考马斯亮蓝染色法
蛋白质含量的测定考马斯亮蓝染色法
1 2
洗涤
用洗涤液洗涤染色后的蛋白质样品，去除多余的 染料。
测量
使用分光光度计测量蛋白质样品的吸光度值。
3
结果计算
根据标准曲线和吸光度值计算蛋白质含量。
04
结果分析
数据记录与整理
数据记录
在实验过程中，应详细记录每个实验 组的吸光度值，包括空白对照组。
数据整理
将实验数据整理成表格，包括实验组 别、吸光度值以及相应的波长等。
VS
药物研发
在药物研发过程中，考马斯亮蓝染色法可 用于评估药物对蛋白质表达的影响，为新 药研发提供实验依据。
未来发展方向与挑战
技术优化
随着科学技术的不断发展，考马斯亮蓝染色法需要不断优化和完善， 以提高检测的灵敏度和特异性。
应用领域拓展
随着蛋白质组学研究的深入，考马斯亮蓝染色法的应用领域将进一 步拓展，为生命科学和医学研究提供更多支持。
蓝色与黄色
考马斯亮蓝染色后呈蓝色，与未结合蛋白质的黄色形成鲜明对比，便于观察和 检测。
颜色深浅与浓度正相关
随着蛋白质浓度的增加，染色后样品的颜色逐渐加深，通过比色法可测定出不 同浓度下的光密度值，进而计算出蛋白质浓度。
03
实验步骤
样品准备
样品收集
蛋白质提取
选择具有代表性的样品，确保样品新 鲜、无污染。
05
应用与展望
在生物学领域的应用
蛋白质表达分析
考马斯亮蓝染色法常用于检测细胞或组织中蛋白质的表达水平，有助于研究生物体的生 理和病理过程。
蛋白质分离与鉴定
通过考马斯亮蓝染色法对蛋白质进行染色，可以方便地对蛋白质进行分离和鉴定，为蛋 白质组学研究提供技术支持。
在医学领域的应用
考马斯亮蓝染色总结
考马斯亮蓝染色总结考马斯亮蓝染色是一种广泛应用于生物学实验中的染色技术，它可以用于检测许多不同的分子和细胞类型。
这种染色方法是法国生物学家Louis-Charles Malassez于1867年发明的，后由德国生物学家Richard Kuhn于1933年进行改良，使其成为现代生物学实验的标准技术之一。
本文将对考马斯亮蓝染色的方法、应用以及优缺点进行总结。
一、方法考马斯亮蓝染色的原理是，亮蓝染料可以与DNA的碱基对结合而形成复合物。
这种染色技术需要一些基本试剂，包括亮蓝染料、甲醛、醋酸以及石蜡等。
具体操作步骤如下：1. 取需要染色的细胞或组织样本，用生理盐水进行清洗；2. 将样本固定在载玻片上，用甲醛和醋酸进行固定处理；3. 将载玻片在70％乙醇和95％乙醇中依次浸泡，以去除固定剂；4. 在50％和75％醇溶液中浸泡数分钟，使样本逐渐变暗；5. 用亮蓝染料染色，通常需要在100倍和400倍低倍镜下观察。
二、应用考马斯亮蓝染色可以用于检测DNA、RNA、核蛋白和细胞质等细胞成分。
在分子生物学实验中，考马斯亮蓝染色被广泛应用于检测DNA条带的大小、纯度和含量。
此外，它还可以用于细胞形态和结构的观察，如观察细胞核、染色质和核仁等。
在医学领域中，考马斯亮蓝染色可以用于检测肿瘤、癌细胞、炎症细胞和血液样本等。
从组织样本中提取DNA或RNA 时，也会使用该染色技术。
三、优缺点优点：1.对许多不同类型的细胞和分子具有高度灵敏度和特异性。
2.操作简便，仅需要一些基本试剂和设备。
3.观察结果清晰，可以展示细胞组织的形态和结构。
4.染色技术稳定性好，结果可复制性高。
缺点：1.过程中可能会使样本遭到破坏或溶解。
2.亮蓝染料可能与背景杂质结合，导致结果不准确。
3.需要专业人员进行染色和观察，较为复杂。
4.染色后，样品无法再进行分子生物学的使用，比如PCR 反应等。
结语：考马斯亮蓝染色是一种简便、灵敏并且重要的分子生物学实验技术。
考马斯亮蓝法的原理
考马斯亮蓝法的原理
考马斯亮蓝法是一种通过观察物体的颜色变化来判断其性质的方法。
这种方法基于考马斯的色彩理论，将特定颜色下的物体辨识和观察融为一体。
该方法的原理是通过改变物体所反射或发射的光的波长和强度，使其显示出不同的颜色。
根据物体的性质，通过对照表或经验判断，可以了解物体的组成或特性。
考马斯亮蓝法主要应用于无机化学实验中。
实验者通过加入特定试剂，使物质发生化学反应或形成络合物，从而改变物质的颜色。
通过观察颜色的变化，可以判断原物质或化学物质的存在与数量。
这种方法通常具有一定的选择性和灵敏性，能够检测出一些微量物质，甚至在样品中的稀有金属等特定成分。
需要注意的是，考马斯亮蓝法虽然可以提供一种快速和经济的分析方法，但仍然需要经验和专业知识的支持。
对于某些复杂的样品或分析目标，可能需要进行更为精确的分析和检测。
因此，在实际应用中，需要综合考虑多种方法，以提高分析的准确性和可靠性。
可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法)
可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法）
1.试剂配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。
贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇37.5ml，75%乙醇12.5ml或取45ml无水乙醇直接定容至50ml。
（2）100 μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA,用质量分数为0.9%的氯化钠溶解，并定容至100 ml即为100 μg/ml。
2. 标准曲线绘制
取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min 左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
3. 样品测定
（1）样品提取：取鲜样2g，加2ml蒸馏水研磨成匀浆后，移到离心管中，然后用6ml蒸馏水分次洗涤研钵，完全转移至离心管后，放置0.5-1小时以充分提取，然后4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转移至容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，待测。
（2）吸取样品提取液 1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入带塞试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min待反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。
4. 蛋白质含量计算
可溶性蛋白含量（mg/g）=(C·V T)/（1000V S·W F）
C—查标准曲线值，μg；
V T—提取液总体积，ml；
W F—样品鲜重，g；
V S—测定时加样量，ml。
考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色法
原理
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
配制
考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。
注意事项
1.在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
2.测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
3.利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法——标准方法1．电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。
加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R—250(溶解于50％甲醇和10％乙酸中)。
2．室温下振摇温育4h至过夜。
3．去除染色液，收集保存可重复使用20～40次。
4．依次在25％甲醇、7．5％乙酸中室温振摇下脱色。
灵敏度为0．1～0．5ttg蛋白／每条带。
注：①使用加热的染液或脱色液可以缩短染色或脱色的时间。
将染液或脱色液在微波炉或水浴中加热(大约50-6013)。
染色时间可缩短至20min，脱色时间约1—2h。
②加入泡沫橡胶(海绵)、羊毛状物或其他物品吸收染料，可以加快脱色时间，特别是在室温下脱色时。
考马斯亮蓝染色法——快速方法1．将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料培养皿中加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R-250(溶解于50％三氯乙酸中)。
2．室温下振摇温育20min。
3．去除染色液，收集保存可重复使用多次，用水洗去未与凝胶结合的染料。
4．加入数倍体积的脱色液(25％甲醇、7％乙酸)。
必要时更换脱色液，将凝胶加温或在脱色液中放入海绵、滤纸片等吸收残余的染料，有助于加快脱色。
灵敏度为1．0ug蛋白／每条带。
考马斯亮蓝染色法——最高灵敏度1．染色前，考马斯亮蓝G-250(系考马斯亮蓝R-250的二甲基化衍生物)必须纯化。
因为商品制剂中的杂质可增强染色背景。
在250m17．5％乙酸中溶解4g染料，加热到70℃；加入44g硫酸铵，溶解后，冷却过滤或置室温离心(3000g，10min)，去除上清液，让染料干燥。
2．配制染色液：在500m1 2％磷酸中溶解30g硫酸铵，待其完全溶解后，加入溶于10m1水中的0．5g 纯化的考马斯亮蓝G—250。
室温保存。
3．电泳后，将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料容器中加入5倍于凝胶体积的12．5％三氯乙酸。
