用相同稀释液进行系列10倍稀释。
4.4阴性对照为了确定实验条件对检测结果无影响，要用稀释剂代替供试液进行阴性对照试验。
应无菌生长。
对于不合格的阴性对照结果应进行调查。
4.5培养基促生长试验（阳性对照）适用于每一批购买的现成培养基，每一批使用脱水培养基制备的培养基或者按照指定成分配制的培养基。
按照表1所示，接种少量的菌种（不多于100 CFU）于大豆酪蛋白胰酶消化物肉汤和大豆酪蛋白胰酶消化物琼脂培养基中，每一份菌种接种于各自的培养基上。
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2.6.12非无菌产品的微生物限度检查（总的需氧菌菌落计数）本章包括两种检验方法。
第一种方法给出的是测定适用性的参考方法。
因些在一个专论中依照本法就意味着依从第一种方法，除非特别指出要使用第二种方法。
第二种方法也是欧洲药典的官方组成部分，并且值得注意的是第二种方法特别适用于销售认可。
一旦该相关专论被修订就意味着将用第二种方法替代第一种方法。
第二种方法包含日本药典和美国药典的共同部分使其能够协调。
A．欧洲药典方法该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是以审疑的态度为了测定一种物质按照欧洲药典的检测方法是否符合微生物的特定限定要求。
如果是以这种目的来测定的话，根据下述方法，包括所需的样品数和按照下面方法来解释结果。
该法也用来测定药典所描述的抗菌保留的有效性（5.1.3）。
此外，该法也可以用来监测原料质量同时也可以用来作为微生物质量检测的指导方针（5.1.4）。
如果是用来指导以下目的，如生产厂家的原料检测和/或终产品的检测或终点判定，则包括所需样品数和结果解释的试验方法就必须在生产厂家和主管当局之间达成一致。
执行该方法所设计的实验条件就必须避免所测产品受到意外污染。
避免污染所采取的措施不侧够影响任何所测的微生物。
如果所测产品有抗菌活性，则该产品活性必须补充分中和掉。
如果因为该种目的使用灭活剂则必须证明该灭活剂对微生物的有效性和无毒性。
测定总的需氧微生物数通过微孔滤膜法或专论中所描述的平板菌落计数法。
当没有其它方法可以釆用来测定细菌数时保留最大可能数（Most Probable Number, MPN）.选择哪种应该根据产品的特性和可预计的微生物数等因素来选择。
任何选择的方法必须通过合理的验证。
当根据5.1.3或5.1.4使用时，可以使用平板浇注法和表面扩散法，和微孔滤膜法。
样品制备：抽样检验方法：所选样品必须遵循抽样样品规则。
抽样检验的结果依赖于下列因素：如样品批号，不可接受的高污染产品的健康危害，产品特性，可预料的污染程度等。
除了特别说明外，取10g或10ml物质或制剂检测，釆取上面提到的预防措施。
从大批样品中随机选择样品或从制剂容器中随机抽取。
如有必要，为了获得所需的样品，将容器中大量的内容物混匀以保证每一份样品都能包含在内，是否要这样做依赖于所检测物质或制剂的性质。
现举例说明适用于产品的抽样检验方法，而在该法中关于微生物分布状态的同质性方面可能存在问题，该例包括三类抽样检验方法。
在该例中有从每批中分别抽取五份样品。
以下是三种方法：（i）可接受的样本：例如：样品包括不少于m CFU(菌落数)/g or ml, m 代表在相关专论中特定指出的限度。
（ii）边缘样本：例如：大于m CFU 而小于10m CFU/g or ml.（iii）有缺陷的样本：例如：包含大于10m CFU/g or ml.水溶性产品：溶解或稀释10g 或10ml待测产品于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）或另一种合适的液体中。
一般来说要准备好1/10的稀释液。
但是，根据产品特性或所需的敏感性可以考虑其它比例的溶液。
如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。
如有必要，调节pH 到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。
