P0017C 考马斯亮蓝染色脱色液_常规法_
考马斯亮蓝染色套装使用说明
考马斯亮蓝染色套装使用说明货号：P1305保存：室温保存，至少一年有效。
规格：100ml+500ml产品简介：本考马斯亮蓝染色套装(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝G-250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western 转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
产品内容：考马斯亮蓝染色液100ml考马斯亮蓝脱色液500ml说明书1份使用方法：1、电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中(至少5倍胶体积)，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
2、将凝胶置于摇床上缓慢摇动，室温染色至少2小时，低丰度蛋白染色需4小时以上。
3、染色结束后移除染色液，染色液通常可重复利用2-3次，但染色效果会略有影响。
4、将凝胶浸泡于和染色液等量体积的脱色液中，摇床上脱色4-8小时，期间更换3-5次脱色液。
注意事项：1.染色时间4小时以上效果最佳。
2.脱色可根据目的蛋白丰度和脱色效果随时终止，或延长脱色时间。
3.脱色越彻底，检测的蛋白量越低，脱色24小时一般可以检测出0.1ug蛋白量。
4.脱色后，将凝胶保存在水中，拍照或扫描保存图像。
或制成干胶保存。
相关试剂：P1300-500考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液PC0020BCA蛋白浓度测定试剂盒PR1400低分子量蛋白MARKERPR1700预染次高分子量蛋白MARKERI1020IPTG溶液(50mg/ml)A101030%丙烯酰胺(29:1)T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液P1300SDS-PAGE凝胶制备试剂盒。
考马斯亮蓝染色液
考马斯亮蓝染色液(常规法)的详细信息考马斯亮蓝染色液(常规法)规格：250ml500ml公司提取试剂盒不同样本提取DNA一次时间：15-30min, 并且可以适用于配备仪器大批量提取使用。
同系列产品：大鼠可溶性CD30配体(sCD30L)ELISA试剂盒大鼠可溶性CD40配体(sCD40L)ELISA试剂盒大鼠干细胞因子受体(SCFR)ELISA试剂盒大鼠基质细胞衍生因子1β(SDF-1β/CXCL12)ELISA试剂盒考马斯亮蓝染色液(常规法)大鼠血管生成素受体Tie1(ANG-R-Tie1)ELISA试剂盒大鼠含免疫球蛋白样环和上皮生长因子样域酪氨酸激酶2(Tie-2)ELISA试剂盒大鼠基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)ELISA试剂盒许多因素都能够影响质粒的产量，包括细菌培养液的体积，质粒的拷贝数，培养基的种类及所使用的菌株。
纯化的质粒不需后续处理即可用于DNA的各种分子生物学操作,但若用于体外转录实验,还需配合核糖考马斯亮蓝染色液(常规法)核酸酶抑制剂的使用。
溶液II-NaOH-SDS液:NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是稳定的。
但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L,加抽提液时,该系统的pH 就高达12.6,因而促使染色体DNA 与质粒DNA 的变性。
SDS:SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
(2)解聚细胞中的核蛋白。
(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA 时)受到干扰。
DNA 溶液是DNA 以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA 周围的水分子,使DNA 失水而易于聚合。
考马斯亮蓝快速染色液使用说明
色，可以重复2-3次。 注：染色时如果把凝胶和染色液一起放置在微波炉中适当加热，可以大大加快染色速度。但加热时宜尽量避免沸腾，以 免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。 4. 染色至看到清晰的目标蛋白条带后即可停止染色。弃染色液，加入适量的蒸馏水，停止染色反应。然后即可拍照记录。 注：通常使用本染色液染色后背景非常低，如果希望获得更加清晰的蛋白条带，可以加入适量的室温蒸馏水进行洗涤。 通过蒸馏水洗涤可以进一步降低背景。在4℃蒸馏水中浸泡过夜可以获得背景更低，条带更清晰的条带。在次日对4℃蒸 馏水浸泡过夜的已经进行了染色的凝胶再同前一天一样进行染色和洗涤可以进一步改善染色效果，获得更好的考染蛋白 条带。
包装清单：
产品编号 P0017 —
产品名称 考马斯亮蓝快速染色液
说明书
包装 250ml
1份
保存条件：
4℃保存，一年有效。
注意事项：
本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。 如果使用微波炉加热，请特别注意避免沸腾。以免因暴沸而导致凝胶碎裂。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
常见问题：
1. 无染色条带：可能上样量太少，建议电泳时加适当量的BSA等作为阳性对照。 2. 背景太高：可能杂质没有除尽，建议延长最初的蒸馏水洗涤时间或增加洗涤次数。也可以在完成染色后，把凝胶放置在
蒸馏水中在室温或4℃进行洗涤。在4℃蒸馏水中浸泡过夜，通常可以取得较好的脱色效果。 3. 染色条带的灵敏度不够理想：可以使用考马斯亮蓝快速染色液进行重复染色，重复染色可以改善染色效果。在加热情况
使用说明：
1. 电泳结束后，取胶放入约50-100ml蒸馏水中，在摇床上摇动5分钟，倒弃液体，再重复两次，共洗涤三次。 注：本步骤的目的是为了洗去凝胶中的SDS等干扰物质。如果不能充分去除SDS会导致背景较高，如果胶非常厚，每次的 洗涤时间需适当延长并且洗涤次数也需适当增加。蒸馏水洗涤去除凝胶中的杂质时，如果使用经过加热至接近沸腾的蒸 馏水，每次洗涤1-2分钟即可。
考马斯亮蓝法——完整版
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
二、试剂与器材