4．室温下振摇温育1h或更长时间。
5．排干液体。
摇动考马斯亮蓝G—250染液，使大颗粒胶体分散，加至凝胶内。
bradford法
双 缩 脲 法 （Biuret法）
中速 20~30 分 钟
多肽键＋碱性Cu2 ＋→紫色络合物
紫外吸收法
较为灵敏 50～100µg
快速 5～10分 钟
蛋白质中的酪氨 酸和色氨酸残基 在 280nm 处 的 光 吸收 双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷
灵敏度高 ～5µg
慢速 40～60 分钟
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5µg
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时， 其 λ max 由 465nm 变为595nm
方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适 用 于 0.2~ 1.0mg 氮 ， 误 差为 ±2％ 灵敏度低 1～20mg 费时 8～10小 时 将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后 滴定 非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离） 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长 用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似 用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
2、缺点 、
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏 差，在制作标准曲线时最好选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进 行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
考马斯亮蓝染色法原理
考马斯亮蓝染色法原理考马斯亮蓝染色法是一种常用于病理学实验室的染色技术，主要用于肿瘤组织的诊断和研究。
该染色法的原理是利用某些化学物质的亲和性，将细胞或组织中的特定结构染色，从而能够观察到细胞和组织的形态特征，进而进行病理学分析。
考马斯亮蓝染色法的原理主要涉及到两个方面，即亲和性和染色效应。
首先是亲和性，考马斯亮蓝染色法使用的考马斯亮蓝染料具有与DNA分子特异性结合的能力。
DNA在细胞核中起着存储遗传信息的作用，而考马斯亮蓝染料能够与DNA分子中的负电荷结合，形成染色复合物。
这种亲和性使得考马斯亮蓝染料能够选择性地染色细胞核。
其次是染色效应，考马斯亮蓝染色法使用的考马斯亮蓝染料在细胞核中形成的染色复合物呈现出蓝色。
这是因为考马斯亮蓝染料分子中含有苯环结构，该结构能够吸收可见光中的蓝色波长，使得染色复合物呈现蓝色。
而其他组织结构或细胞器中的成分不具备与考马斯亮蓝染料结合的亲和性，因此不会被染色。
考马斯亮蓝染色法的操作步骤相对简单。
首先，需要将待染的组织切片置于玻片上，并进行固定和脱水处理。
接下来，将考马斯亮蓝染料溶液滴在组织切片上，使其与细胞核结合形成染色复合物。
然后，将组织切片在显微镜下观察并进行分析。
考马斯亮蓝染色法的应用广泛，特别是在肿瘤学领域。
通过使用该染色法，可以观察肿瘤细胞的形态特征，如细胞核形态、大小、核仁的形成情况等。
此外，还可以通过对组织切片的染色程度进行评估，从而判断肿瘤的恶性程度。
考马斯亮蓝染色法还可以用于研究细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学过程。
考马斯亮蓝染色法是一种常用的病理学染色技术，通过特定化学物质与细胞核中的DNA结合形成染色复合物，从而实现对细胞和组织的染色。
该染色法的原理清晰，操作简单，具有广泛的应用前景。
考马斯亮蓝染色法原理(一)
考马斯亮蓝染色法原理(一)考马斯亮蓝染色法引言•简介考马斯亮蓝染色法的定义和应用领域。
•提出本文要解释的问题。
考马斯亮蓝染色法是什么？•考马斯亮蓝染色法的定义和背景。
•突出该染色法的重要性和应用价值。
考马斯亮蓝染色法的原理•描述考马斯亮蓝染色法的步骤和基本原理。
•介绍染色过程中使用的试剂和其功能。
针对某种细胞/组织的考马斯亮蓝染色方法•介绍如何使用考马斯亮蓝染色法来染色特定的细胞或组织。
•详细阐述影响染色结果的因素，如时间、温度和试剂浓度等。
•提供一些技巧和注意事项，以确保染色结果的可靠性。
考马斯亮蓝染色法在研究中的应用•列举考马斯亮蓝染色法在不同领域的应用案例。
•强调该染色法在研究中扮演的重要角色。
结论•总结考马斯亮蓝染色法的特点和优势。
