载体构建介绍
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导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常 采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制 DNA片段的自身环化。
5.常见问题
克隆基因的酶切位点及引物问题 1、单酶切 单酶切后进行连接，质粒自连、目的片段自连、目的片 段之间连接、目的片段和载体各种错误连接、目的片段反 向连接等等，尽量不选单酶切 2、保护碱基数目的问题。 在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护 碱基，这会使得酶切效率大大提高。
载体构建
戎浩 2015.12
C目录 ONTENTS
1 载体简介 2 载体构建 3 注意事项 4 常见问题
1.载体简介
目的基因的克隆与鉴定
载体构建
大肠转化，质粒 提取与鉴定
农杆菌的转化与活化
外植体制备
浸染
生理检测 纯化
移栽 继代繁殖
ห้องสมุดไป่ตู้
分子检测
筛选
共培养
1.1载体
载体（vector） ，能将外源DNA或基因片段携带入宿 主细胞内的一个具有自我复制能力的DNA分子。
5.常见问题
3、双酶切引物设计 a、所选的酶切位点必须是载体上的，而目的片段中没
有的。 b、酶切位点不能太近，靠的太近的话，一般只能切开
一个。 c、两个酶切位点最好不要是同尾酶（效果相当与单酶
1.2载体的分类
质粒载体
质粒载体是一种相对分子 质量较小、独立于染色体 DNA之外的环状DNA(一般有 1～200 kb左右)，有的一 个细菌中有一个，有的一 个细菌中有多个。质粒能 通过细菌间的接合由一个 细菌向另一个细菌转移， 可以独立复制，也可整合 到细菌染色体DNA中，随着 染色体DNA的复制而复制。
目的基因获得
酶切
连接
引物设计
质粒提取
大肠杆菌转化
目的片段扩增
大肠杆菌转化
农杆菌转化
PCR产物纯化
TA克隆
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分 别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一 起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
2.1目的基因的获得
3.9 大肠杆菌转化 3.10 农杆菌转化
4.注意事项
PCR产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续 实验；
在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参
数之一就是温度，因此要控制好连接温度。 进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，
1.0 μL 7.5 μL
2.10 大肠肝转化
2.11 农杆菌转化
16℃，8h
3.载体构建（同源重组）
目的基因获得 引物设计
LR反应 质粒提取
目的片段扩增 PCR产物纯化
大肠杆菌转化 BP反应
大肠杆菌转化 农杆菌转化
3.1目的基因的获得
从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。
3.2引物设计
加attB的接头，对读码框
现在人们还在不断寻找新的载体，如叶绿体或线粒体 DNA也有可能成为载体。
1.2载体的分类
克隆载体
植 物 基 中间载体 因 工 程 卸甲载体 载 体
表达载体
一元表达载体 双元表达载体
1.2载体分类
克隆载体
可携带出入的外源 DNA片段并可转入受体 细胞中大量扩增的DNA 分子。通常含有筛选 标记，在插入外源的 基因的时候不会破坏 载体本身的自我复制 功能。
2.5 TA克隆
聚合酶链反应产物的克隆载体，线性化后两侧3′端各多出 一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱 氧腺苷酸(A)，与T载体（pMD19）之间的A-T互补，因此 称为TA克隆。
体系： T载体 0.5 μL 目的片段 4.5 μL Solution I 5.0 μL
2.6 大肠杆菌转化
1.2载体分类
中间载体
1.2载体分类
卸甲载体
野生型的Ti质粒不能直接作为基因工程的载体，期TDNA区存在一段阻碍细胞分化和植株再生的基因Onc， 将其切除，即“解除”其“武装”，因此称为卸甲载 体。
1.2载体分类
双元表达载体
一般植物表达载体 是成套使用的，一套 中有两个，一个是带 有可以供插入外源表 达基因的MCS和筛选 标签的融合蛋白（通 常是GFP，GUS或抗性 基因蛋白）的普通表 达载体。另一个载体 就是双元表达载体。
3.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶 进行目的片段的扩增。（加尾）
3.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
3.5 BP反应
3.6 大肠杆菌转化 3.7 质粒提取
3.8 LR反应
1.2载体的分类
噬菌体载体
利用噬菌体作载体， 主要是将外来目的DNA 替代或插入中段序列， 使其随左右臂一起包装 成噬菌体，去感染大肠 杆菌，并随噬菌体的溶 菌繁殖而繁殖。
1.2载体的分类
病毒载体 感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于
动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病 毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其 中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁 殖和克隆，然后再引入真核细胞。
1.2载体的功能
运送外源基因高效的转入到受体细胞中 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供条件
1.3载体应具备的条件
具有对受体细胞的可转移性 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有多种单一的酶切位点 具有合适的选择性标记
2.载体构建（酶切连接）
从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。
2.2引物设计（合适的酶切位点）
2.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶 进行目的片段的扩增。（加尾）
2.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
2.7 质粒提取
16℃，8h
2.8 酶切
体系：限制性核酸内切酶 2.5 μL
10 × buffer
5.0 μL
质粒
20 μL
ddH2O
to 50 μL