1. 试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏 差，在制作标准曲线时最好选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH
三、操作方法
1、标准曲线的制作
试管编号
0123456
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同
双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离）
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长
用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
考马斯亮蓝染色的原理和方法
考马斯亮蓝染色的原理和方法考马斯亮蓝染色的原理和方法在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝染色最为常用。
因为它既克服了氨基黑染色灵敏度不高的限制，又比银染简便易操作。
考染的历史考马斯亮蓝染色最早由Fazekas等在1963年用于醋酸纤维素膜电泳，并认为同样可用于纸电泳，琼脂糖电泳和淀粉凝胶电泳。
1965年Meyer等将此方法应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。
考染的灵敏度考马斯亮蓝染色可以达到0.2~0.5 μg（200~500 ng），最低可检出0.1 μg蛋白；银染的灵敏度比考染高将近100倍，最低可以检出2 ng蛋白。
通过考染条带的深浅粗细，可以大致判断该条带有多少蛋白，如在8.6×6.8 cm（W×L）?.75 mm厚的胶上15~20 μg蛋白大约是下面这样的条带：考马斯亮蓝染料的种类考马斯亮蓝分为R-150、R-250、R-350、G-250等。
其中R-350最为灵敏，R为红蓝色，G 为绿蓝色。
R-250即三苯基甲烷，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，与氨基黑一样也是结合到蛋白质的碱性基团上。
G-250即二甲花青亮蓝，是一种甲基取代的三苯基甲烷。
推荐一种考染的方法⑴电泳后的凝胶立即浸泡在固定液（500 ml 乙醇，100 ml 冰醋酸，400 ml 蒸馏水）中至少30 min，如有必要可在固定液中浸泡过夜；⑵将固定后的凝胶在热的染色液（0.29 g 考马斯亮蓝溶解在250 ml 脱色液中，在使用前边搅拌边加热至60℃）中浸泡10min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次；⑶多次变换脱色液（250 ml 乙醇，80 ml冰醋酸，加蒸馏水至1 L），直至凝胶背景脱净为止，为加快脱色，可略加温度；以上各步最好用振荡器（摇床）震荡染色皿。
⑷为了防止凝胶干燥后的龟裂，脱去背景色的凝胶在保存液（25 ml 87% 甘油加225 ml 脱色液）中浸泡30min。
然后将凝胶放在玻璃板上，再用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下晾干。
蛋白质浓度的测定
实验九蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
考马斯亮蓝法——完整版
二、试剂与器材
1. 试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml
85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试 剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙 醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离）
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长
用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似
2缺点四bradford法的优缺点1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差在制作标准曲线时最好选用球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差
考马斯亮蓝法——完整版
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
考马斯亮蓝溶液配制方法
考马斯亮蓝溶液配制方法嘿，朋友们！今天咱就来讲讲考马斯亮蓝溶液的配制方法。
这可是个挺重要的事儿呢！先来说说需要准备的东西哈，那就是考马斯亮蓝粉末啦，还有乙醇、磷酸等一些试剂。
就好像做饭得有食材一样，这些就是我们配制溶液的“食材”哟！咱先拿个合适的容器，就像个小碗似的。
然后把适量的考马斯亮蓝粉末放进去，这粉末看着不起眼，可作用大着呢！接着呢，再慢慢地把乙醇倒进去。
哎呀，你可别一下子倒太多啦，得一点点来，就像给花浇水似的，轻轻柔柔的。
然后呢，就开始搅拌啦，要把它们搅拌均匀，让粉末完全溶解在乙醇里，这过程就像是给面团揉匀一样。
等搅拌得差不多了，再加入磷酸等其他试剂。
这一步可不能马虎，加多少得把握好，就跟做菜放盐一样，多了咸少了淡。
加完后继续搅拌搅拌，让它们充分融合在一起。
你说这考马斯亮蓝溶液就像是一个小团队，各种成分就是团队里的成员，只有大家齐心协力，才能发挥出最大的作用呀！在配制的过程中，可得仔细着点，别粗心大意的。
要是不小心弄错了什么，那可就前功尽弃啦！就像盖房子，一块砖没放好，可能整座房子都不结实呢。
等溶液配制好了，就可以拿去用啦。
可以用它来做各种实验，看看蛋白质的含量啥的。
这就像是给我们的科学研究打开了一扇门，让我们能看到更多的奥秘。
你想想，要是没有这正确配制的考马斯亮蓝溶液，那些实验该怎么做呀？那不就像战士上战场没带武器一样嘛！所以说，这配制方法可得好好掌握。
朋友们，都记住了吗？其实配制考马斯亮蓝溶液也不难，只要用心去做，肯定能成功的。
就像我们生活中的很多事情一样，只要肯下功夫，就没有做不到的。
加油吧，让我们一起在科学的海洋里畅游，用这神奇的考马斯亮蓝溶液去探索更多的未知！。
考马斯亮蓝快速染色液
考马斯亮蓝快速染色液
采用以下方法制备：
1)称取0.05-0.2g的考马斯亮蓝G-250，加入30-50ml的无水乙醇搅拌至溶解完全；