•提出对该染色法未来改进的建议。
•强调该染色法对科学研究的重要意义。
以上是根据要求生成的简要大纲，你可以根据需要和知识详细展开每个部分的内容。
考马斯亮蓝染色法引言•考马斯亮蓝染色法是一种常用的组织染色技术，通常用于研究细胞和组织的结构和功能。
•本文将对考马斯亮蓝染色法的原理、应用和方法进行详细介绍。
考马斯亮蓝染色法是什么？•考马斯亮蓝染色法是一种常见的染色技术，用于染色细胞和组织以观察其形态和组织学特征。
•该染色法以考马斯亮蓝作为染料，通过与细胞和组织中的不同成分发生特异性反应，使其显色或显微荧光。
考马斯亮蓝染色法的原理•考马斯亮蓝染色法的原理是基于染料与细胞和组织中的化学成分之间的相互作用。
•考马斯亮蓝可以与核酸的磷酸基团结合形成复合物，使细胞核染色显蓝色。
•同时，考马斯亮蓝还可以与细胞质中的一些蛋白质、肌动蛋白等发生特异性反应，进一步显色。
针对某种细胞/组织的考马斯亮蓝染色方法•针对不同细胞和组织的染色，考马斯亮蓝染色方法可能会有所差异。
•在染色前，需要对细胞或组织进行适当的固定和处理，以保持其形态和结构完整性。
•染色过程中，可以根据需要控制染色时间、温度和染料浓度。
考马斯亮蓝染色法原理
考马斯亮蓝染色法原理考马斯亮蓝染色法是一种常用的细胞染色方法，可用于区分细胞的核和细胞质。
其原理基于碱性条件下亮蓝色染料甲基蓝与细胞内DNA分子间的静电作用力和亲和力。
首先，考马斯亮蓝染色方法通常在细胞固定后进行。
细胞固定是指保持细胞形态和结构，停止细胞的生理活动，以便进一步的观察和研究。
最常用的细胞固定方法是用乙醇或甲醇进行固定，也可以使用醋酸乙酯等化学药品。
接下来，细胞需要进行脱水，以便更好地与染料反应。
一般会使用乙醇的序列浓度（例如30%-50%-70%-90%-100%）进行脱水处理。
每个浓度的乙醇浸泡时间可以根据实验需求进行调整。
然后，细胞需要进行染色。
染色方法主要是将甲基蓝染料加入细胞内。
甲基蓝是一种亮蓝色碱性染料，它能与核酸分子（DNA和RNA）发生静电作用力和亲和力。
甲基蓝的溶液可以通过醋酸盐缓冲液或甲醇进行准备。
甲基蓝会与DNA分子形成复合物，使得染色体显现出深蓝色或紫色。
这是因为DNA分子含有大量的碱基（如腺嘌呤和胸腺嘧啶），它们具有较高的负电荷，能够与染料形成静电吸附。
此外，甲基蓝也能与细胞内其他基质发生非特异性结合，如细胞膜、胞质蛋白等。
最后，细胞需要进行洗涤，以去除掉未结合的染料，保留已染色的细胞。
一般使用缓冲液（如醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液）进行洗涤，可以重复洗涤多次，直到洗涤液中不再出现明显的染料溶解出现。
考马斯亮蓝染色法的结果是在显微镜下观察到的染色细胞。
核内的DNA分子呈现出深蓝色或紫色，而胞质和其他细胞器则呈现出浅蓝色或无色。
这种染色方法可以用于观察细胞的核染色体形态、核质比例、核分裂等细胞学研究。
总结起来，考马斯亮蓝染色法主要是通过甲基蓝与细胞内DNA分子的静电作用力和亲和力，将细胞的核与细胞质进行染色区分。
这种染色方法简单易行，可用于多种细胞类型的观察和研究。
考马斯亮蓝快速染色液
考马斯亮蓝快速染色液
采用以下方法制备：
1)称取0.05-0.2g的考马斯亮蓝G-250，加入30-50ml的无水乙醇搅拌至溶解完全；
2)加入1.5-5g无水硫酸铜或三氯化铬，加入500-800ml超纯水，利用磁力搅拌器以200-600rpm/min的速度搅拌0.5-2小时；
3)加入10-50ml的冰乙酸搅拌至均匀，然后加入10-50ml浓盐酸(也可采用85％磷酸，效果相同)搅拌均匀；
4)加入超纯水定容至1L，采用10000rpm高速离心5min(也可使用普通定性滤纸负抽滤的方式，对最终结果无影响)去除沉淀后即可获得考马斯亮杀菌防腐剂蓝快速染色液。
染色脱色方法如下：1.清洗：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出胶板，切割舍弃浓缩胶瓦克，加入超纯水清洗凝胶一次，再次加入超纯水微波炉中高火加热至沸腾后取出凝胶；2.染色：凝胶尽量滤干水分，放入有盖耐热容器加入快速低刺激考马斯亮蓝染色液，染液需要保证完全覆盖凝胶表面，使用微波炉中高火加热煮沸2-3min；3.初步脱色：取出凝胶用超纯水冲洗凝胶表面残留染液(此时在目的蛋白量较大情况下即可初步看到染色条带)，然后加入超纯水使用微波炉中高火加热3-5min即完成初步脱色(此时可以清晰观察到染色蛋白条带，但凝胶背景色并未完全脱净)；4.彻底脱色：取出凝胶后加入150mMNaCl水溶液，溶液量以完全浸没凝胶且脱色过程中脱色液不坏洒出为度，水平摇床室温50rpm脱色1h即可彻底脱净背景色。
考马斯亮蓝染色的原理和方法
考马斯亮蓝染色的原理和方法原理：考马斯亮蓝染色主要是根据考马斯亮蓝与细胞核DNA之间的特异性亲和力来实现细胞核的染色。
考马斯亮蓝是一种碱性染料，与DNA中的碱基的氮原子形成氢键结合，从而实现染色。
