微生物限度检查法

动态
≥5 μ m 20 2,900
C级
D级
352,000
3,520,000
2,900
29,000
3,520,000
不作规定
29,000
不作规定
洁净度 浮游菌 级别 cfu/m3
沉降菌 （φ 90mm） cfu /4小时 (2)
表面微生物 接触碟 （φ 55mm） cfu /碟 5指手套 cfu /手套

供试液的制备
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物 学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试 液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不 应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培 养基，不得超过1 小时。

除另有规定外，常用的供试液制备方法
如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为 1∶10 的供试液。油剂可加入适量的无 菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。水溶 性液体制剂也可用混合的供试品原液作 为供试液。
(2)膜剂供试品 取供试品100c㎡，剪碎，加100ml 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀 释液），浸泡，振摇，作为1∶10 的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液 （用于肠溶制剂）或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲 液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水 浴中，振摇，使溶解，作为1∶10 的供试液。
2
开启无菌室紫外杀菌灯和空气过 滤装置，并使其工作不低于30min。 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外 杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。 再用消毒液洗手或用乙醇棉擦手， 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
3
4
操作前先用乙醇棉球擦手，再用 碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦 拭供试品瓶、盒、袋等的开口处 周围，待干后用灭菌的手术镊或 剪刀将供试品启封。

细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计 数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国 际上许多国家常用的一种方法。 该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼 脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母菌（玫 瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形 成一个独立可见的菌落为计数依据。


测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌 （一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和 兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不 包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有 特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。

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检验时，应从2
个以上最小包装单 位中抽取供试品，大蜜丸还不得少 于4丸，膜剂还不得少于4 片。 一般应随机抽取不少于检验用量 （两个以上最小包装单位）的3 倍 量供试品。
四、实验
1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀 浆杯、试管、吸管（ 1ml 、 10ml ）、量筒、 稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品 必须事先计划，准备足够用量，避免操作中 出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸） 去掉。

2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方 法，混匀，作为1∶10 的供试液。必要时加 适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加 温使供试品分散均匀。
3.需用特殊供试液制备方法的供试品

(1)非水溶性供试品 方法1 取供试品5g（或5ml），加至含溶化的 （温度不超过45℃）5g 司盘80、3g 单硬脂酸甘油 酯、10g 聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中，用无菌 玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0 无菌氯化 钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品 充分乳化，作为1∶20 的供试液。 方法2 取供试品10g，加至含20ml 无菌十四 烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可 增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品 溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液100ml，振摇5～10 分钟，萃取，静置使油水 明显分层，取其水层作为1∶10 的供试液。
（5）灭菌后的培养基应保存2~25℃、避光的环境，放置 时间不能过长，三周内使用，以免水分散失及染菌。 已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用，固体 培养基灭菌后只允许在融化一次。
（6）勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度 受热而破坏，应用水浴或微波炉加热，融化的培养基 应置于45~50 ℃ 的水浴中，不得超过8h。 （7）过期、检验剩余的或检验使用后未长菌的培养基应 经煮沸后销毁；已长菌的培养基应在121 ℃灭菌30min 后销毁。 视频
或药物天平，pH计等
2.2
玻璃器皿
锥形瓶、烧杯、研钵、培养皿、量
筒、试管及塞、移液管等
玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留
抗菌物质吸管口上端距 0.5cm 处塞
入约 2cm 的适宜疏松棉花，置吸管 桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、 试管均应加棉塞或硅胶塞，再用牛 皮纸包扎。玻璃器皿，均于 160℃ 干热灭菌 2h 或高压蒸汽 121℃灭菌 30min，烘干备用。
（2）配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀， 应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。 （3）培养基的分装量不得超过容器的2/3， 以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧， 以免松动或脱落造成染菌。 （4）培养基配置后应在2h内灭菌，避免细 菌 繁 殖 ， 灭 菌 温 度 为 121℃ ， 时 间 为 15min。。
微生物限度检 查法
目录
一、简述 二、设备
三、供试品抽样、保存及检验量
四、实验
五、控制菌
一、简述 微生物限度检查的意义

细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单 位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定 药品受到微生物污染程度的重要指标，也是 对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、 工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进 行卫生学评价的综合依据之一。
1.2温度、湿度
无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外
杀菌灯杀菌效果，故温度应控制在18～ 26℃，相对湿度40～60％。操作间或净 化工作台的洁净空气应保持对环境形成 正压、不低于4.9Pa。
1.3操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
洁净度不应低于是C级，局部净化度为A 级，或放置同等级净化工作台，并准备 药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉等。
1.4 缓冲间
缓冲间内应有洗手盆，无菌 衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应 放置培养箱和其他杂物。
1.5洁净
级 别 及 检 查方法 通常采用尘 粒 数 及 浮 游 菌 数 或 沉 降 菌 数测 定 法。
洁净室（区）空气洁净度级别表
洁净度级别 悬浮粒子最大允许数/立方米
静态
≥0.5μ m A级 B级 3,520 3,520 ≥5μ m 20 29 ≥0.5μ m 3,520 352,000
4.1.4 乳酸、15%过氧乙酸（交替用于对洁净 室熏蒸消毒）
稀释剂和试剂 4.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液 4.2.2 无菌聚山梨酯 -80（对含油性 供试品具有助溶作用） 4.2.4 pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲 液 4.2.5 pH6.8磷酸盐缓冲液 4.2.6 pH7.6磷酸盐缓冲液等