37℃，2h
对pMD19-目的基因和表达载体（如PSB130）分别进 行酶切
2.9 连接
体系：T4连接酶 T4 buffer 表达载体 目的片段
0.5 μL 1.0 μL
5.常见问题
克隆基因的酶切位点及引物问题 1、单酶切 单酶切后进行连接，质粒自连、目的片段自连、目的片 段之间连接、目的片段和载体各种错误连接、目的片段反 向连接等等，尽量不选单酶切 2、保护碱基数目的问题。 在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护 碱基，这会使得酶切效率大大提高。
载体构建
戎浩 2015.12
C目录 ONTENTS
1 载体简介 2 载体构建 3 注意事项 4 常见问题
1.载体简介
目的基因的克隆与鉴定
载体构建
大肠转化，质粒 提取与鉴定
农杆菌的转化与活化
外植体制备
浸染
生理检测 纯化
移栽 继代繁殖
ห้องสมุดไป่ตู้
分子检测
筛选
共培养
1.1载体
载体（vector） ，能将外源DNA或基因片段携带入宿 主细胞内的一个具有自我复制能力的DNA分子。
5.常见问题
3、双酶切引物设计 a、所选的酶切位点必须是载体上的，而目的片段中没
有的。 b、酶切位点不能太近，靠的太近的话，一般只能切开
一个。 c、两个酶切位点最好不要是同尾酶（效果相当与单酶
1.2载体的分类
质粒载体
质粒载体是一种相对分子 质量较小、独立于染色体 DNA之外的环状DNA(一般有 1～200 kb左右)，有的一 个细菌中有一个，有的一 个细菌中有多个。质粒能 通过细菌间的接合由一个 细菌向另一个细菌转移， 可以独立复制，也可整合 到细菌染色体DNA中，随着 染色体DNA的复制而复制。
目的基因获得
酶切
连接
引物设计
质粒提取
大肠杆菌转化
目的片段扩增
大肠杆菌转化
农杆菌转化
PCR产物纯化
TA克隆
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分 别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一 起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
2.1目的基因的获得
3.9 大肠杆菌转化 3.10 农杆菌转化
4.注意事项
PCR产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续 实验；
在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参
数之一就是温度，因此要控制好连接温度。 进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，
1.0 μL 7.5 μL
2.10 大肠肝转化
2.11 农杆菌转化
16℃，8h
3.载体构建（同源重组）
目的基因获得 引物设计
LR反应 质粒提取
目的片段扩增 PCR产物纯化
大肠杆菌转化 BP反应
大肠杆菌转化 农杆菌转化
3.1目的基因的获得
从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。
3.2引物设计
加attB的接头，对读码框
现在人们还在不断寻找新的载体，如叶绿体或线粒体 DNA也有可能成为载体。
1.2载体的分类
克隆载体
植 物 基 中间载体 因 工 程 卸甲载体 载 体
表达载体
一元表达载体 双元表达载体
1.2载体分类
克隆载体
可携带出入的外源 DNA片段并可转入受体 细胞中大量扩增的DNA 分子。通常含有筛选 标记，在插入外源的 基因的时候不会破坏 载体本身的自我复制 功能。
2.5 TA克隆
聚合酶链反应产物的克隆载体，线性化后两侧3′端各多出 一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱 氧腺苷酸(A)，与T载体（pMD19）之间的A-T互补，因此 称为TA克隆。
体系： T载体 0.5 μL 目的片段 4.5 μL Solution I 5.0 μL
2.6 大肠杆菌转化
1.2载体分类
中间载体
1.2载体分类
卸甲载体
野生型的Ti质粒不能直接作为基因工程的载体，期TDNA区存在一段阻碍细胞分化和植株再生的基因Onc， 将其切除，即“解除”其“武装”，因此称为卸甲载 体。
1.2载体分类
双元表达载体
一般植物表达载体 是成套使用的，一套 中有两个，一个是带 有可以供插入外源表 达基因的MCS和筛选 标签的融合蛋白（通 常是GFP，GUS或抗性 基因蛋白）的普通表 达载体。另一个载体 就是双元表达载体。
3.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶 进行目的片段的扩增。（加尾）
3.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
3.5 BP反应
3.6 大肠杆菌转化 3.7 质粒提取
3.8 LR反应
1.2载体的分类
噬菌体载体
利用噬菌体作载体， 主要是将外来目的DNA 替代或插入中段序列， 使其随左右臂一起包装 成噬菌体，去感染大肠 杆菌，并随噬菌体的溶 菌繁殖而繁殖。
1.2载体的分类
病毒载体 感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于
动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病 毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其 中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁 殖和克隆，然后再引入真核细胞。
1.2载体的功能
运送外源基因高效的转入到受体细胞中 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供条件
1.3载体应具备的条件
具有对受体细胞的可转移性 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有多种单一的酶切位点 具有合适的选择性标记
2.载体构建（酶切连接）
从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。
2.2引物设计（合适的酶切位点）
2.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶 进行目的片段的扩增。（加尾）
2.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
2.7 质粒提取
16℃，8h
2.8 酶切
体系：限制性核酸内切酶 2.5 μL
10 × buffer
5.0 μL
质粒
20 μL
ddH2O
to 50 μL
37℃，2h
对pMD19-目的基因和表达载体（如PSB130）分别进 行酶切
2.9 连接
体系：T4连接酶 T4 buffer 表达载体 目的片段
0.5 μL 1.0 μL