2)加入1.5-5g无水硫酸铜或三氯化铬，加入500-800ml超纯水，利用磁力搅拌器以200-600rpm/min的速度搅拌0.5-2小时；
3)加入10-50ml的冰乙酸搅拌至均匀，然后加入10-50ml浓盐酸(也可采用85％磷酸，效果相同)搅拌均匀；
4)加入超纯水定容至1L，采用10000rpm高速离心5min(也可使用普通定性滤纸负抽滤的方式，对最终结果无影响)去除沉淀后即可获得考马斯亮杀菌防腐剂蓝快速染色液。
染色脱色方法如下：1.清洗：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出胶板，切割舍弃浓缩胶瓦克，加入超纯水清洗凝胶一次，再次加入超纯水微波炉中高火加热至沸腾后取出凝胶；2.染色：凝胶尽量滤干水分，放入有盖耐热容器加入快速低刺激考马斯亮蓝染色液，染液需要保证完全覆盖凝胶表面，使用微波炉中高火加热煮沸2-3min；3.初步脱色：取出凝胶用超纯水冲洗凝胶表面残留染液(此时在目的蛋白量较大情况下即可初步看到染色条带)，然后加入超纯水使用微波炉中高火加热3-5min即完成初步脱色(此时可以清晰观察到染色蛋白条带，但凝胶背景色并未完全脱净)；4.彻底脱色：取出凝胶后加入150mMNaCl水溶液，溶液量以完全浸没凝胶且脱色过程中脱色液不坏洒出为度，水平摇床室温50rpm脱色1h即可彻底脱净背景色。
western-blot配胶
1M Tris, pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0
10%SDS
0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5
10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5
TEMED
0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
成分
配制不同体积 SDS-PAGE 浓缩胶所需各成分 的体积(毫升)
0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
成分
配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成分 的体积(毫升)
15%胶
5 10 15 20 30 50
蒸馏水
0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 5.0
30%Acr-Bis(29:1) 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 25.0
30%Acr-Bis(29:1) 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.0
1M Tris, pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0
10%SDS
0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5
10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5
TEMED
考马斯亮蓝染色液(常规法) 考马斯亮蓝染色脱色液(常规法)
快速银染试剂盒 30% Acr-Bis (29:1) 40% Acr-Bis (39:1) Ammonium persulfate (APS) Bromophenol blue/溴酚蓝 Coomassie brilliant blue G250 Coomassie brilliant blue R250
DTT 0.5M DTT 0.5M DTT
考马斯亮蓝法完整版
考马斯亮蓝法（Bradford法）
徐亮
xuliang@
Tianjin Medical University
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
四、Bradford法的优缺点
1、优点
（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光 系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为 1ug蛋白质。
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只 需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
四、Bradford法的优缺点
2、缺点
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料
与蛋白质结合时， 其 max 由 465nm 变为595nm
强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
考马斯亮蓝快速染色液使用说明
考马斯亮蓝快速染色液产品编号产品名称包装P0017 考马斯亮蓝快速染色液 250ml产品简介：考马斯亮蓝快速染色液(Commassie Blue Fast Staining Solution)是以考马斯亮蓝G250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳胶的快速、高灵敏染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
本考马斯亮蓝快速染色液是一种无毒，无刺激性气味的高度环保型染色液。
普通的常规方法需使用剧毒的甲醇及强刺激性的乙酸，而碧云天生产的考马斯亮蓝快速染色液则采取全新配方，实现了无毒和无刺激性气味。
本考马斯亮蓝快速染色液只需一小时或更短时间就可以检测到低达100ng的蛋白电泳条带，而常规方法需3小时以上。
本试剂盒可以进行高灵敏染色，最低可以清楚检测到10ng的蛋白电泳条带，参考图1。
蛋白上样量： 10μg 5μg 2μg 1μg 500ng 200ng 100ng 50ng 20ng 10ng 5ng 2ng 1ng图1. 使用碧云天的考马斯亮蓝快速染色液对不同上样量的BSA蛋白样品用10% SDS-PAGE胶电泳后的两次染色结果。
无需对蛋白和凝胶进行固定，可以不进行脱色，操作更加简单。
本染色液和质谱分析兼容，即经过本染色液染色的蛋白条带或蛋白点可以用于后续的质谱分析。
包装清单：产品编号产品名称包装P0017 考马斯亮蓝快速染色液250ml—说明书1份保存条件：4℃保存，一年有效。