考马斯亮蓝染色过程中，染料进入细胞，通过氢键结合将细胞核染色为深蓝色，而胞质则不受染。
方法：1.固定细胞：首先需要将要染色的细胞进行固定，主要是为了保持细胞的形态和结构，常用的固定剂有醋酸乙酯、甲醛等。
2. 渗透处理：细胞膜对于染料的渗透性较差，因此需要进行渗透处理，使染料能够顺利进入细胞。
一种常用的方法是使用0.1% Triton X-100等表面活性剂进行渗透处理。
3.染色：将考马斯亮蓝染料稀释到适当浓度的磷酸缓冲液中，将固定和渗透后的细胞置于染料中，通常需要15-30分钟的染色时间。
4.洗涤：染色后，需要用磷酸缓冲液进行洗涤，去除多余的染料，保持背景清晰。
5.封片：将染色好的细胞或组织切片置于显微镜片上，加入适量的封片胶和封片玻璃，用修剪片进行封闭，使细胞或组织固定在玻璃片上。
6.观察和拍照：封好片后，使用显微镜观察染色效果，并进行拍照记录或保存。
可以使用显微镜下的目镜或物镜进行观察，也可以使用数字显微镜等设备进行观察和记录。
注意事项：在进行考马斯亮蓝染色时，有一些注意事项需要注意：1.固定细胞的时间应控制好，过短会导致细胞变形，过久则会破坏细胞结构。
2.渗透处理的时间和渗透液的浓度需要根据具体细胞类型和实验要求进行调整。
3.考马斯亮蓝染料的浓度也需要根据具体实验要求进行调整，一般来说，较高的染料浓度会使细胞核染色更深。
4.染色后的洗涤步骤非常重要，可以使用磷酸缓冲液多次洗涤，以确保背景干净。
总结：考马斯亮蓝染色是一种简单有效的细胞核染色方法。
通过与DNA的特异性亲和作用，可以清晰地染色细胞核。
在进行考马斯亮蓝染色时，需要注意固定、渗透、染色、洗涤等步骤的操作，以获得理想的染色效果。
这种染色方法被广泛应用于细胞学和组织学研究领域，为细胞和组织的观察和研究提供了有力的工具。
考马斯亮蓝法完整版
考马斯亮蓝法（Bradford法）
徐亮
xuliang@
Tianjin Medical University
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
四、Bradford法的优缺点
1、优点
（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光 系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为 1ug蛋白质。
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只 需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
四、Bradford法的优缺点
2、缺点
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料
与蛋白质结合时， 其 max 由 465nm 变为595nm
强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
考马斯亮蓝染色总结
考马斯亮蓝染色总结考马斯亮蓝染色法是一种广泛应用于生物学及医学领域的染色技术，其主要作用是使细胞和组织的结构、形态和组成成分可见，从而帮助科学家们更好地进行观察、研究和分析。
在本文中，我们将对考马斯亮蓝染色法进行详细的介绍和总结。
1. 染色原理考马斯亮蓝染色法是以亮蓝G和甲基绿为主要染色剂，通过它们与细胞结构中的核酸和蛋白质发生亲和作用从而染色的。
亮蓝G主要染色细胞核及细胞质内的核糖体、蛋白质及其它细胞结构，而甲基绿则主要染色细胞质囊泡、线粒体等细胞质结构。
2. 染色方法考马斯亮蓝染色法的染色方法一般分为几个步骤：处理标本、脱水、清洗、染色、除色和封片。
下面我们将详细介绍每个步骤。
（1）处理标本：首先需要将待染标本进行处理，可以选择切片或制片方法制备，一般采用的是石蜡切片，用甲醛或卡尼液（一种带有防腐功能的溶液）固定标本，然后用甲醇或乙醇进行脱水。
（2）脱水：脱水是将固定的标本从水溶液中转移到乙醇（酒精）中，这个过程需要逐渐进行，不可以用高浓度酒精来快速脱水。
脱水的目的是防止固定的标本因含水过多而膨胀变形。
（3）清洗：将标本从酒精中取出后，需要清洗干净，以防止其中残留的酒精对染色的影响。
（4）染色：将标本浸入考马斯亮蓝染液中进行染色。
染色时间一般在几分钟至半小时之间，具体时间根据标本的大小和厚薄来决定。
（5）除色：染色过程结束后，需要将标本进行除色，以清除过多的染液，防止染色过重。
除色是用95%至100%的酒精进行。
（6）封片：染色和除色结束后，需要将标本封装在玻璃片上。
封装通常使用覆盖片和封片胶，将标本与玻璃片粘合在一起。
3. 染色结果经过考马斯亮蓝染色后，标本中的不同细胞结构会被染上不同颜色。
细胞核染成深蓝色，细胞质染成浅蓝色或颜色较浅，细胞质囊泡、线粒体等细胞质结构则呈现深绿色。
通过染色结果，我们可以清楚地观察到样本中不同结构之间的分布情况。