不溶于水的非脂溶性产品：将10g 或10ml待测产品悬浮于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或另一种合适的液体中。
一般来说要准备好1/10的稀释液，但根据一些产品特性或所需的敏感性需要更大体积的液体。
可以添加合适的表面活性剂如1g 聚山梨醇酯80来帮助不易润湿的底物悬浮液稳定。
如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。
如有必要，调节pH到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。
脂溶性产品：取10g 或10ml待测产品与不多于一半质量的灭菌聚山梨醇酯80或另一种灭菌表面活性剂混匀，如有必要可加热，但不超过40℃，如有例外情况下也不应高于45℃。
仔细混匀，如有必要可以维持温度在水浴中或恒温器中。
加充足的预热过的氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液制成一倍或10倍原产品的稀释液。
仔细混匀同时维持温度使其能在最短时间内形成乳液状，但无论如何不要超过30分钟。
此外必须准备一系列10倍氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液包含有合适浓度的灭菌聚山梨醇酯80或其它灭菌表面活性剂。
贴剂：用无菌镊子除去10批贴剂的表面保护膜（“线性释放”），将它们平放，粘性表面向上放于无菌玻璃或塑料皿中。
如有必要，粘性表面用无菌纱布（或纤维聚合物过滤膜）覆盖，然后转移这10批到最少500ML的氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液中，该溶液添加有适当的灭活性如聚山梨醇酯80和/或卵磷酯。
剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）。
用同样的方法准备另10批样品，将它们放在最少500ML肉汤稀释液D中，剧烈振荡至少30分钟（得制备液B）。
样品检测滤膜法：所用滤膜膜孔直径不大于0.45微米，并且滤膜高效截留细菌的能力已知。
选择该种滤膜是因为用这种方法使细菌仍然侧够保持高效性同时不影响所测样品的成分。
例如硝酸纤维素滤膜可以使用于水溶液，油溶液和弱醇溶液。
醋酸纤维素滤膜可以用于弱醇溶液。
设计过滤器的目的就是转移培养基中的过滤物。
按照样品制备方法立即转移适量的制备样品（最好取有代表性的1g样品，如果所预期的菌落数多可以少点）分别到两层滤膜和滤器上。
每个过滤器洗三次，每次用大约100ml合适的液体如氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液。
在该溶液中可以加入适当的表面活性剂如聚山梨醇80或抗菌试剂的灭活性。
如果用于验证，则不少于三次洗涤。
如果主要是为了测定列举的细菌，则转移一个滤膜到合适的琼脂糖表面如介质B或其它介质上，如果主要是为了测定列举的真菌类，则转移滤膜到适当的琼脂糖表面如介质C。
培养琼脂糖介质B的平板在30-35℃，介质C 的平板在20-25℃，培养5天，除非在短期内可得到可靠的菌落数。
平板计数法要选择最多菌落数不多于100个菌落的平板，计算每克或每ml产品中的菌落数。
当检测贴剂时，通过两层的无菌滤膜分别过滤50ml的制备液A。
将一个滤膜放置到琼脂糖B介质中用来计算总的需氧微生物菌落数，另一个滤膜到琼脂糖C 用来计算真菌的菌落数。
平板菌落计数法a.平板灌注法利用直径9cm的有盖培养皿，向每个培养皿中加1ml上述按样品制备方法制备的样品，然后再加15-20ml适合培养细菌的液态的琼脂糖培养基（如介质B），或15-20ml适合培养真菌的液态的琼脂糖培养基（如介质C），在不高于45℃的条件下培养。
如果使用更大的有盖培养皿，琼脂糖的量要相应增加。
对每一种介质，每种浓度的稀释液要准备至少2个有盖培养皿。