注意事项：本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。
如果使用微波炉加热，请特别注意避免沸腾。
以免因暴沸而导致凝胶碎裂。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1. 电泳结束后，取胶放入约50-100ml蒸馏水中，在摇床上摇动5分钟，倒弃液体，再重复两次，共洗涤三次。
注：本步骤的目的是为了洗去凝胶中的SDS等干扰物质。
如果不能充分去除SDS会导致背景较高，如果胶非常厚，每次的洗涤时间需适当延长并且洗涤次数也需适当增加。
考马斯亮蓝染色液(常规法)
考马斯亮蓝染色液(常规法)产品简介：本考马斯亮蓝染色液(Commassie Blue Staining Solution)是以考马斯亮蓝R250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE 等蛋白电泳胶的常规染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
本染色液可以和碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)配套使用。
使用本染色液进行染色，采用常规染色方法需至少1小时可以完成染色；采用快速染色方法数分钟即可完成染色。
本染色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。
保存条件：室温保存，至少一年有效。
注意事项：需自备脱色液。
脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)。
可以使用枪头盒或适当大小的培养皿作为染色和脱色的容器。
本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1. 常规染色脱色方法：a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。
凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。
凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。
通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。
染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。
c.倒出染色液。
染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d.加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。
注：脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。
也可以使用其它适当的脱色液。
e.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。
期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。
考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法——标准方法1．电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。
加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R—250(溶解于50％甲醇和10％乙酸中)。
2．室温下振摇温育4h至过夜。
3．去除染色液，收集保存可重复使用20～40次。
4．依次在25％甲醇、7．5％乙酸中室温振摇下脱色。
灵敏度为0．1～0．5ttg蛋白／每条带。
注：①使用加热的染液或脱色液可以缩短染色或脱色的时间。
将染液或脱色液在微波炉或水浴中加热(大约50-6013)。
染色时间可缩短至20min，脱色时间约1—2h。
②加入泡沫橡胶(海绵)、羊毛状物或其他物品吸收染料，可以加快脱色时间，特别是在室温下脱色时。
考马斯亮蓝染色法——快速方法1．将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料培养皿中加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R-250(溶解于50％三氯乙酸中)。
2．室温下振摇温育20min。
3．去除染色液，收集保存可重复使用多次，用水洗去未与凝胶结合的染料。
4．加入数倍体积的脱色液(25％甲醇、7％乙酸)。
必要时更换脱色液，将凝胶加温或在脱色液中放入海绵、滤纸片等吸收残余的染料，有助于加快脱色。
灵敏度为1．0ug蛋白／每条带。
考马斯亮蓝染色法——最高灵敏度1．染色前，考马斯亮蓝G-250(系考马斯亮蓝R-250的二甲基化衍生物)必须纯化。
因为商品制剂中的杂质可增强染色背景。
在250m17．5％乙酸中溶解4g染料，加热到70℃；加入44g硫酸铵，溶解后，冷却过滤或置室温离心(3000g，10min)，去除上清液，让染料干燥。
2．配制染色液：在500m1 2％磷酸中溶解30g硫酸铵，待其完全溶解后，加入溶于10m1水中的0．5g 纯化的考马斯亮蓝G—250。
室温保存。
3．电泳后，将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料容器中加入5倍于凝胶体积的12．5％三氯乙酸。
4．室温下振摇温育1h或更长时间。
5．排干液体。
摇动考马斯亮蓝G—250染液，使大颗粒胶体分散，加至凝胶内。
考马斯亮蓝法——完整版
四、Bradford法的优缺点
1、优点
（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光 系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为 1ug蛋白质。
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只 需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
四、Bradford法的优缺点
2、缺点