4. 应用领域考马斯亮蓝染色法广泛应用于生物学、医学及其它相关领域。
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝测定蛋白质含量一、实验原理考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈棕红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
在3～5分钟即成大量吸收，至少稳定1小时。
在10～1000μg/mL范围内，吸光值与蛋白质浓度成正比。
是目前常用方法之一。
二、实验材料、器材与试剂1.材料结晶牛血清白蛋白。
2.器材（1）723分光光度计；（2）试管及试管架；（3）各型号吸量管；（4）坐标纸；（5）记号笔。
3.试剂（1）考马斯亮兰G-250染色液：取考马斯亮兰G-250 100mg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸，加水稀释至1升。
（2）标准蛋白溶液：用牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定蛋法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1000μg/mL的蛋白质标准溶液。
标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.1g结晶牛血清白蛋白,于小烧杯内，加入少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。
配制成标准原液，其中牛血清白蛋白浓度为1000μg/mL。
(3)样品液：准确称取小麦叶片（或绿豆芽下胚轴）约200mg,放入研钵中，加入蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到离心管中，于4000r/min离心10min,将上清液倒入10mL容量瓶中，再向残渣中加入2.0mL蒸馏水悬浮后以4000r/min再离心10min,合并上清液，定容至刻度。
三、实验方法1. 分别取8支试管，编号，按下表加入试剂，混匀，室温放置5～30分钟。
标准蛋白溶液（1000μg/mL）未知样品1未知样品2管号 1 2 3 4 5 6 7 8 样品/mL0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 蛋白质含量/μg0 200 400 600 800 1000 待测待测染色液(mL)5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.02.绘制标准曲线：用723分光光度计在595nm处比色。
考马斯亮蓝染色法原理
考马斯亮蓝染色法原理考马斯亮蓝染色法是一种常用的组织学染色方法，主要用于观察细胞核和细胞质的组织学结构。
下面我将介绍考马斯亮蓝染色法的原理及相关参考内容。
一、考马斯亮蓝染色法原理考马斯亮蓝染色法主要采用核酸染色剂特制的“考马斯刷”进行上染。
核酸染色剂的分子中含有许多芳香环结构，可以通过静电作用与细胞核内的DNA结合，从而实现染色的目的。
具体原理如下：1. 细胞处理：首先，需要取得组织切片或细胞制片。
对于组织切片，需要固定组织样本，通常使用10%中性缓冲福尔马林进行固定。
对于细胞制片，可以使用离心将细胞沉积在载玻片上，然后进行固定。
2. 上染：将特制的“考马斯刷”浸入染色剂中，使其吸附一定量的核酸染色剂。
然后，将刷子轻轻刷过已固定的组织切片或细胞制片上，使核酸染色剂与细胞核中的DNA结合。
3. 洗净：染色后，需要用去离子水轻轻冲洗刷子，并用去离子水洗净切片或制片上多余的染色剂。
然后，用过渡性溶液处理切片或制片，以使染色剂更好地进入细胞。
4. 固定：处理后的切片或制片需要在适当的溶液中进行固定。
固定处理可以使组织切片或细胞制片更好地保持形态结构，同时使染色剂与细胞核中的DNA结合更牢固。
5. 显色：处理后的组织切片或细胞制片可以通过显微镜观察。
考马斯亮蓝染色法可以使细胞核呈现深蓝色或紫色，较为鲜明，便于观察。
二、参考内容考马斯亮蓝染色法的原理和操作步骤较为简单，是常用的核酸染色方法之一。
以下是一些相关参考内容，供进一步学习和了解：1. 《染色学手册》（出版社：清华大学出版社，作者：钟瑛）：该书详细介绍了各种染色方法的原理、操作步骤及染色结果的解读。
其中包括考马斯亮蓝染色法的原理和操作步骤，可作为学习和实验的参考。
2. 《细胞生物学实验技术手册》（出版社：科学出版社，作者：胡纯生、冯斌）：该书以实验操作为主线，介绍了生物学实验中的基本技术和方法。
其中包括了考马斯亮蓝染色法的介绍和实际操作步骤，适合实验室人员使用。
