微生物限度检查法

在30～35℃培养箱内倒置培养48h， 取出检查。 3个平板生长的平均菌落 数不超过1个。
无菌室操作台或净化工作台要定期
检测其洁净度，应达到A级。净化工 作台中的高效及中效过滤器应根据 检测情况，必要时予以更换处理。
1.6消毒处理
无菌室应在每次操作
前、后均用消毒液擦拭操作台及
可能污染的死角。开动层流净化
4.1.4 乳酸、15%过氧乙酸（交替用于对洁净 室熏蒸消毒）
稀释剂和试剂 4.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液 4.2.2 无菌聚山梨酯 -80（对含油性 供试品具有助溶作用） 4.2.4 pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲 液 4.2.5 pH6.8磷酸盐缓冲液 4.2.6 pH7.6磷酸盐缓冲液等
保存 供试品在检验之前，应保存在阴 凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供 试品内污染菌因保存条件不妥引起 致死、损伤或繁殖。
2
2.1
2.2
供试品在检验之前，应保持原包 装状态，严禁开启。包装已开启的 样品不得作为供试品。
3检验量 即一次试验所用的供试品量（g、ml
或
c㎡）。 除另有规定外，一般供试品的检验量为 10g 或10ml；膜剂为100c㎡；贵重药 品、微量包装药品的检验量可以酌减。 要求检查沙门菌的供试品，其检验量应 增加20g 或20ml（其中10g或者10ml 用于阳性对照试验）。
2
开启无菌室紫外杀菌灯和空气过 滤装置，并使其工作不低于30min。 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外 杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。 再用消毒液洗手或用乙醇棉擦手， 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
3
4
操作前先用乙醇棉球擦手，再用 碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦 拭供试品瓶、盒、袋等的开口处 周围，待干后用灭菌的手术镊或 剪刀将供试品启封。
无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗
消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处 应呈凹弧形无缝隙，不留死角。操作间 内不应安装下水道。
操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，
出入操作间和缓冲间的门不应直对。

无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内 光照应分布均匀，光照度不低于 300 勒克斯。 缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯 （２～２ .5W/m3），紫外杀菌灯应距实验台 面高度不超过1M，并应定期检查辐射强度， 不得低于70μW/cm2（１M距离）。不符合要 求的紫外杀菌灯应及时更换。
1.4 缓冲间
缓冲间内应有洗手盆，无菌 衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应 放置培养箱和其他杂物。
1.5洁净
级 别 及 检 查方法 通常采用尘 粒 数 及 浮 游 菌 数 或 沉 降 菌 数测 定 法。
洁净室（区）空气洁净度级别表
洁净度级别 悬浮粒子最大允许数/立方米
静态
≥0.5μ m A级 B级 3,520 3,520 ≥5μ m 20 29 ≥0.5μ m 3,520 352,000
或药物天平，pH计等
2.2
玻璃器皿
锥形瓶、烧杯、研钵、培养皿、量
筒、试管及塞、移液管等
玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留
抗菌物质吸管口上端距 0.5cm 处塞
入约 2cm 的适宜疏松棉花，置吸管 桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、 试管均应加棉塞或硅胶塞，再用牛 皮纸包扎。玻璃器皿，均于 160℃ 干热灭菌 2h 或高压蒸汽 121℃灭菌 30min，烘干备用。
4.2
5
培养基
营养琼脂培养基 5.2 玫瑰红钠琼脂培养基 5.3 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 5.4 胆盐乳糖培养基 5.4 MUG培养基
5.1
培养基制备应注意： （1）采用干燥培养基，按说明配制， 应对灭菌后的培养基 pH 值进行校验。
若为自配培养基，原料应挑选，琼 脂凝固力应测定，以确定配制时琼 脂用量。试剂规格应为化学纯以上 的试剂。
一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一
个或多个菌细胞形成。因此供试品中所 测的菌落数实际为菌落形成单位数 （colony forming unit ，CFU），而 不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。
二、设备

1 无菌室 1.1结构和要求 无菌室应采光良好、避免潮 湿、远离厕所及污染区（面积不超过10m2， 高度不超过 2.4m ）由缓冲间（ 2 个）、操作 间组成。

(4)气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1 小时，取出， 迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻 一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓 缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适 量的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶 性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取 相当于10g或10ml 的供试品，再稀释成1∶10 的供 试液。 (5)贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴膏剂的保护层，放置在无 菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多 孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴 剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面 活性剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中，用 力振荡至少30 分钟，制成供试液。贴膏剂也可以其 他适宜的方法制备成供试液。
(2)膜剂供试品 取供试品100c㎡，剪碎，加100ml 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀 释液），浸泡，振摇，作为1∶10 的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液 （用于肠溶制剂）或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲 液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水 浴中，振摇，使溶解，作为1∶10 的供试液。

2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方 法，混匀，作为1∶10 的供试液。必要时加 适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加 温使供试品分散均匀。
3.需用特殊供试液制备方法的供试品

(1)非水溶性供试品 方法1 取供试品5g（或5ml），加至含溶化的 （温度不超过45℃）5g 司盘80、3g 单硬脂酸甘油 酯、10g 聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中，用无菌 玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0 无菌氯化 钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品 充分乳化，作为1∶20 的供试液。 方法2 取供试品10g，加至含20ml 无菌十四 烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可 增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品 溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液100ml，振摇5～10 分钟，萃取，静置使油水 明显分层，取其水层作为1∶10 的供试液。

供试液的制备
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物 学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试 液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不 应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培 养基，不得超过1 小时。

除另有规定外，常用的供试液制备方法
如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为 1∶10 的供试液。油剂可加入适量的无 菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。水溶 性液体制剂也可用混合的供试品原液作 为供试液。

4 试液 4.1消毒液 4.1.1 0.1%新洁尔灭、 0.2%过氧乙酸、 75% 乙醇溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。 4.1.2 3%的来苏尔溶液、5%石碳酸溶液 (配 好后装入玻璃消毒缸内， 供消毒带菌吸管用； 当菌液污染台面或地面时，将其倾覆其上) 4.1.3 75%乙醇溶液


A级
B级 C级 D级
<1
10 100 200
<1
5 50 100
<1
5 25 50
<1
5 － －

例如：沉降菌 无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动 层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂 平板3个(经30～35℃预培养48h，证明无 菌落生长。)以无菌方式（或经传递箱） 移入操作间，置净化台左、中、右各1个， 开盖，暴露30min后将盖盖上。

细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计 数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国 际上许多国家常用的一种方法。 该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼 脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母菌（玫 瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形 成一个独立可见的菌落为计数依据。


测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌 （一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和 兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不 包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有 特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。
微生物限度检 查法
目录
一、简述 二、设备
三、供试品抽样、保存及检验量
四、实验
五、控制菌
一、简述 微生物限度检查的意义

细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单 位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定 药品受到微生物污染程度的重要指标，也是 对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、 工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进 行卫生学评价的综合依据之一。
动态
≥5 μ m 20 2,900
,000
2,900
29,000
3,520,000
不作规定
29,000
不作规定
洁净度 浮游菌 级别 cfu/m3
沉降菌 （φ 90mm） cfu /4小时 (2)
表面微生物 接触碟 （φ 55mm） cfu /碟 5指手套 cfu /手套
装置，同时用紫外杀菌灯照射
30min。
2.
2其他设备
净化工作台、电热恒温水浴箱、培
养箱、电热恒温干燥箱，微波炉 （或其他适宜加热装置）、电冰箱、 空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要 进行灭菌效果检查并应定期请有关 部门检定）、薄膜过滤装置、电动 匀浆仪等。