最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Brad选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH
双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离）
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长
用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似
85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试 剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙 醇，8.5%（W/V）H3PO4。
考马斯亮蓝快速染色液使用说明
色，可以重复2-3次。 注：染色时如果把凝胶和染色液一起放置在微波炉中适当加热，可以大大加快染色速度。但加热时宜尽量避免沸腾，以 免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。 4. 染色至看到清晰的目标蛋白条带后即可停止染色。弃染色液，加入适量的蒸馏水，停止染色反应。然后即可拍照记录。 注：通常使用本染色液染色后背景非常低，如果希望获得更加清晰的蛋白条带，可以加入适量的室温蒸馏水进行洗涤。 通过蒸馏水洗涤可以进一步降低背景。在4℃蒸馏水中浸泡过夜可以获得背景更低，条带更清晰的条带。在次日对4℃蒸 馏水浸泡过夜的已经进行了染色的凝胶再同前一天一样进行染色和洗涤可以进一步改善染色效果，获得更好的考染蛋白 条带。
蛋白上样量： 10μg 5μg 2μg 1μg 500ng 200ng 100ng 50ng 20ng 10ng 5ng 2ng 1ng
图1. 使用碧云天的考马斯亮蓝快速染色液对不同上样量的BSA蛋白样品用10% SDS-PAGE胶电泳后的两次染色结果。
无需对蛋白和凝胶进行固定，可以不进行脱色，操作更加简单。 本染色液和质谱分析兼容，即经过本染色液染色的蛋白条带或蛋白点可以用于后续的质谱分析。
常见问题：
1. 无染色条带：可能上样量太少，建议电泳时加适当量的BSA等作为阳性对照。 2. 背景太高：可能杂质没有除尽，建议延长最初的蒸馏水洗涤时间或增加洗涤次数。也可以在完成染色后，把凝胶放置在
蒸馏水中在室温或4℃进行洗涤。在4℃蒸馏水中浸泡过夜，通常可以取得较好的脱色效果。 3. 染色条带的灵敏度不够理想：可以使用考马斯亮蓝快速染色液进行重复染色，重复染色可以改善染色效果。在加热情况
本考马斯亮蓝快速染色液是一种无毒，无刺激性气味的高度环保型染色液。普通的常规方法需使用剧毒的甲醇及强刺激 性的乙酸，而碧云天生产的考马斯亮蓝快速染色液则采取全新配方，实现了无毒和无刺激性气味。
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使用说明：
1. 常规染色脱色方法： a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温 度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时， 可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。 d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。 e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并 且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。 注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋 白条带的颜色变浅。 f． 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保 存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。 2. 快速染色脱色方法： a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现 胶碎裂的情况。 b. 随后在染色液温度较高的情况下，摇床上摇动5-10分钟。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。 d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。 h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保
存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。
常见问题：
1. 常规染色脱色方法和快速染色脱色方法的优缺点？ 常规染色脱色方法耗时较长，但检测灵敏度更高，染色效果更加稳定。快速染色脱色方法通常检测灵敏度略低，并且在微 波炉加热的过程中有时会出现暴沸导致凝胶碎裂的情况，需特别注意。另外微波炉加热导致的高温会引起染色液和脱色液 中的乙酸的挥发，最好能在通风橱中进行。
产品编号 P0017C
考马斯亮蓝染色脱色液(常规法)
产品名称 考马斯亮蓝染色脱色液
包装 500ml
产品简介：
¾ 本考马斯亮蓝染色脱色液(Commassie Blue Staining Destaining Solution)是用于蛋白凝胶考马斯亮蓝染色后脱色的溶 液。
¾ 本脱色液可以和碧云天的考马斯亮蓝染色液(P0017B)配套使用。 ¾ 使用本脱色液进行脱色，采用常规脱色方法至少脱色1小时可以观察到蛋白条带；采用快速脱色方法不足20分钟即可观察
到蛋白条带。观察到最清晰的蛋白条带则需脱色更长时间。 ¾ 本脱色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。
包装清单：
产品编号
P0017C —
产品名称 考马斯亮蓝染色脱色液
说明书
包装 500ml
1份
保存条件：
室温保存，至少一年有效。
注意事项：
¾ 需自备考马斯亮蓝染色液。染色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色液(P0017B)。 ¾ 可以使用枪头盒或适当大小的培养皿作为染色和脱色的容器。 ¾ 本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。