(4)气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1 小时，取出， 迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻 一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓 缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适 量的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶 性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取 相当于10g或10ml 的供试品，再稀释成1∶10 的供 试液。 (5)贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴膏剂的保护层，放置在无 菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多 孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴 剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面 活性剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中，用 力振荡至少30 分钟，制成供试液。贴膏剂也可以其 他适宜的方法制备成供试液。
A级
B级 C级 D级
<1
10 100 200
<1
5 50 100
<1
5 25 50
<1
5 － －

例如：沉降菌 无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动 层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂 平板3个(经30～35℃预培养48h，证明无 菌落生长。)以无菌方式（或经传递箱） 移入操作间，置净化台左、中、右各1个， 开盖，暴露30min后将盖盖上。
装置，同时用紫外杀菌灯照射
30min。
2.
2其他设备
净化工作台、电热恒温水浴箱、培
养箱、电热恒温干燥箱，微波炉 （或其他适宜加热装置）、电冰箱、 空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要 进行灭菌效果检查并应定期请有关 部门检定）、薄膜过滤装置、电动 匀浆仪等。
2、仪器及器皿
2.1 菌落计数器、显微镜、电子天平
无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗
消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处 应呈凹弧形无缝隙，不留死角。操作间 内不应安装下水道。
操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，
出入操作间和缓冲间的门不应直对。

无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内 光照应分布均匀，光照度不低于 300 勒克斯。 缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯 （２～２ .5W/m3），紫外杀菌灯应距实验台 面高度不超过1M，并应定期检查辐射强度， 不得低于70μW/cm2（１M距离）。不符合要 求的紫外杀菌灯应及时更换。
4.2
5
培养基
营养琼脂培养基 5.2 玫瑰红钠琼脂培养基 5.3 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 5.4 胆盐乳糖培养基 5.4 MUG培养基
5.1
培养基制备应注意： （1）采用干燥培养基，按说明配制， 应对灭菌后的培养基 pH 值进行校验。
若为自配培养基，原料应挑选，琼 脂凝固力应测定，以确定配制时琼 脂用量。试剂规格应为化学纯以上 的试剂。
保存 供试品在检验之前，应保存在阴 凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供 试品内污染菌因保存条件不妥引起 致死、损伤或繁殖。
2
2.1
2.2
供试品在检验之前，应保持原包 装状态，严禁开启。包装已开启的 样品不得作为供试品。
3检验量 即一次试验所用的供试品量（g、ml
或
c㎡）。 除另有规定外，一般供试品的检验量为 10g 或10ml；膜剂为100c㎡；贵重药 品、微量包装药品的检验量可以酌减。 要求检查沙门菌的供试品，其检验量应 增加20g 或20ml（其中10g或者10ml 用于阳性对照试验）。
一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一
个或多个菌细胞形成。因此供试品中所 测的菌落数实际为菌落形成单位数 （colony forming unit ，CFU），而 不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。
二、设备

1 无菌室 1.1结构和要求 无菌室应采光良好、避免潮 湿、远离厕所及污染区（面积不超过10m2， 高度不超过 2.4m ）由缓冲间（ 2 个）、操作 间组成。
3
用具
3.1
大、小橡皮乳头（放于干净带 盖 的 容 器 中 ， 并 应 定 期 用 70% ～ 75%乙醇溶液浸泡）。 无菌衣、帽、口罩、手套（洗 净后配套，用牛皮纸包严）灭菌， 备用。也可用一次性无菌衣、帽、 口罩、手套。
3.2
3.3
接种环 (白铱金或镍铬合金， 环 径 4 ～ 5mm 、长度 6 ～ 10cm) 、乙醇 灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪 刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌 钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、 试管架、火柴、记号笔、洗手盆、 实验记录纸等。
在30～35℃培养箱内倒置培养48h， 取出检查。 3个平板生长的平均菌落 数不超过1个。
无菌室操作台或净化工作台要定期
检测其洁净度，应达到A级。净化工 作台中的高效及中效过滤器应根据 检测情况，必要时予以更换处理。
1.6消毒处理
无菌室应在每次操作
前、后均用消毒液擦拭操作台及
可能污染的死角。开动层流净化

4 试液 4.1消毒液 4.1.1 0.1%新洁尔灭、 0.2%过氧乙酸、 75% 乙醇溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。 4.1.2 3%的来苏尔溶液、5%石碳酸溶液 (配 好后装入玻璃消毒缸内， 供消毒带菌吸管用； 当菌液污染台面或地面时，将其倾覆其上) 4.1.3 75%乙醇溶液


三、供试品抽样、保存及检验量
1
抽样
1.1
一般采用随机抽样方法，抽样量 应为检验用量（ 2个以上最小包装单 位）的3倍量（以备复试）。
抽样时，凡发现有异常或可疑的 样品，应选取有疑问的样品，但机 械损伤、明显破裂的包装不得作为 样品。
1.2
1.3
凡能从药品、瓶口（外盖内侧及 瓶口周围）外观看出长螨、发霉、 虫蛀及变质的药品，可直接判为不 合格，无需再抽样检验。