除非在短期内可以得到较好的菌落，一般情况下将平板在30-35℃下培养5天（真菌在20-25℃下培养5天）。
对每一种稀释液选择一种相应的平板，最多菌落数不少于300（对于真菌不少于100）。
计算菌落平均值和计算每克或每ML中菌落形成数。
b.表面延伸法利用直径9cm的有盖培养皿，在每个平皿中，45℃下，加15-20ml适合培养细菌的液态的琼脂糖培养基（如介质B），或15-20ml适合培养真菌的液态的琼脂糖培养基（如介质C），然后使其固化。
如果使用更大的有盖培养皿，琼脂糖的量要相应增加。
干燥平板，例如在层流柜中或恒温培养箱中。
涂定量但不超过0.1ML的按照上述制备方法制取的样品于上述平板的表面上。
对每一种介质，每种浓度的稀释液要准备至少2个有盖培养皿。
同平板灌注法一样培养和计算菌落数。
最大可能数（MPN）计算法表2.6.12.1－细菌的最大可能数菌通常会得到不可信的结果。
因为上述原因，MPN法通常只有在没有其它合适的方法可用时才用来测定细菌。
如果该法可行，则方法如下：按照样品制备法准备至少3个梯度的10倍稀释液。
对每一个稀释液，在3个试管中分别接种1G/ML的样品液在9-10 ML合适的液体介质中（如肉汤介质A）。
如有必要，表面活性剂如聚山梨醇酯80或抗生素试剂灭活剂可以加到该介质中。
因此如果准备了3个梯度的稀释液则需要接种9个试管。
所有试管在30-35℃下培养5天。
记录每种稀释液的试官微生物的生长情况。
如果根据所测产品特性结果不好读或不确定，可以在同样的肉汤中再次培养，或在合适的琼脂糖介质中培养（如琼脂糖介质B），在同样的温度下培养18-24h,然后使用该结果。
从表2.6.12-1表格中确定每克或每ML产品中细菌的最大可能数。
高效的培养介质和有效的计数方法将合适的细菌试验株分别在含有合适的液态介质（如肉汤介质A）的容器中在30-35℃下培养18-24h。
真菌试验株在合适的琼脂粮介质（如无抗生素的介质C）中在20-25℃下培养48小时如白色念珠菌，对曲霉菌在20-25℃下培养7天。
金黄色葡萄球菌例如ATCC6538（NCIMB9518,CIP4.83）大肠杆菌例如ATCC8739（NCIM8545,CIP53.126）枯草芽孢杆菌例如ATCC6633（NCIM8054,CIP52.62）白色念珠菌例如ATCC10231（NCPF3179，IP48.72）黑曲霉菌例如ATCC10231（IMI149007，IP1431.83）用每ML氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液中大约含有100个形成菌落的悬浮液作为对照品。
用分别含有各种微生物的悬浮液作为计数法的控制，悬浮液分别加有被测产品和不加被测产品。
当用微孔滤膜法或平板计数法时，对于任何测定的微生物接种所得计算值不相差5倍。
对于从MPN法接种所得的计算值要在95％可信限度内。
为了检验介质和稀释液的无菌状态，用无菌的氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液作为测试液。
在其上必须没有微生物生长。
结果解释细菌数与琼脂糖介质B中的菌落平均数相等。
真菌数与琼脂糖介质C中的菌落平均数相等。
总的需氧菌数是上述两种菌之和。
如果有证据表明同种类型的微生物在这两种介质中生长则结果就是正确的。
MPN法所计算的值是细菌数。
专论中所规定的限度解释如下：102微生物：最大可接受限度：5*102103微生物：最大可接受限度：5*103等。
如果使用抽样方式，如三步抽样法过程如下：对每五个样品分别计算总的需氧菌数。
如果按照下面条件操作，则物或制备液通过了测试：(i)没有单个的总需氧菌数超过了所预计限度的10倍或更多（如没有不可接受的样品）(ii)不超过2个的总需氧数在预计限度和10倍限度之内（如没有两个边缘样品）所推荐使用的溶液和培养介质将2.6.13中讲到。
B．协调法：非无菌产品的微生物限度试验：微生物列举试验1.简介：该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制备液是否符合微生物质量已制定的规定。