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝法实验7 考马斯亮蓝G-250染⾊法测定蛋⽩质含量⼀、⽬的1、学习⼀种蛋⽩质染⾊测定的⽅法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋⽩质含量的基本原理和⽅法⼆、原理蛋⽩质的存在影响酸碱滴定中所⽤某些指⽰剂的颜⾊变化，从⽽改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋⽩质染⾊测定⽅法。
涉及的指⽰剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
⽬前⼴泛使⽤的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红⾊，当它与蛋⽩质通过范德华键结合后，变为蓝⾊，且在蛋⽩质⼀定浓度范围内符合⽐尔定律，可在595nm处⽐⾊测定。
2—5分钟即呈最⼤光吸收，⾄少稳定1⼩时。
在0.01—1.0 mg蛋⽩质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋⽩质之间差异⼤，且标准曲线线性差。
⾼浓度的Tris、EDTA、尿素、⽢油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有⼲扰。
缓冲液浓度过⾼时，改变测定液pH值会影响显⾊。
考马斯亮蓝染⾊能⼒强，⽐⾊杯不洗⼲净会影响光吸收值，不可⽤⽯英怀测定。
三、材料、试剂与器具（⼀）试剂1、染⾊液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%⼄醇中，加100ml 85%磷酸，加⽔稀释⾄1升。
该染⾊液可保存数⽉，若不加⽔可长期保存，⽤前稀释。
2、标准蛋⽩溶液：0.5mg/ml⽜⾎清⽩蛋⽩。
3、未知浓度的蛋⽩质溶液⽤酪蛋⽩配制，浓度控制在10—30mg/ml（⼆）器具1、试管及试管架2、移液管（1ml,5ml）3、可见光分光光度计四、操作步骤（⼀）标准曲线的制作2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、⽤分光光度计⽐⾊测定吸光值A595nm。
4、以A595nm为纵坐标，标准蛋⽩⾊质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（⼆）样品的测定1、取⼀⽀试管，加⼊未知浓度的蛋⽩质溶液0.2ml，蒸馏⽔0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、⽐⾊测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋⽩质的浓度。
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
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蛋白质浓度的测定──考马斯亮蓝染色法
目的要求
学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。
二、标准和待测蛋白质溶液
1．标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。
2．未知蛋白质溶液。
三、器材
试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。
操作方法
一、标准法制定标准曲线
取14支试管，分两组按下表a平行操作。
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、微量法制定标准曲线
取12支试管，分两组按下表b平行操作。
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
表b
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
三、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。
注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
（2）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。
测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
思考题：
根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：（1）样品不易溶解，但要求结果较准确。
（2）要求在半天内测定60个样品。
（3）要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。