分子生物学技术和食源性致病菌的快速检测-PPT课件

Taq
3’ 5’ 5’ 3’
荧光PCR技术(Real Time PCR)
CT值 阈值线
阈值线: 荧光阈值的缺省的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍. CT值: 各反应管内的信号到达设定的阈值所经历的循环数.
荧光PCR技术(Real Time PCR)
阈值线
CT值
多重荧光PCR技术
R
分子生物学技术和食源性 致病Leabharlann Baidu的快速检测
1. 与细菌有关的一些分子生物学和 细胞生物学技术; 2. PCR技术; 3. 荧光PCR技术;
4. 相关的一些分子生物学技术在食源性致病菌 的快速检测技术中的应用;
5. 一实例分析个案
与细菌有关的一些分子生物学和 细胞生物学技术
核酸的抽提与纯化(DNA, RNA, 质粒DNA等) 相关核酸的鉴定(PCR, 限制性内切酶和酶切技术及 产物分析, 重组技术, 探针, Southern blotting, Northern blotting, 芯片技术, 序列分析等) 蛋白质的提取与纯化 相关蛋白质的鉴定(Western blotting, 抗原抗体复合物, 标记技术,芯片技术, 序列分析等) 培养细胞技术(用于细菌毒素测定的MTT方法)
荧光PCR技术(Real Time PCR)
SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链DNA染料, 与双链DNA结合后, 其荧光大大增强.
497nm
5‘ 3‘
520nm R R R R R R R
3‘ 5‘
R
荧光PCR技术(Real Time PCR)
TaqMan: 杂交探针的互补区在引物间
PCR-聚合酶链式反应体系
模板DNA 或RNA 一对寡核苷酸引物
4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)
热稳定的聚合酶(Taq)； Mg+缓冲液。
PCR-聚合酶链式反应产物的检测
凝胶电泳：经溴化乙锭染色，在紫外照射下可见橙 红色的特异DNA扩增带并可以在图象成像仪下成像。
M
1
2
3
4
5
6
7
8
N
P
PCR-聚合酶链式反应技术的发展
FAM VIC HEX TET Cy3 Texas Red ROX Cy5 LC640 Cy5.5 LC705 490nm
660nm
限制性内切酶和酶切技术及重组
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异 核苷酸序列的DNA水解酶. 例如: EcoRI 可以识别
5‘…….G 3’…….CTTAA T4连接酶: 重组 酶切与多态性分析技术, AATTC….…3’ G…….5’

荧光PCR技术(Real Time PCR)
PCR +
荧光标记 + 监测系统
Non-specific

DNA binding dyes
SYBR® Green I Ethidium Bromide Hybridization Probes
Specific

TaqManTM molecular beacons dual-oligo FRET pairs
粘性末端
GFP-MIP重组结构
MIP
mip基因是军团菌的巨嗜细胞感染增强子基因，具高度保守性和嗜肺军团菌种的特异性。表达的产物 mip蛋白是迄今所公认的嗜肺军团菌毒力因子之一，是嗜肺军团菌所特有，因此用来鉴定军团菌具有 很强的特异性。
GFP-MIP重组结构
Southern blotting和Northern blotting技术
R6 GFP-ras
10 4 10 days
-Gp +Gp -Gp +Gp
主要步骤: DNA(RNA)提取 和纯化; 凝胶电泳; 印迹转移; 探针和杂交 显色
28S
4
-Gp +Gp -Gp +Gp
raf
(~2.5 kb)
18S
Actin
芯片技术
主要步骤: 芯片的制备 DNA(RNA)提取 和纯化; 探针的制备 杂交 显色 结果判读

5’端连有一个荧光reporter, 通常是荧光素 3’端连有一个Quencher,通常是TAMRA
荧光素被488 nm光激发，发射光为520 nm
520 nm 光能激发TAMRA，发射光为570 nm
probe R
5‘
Q
3‘
R=Reporter Q=Quencher
3‘
5‘
荧光PCR技术(Real Time PCR)
分子 Beacons: 探针有核心的杂交区

探针有自互补末端
在未杂交时探针呈发夹状
报道子, 荧光素在探针的 5’ 端 猝灭子在探针的3’ 端
FRET Probes
l
D
3’ 5’
R
5’ 3’
1-5 bases
Detection
Extension Step
D
3’ 5’
R
Taq
5’ 3’
1. Strand Displacement System Silent 2. Polymerization Complete System Silent
核酸的抽提与纯化
DNA-微量法(平衡酚, 氯仿,乙醇);大量法(碱 列解); 离心法 RNA
质粒DNA -碱变性法, Kit-Qiagen公司 PCR产物- Kit
细菌-直接裂解:释放出DNA
PCR-聚合酶链式反应
（Polymerase Chain Reaction, PCR）
在体外通过酶促反应进行一段特定DNA或RNA片段扩增的 技术为获取目的DNA片段的一项常规技术(诊断和检测) 原理:
不对称PCR 反向PCR 多重PCR 差别PCR 荧光PCR 锚式PCR 重组PCR PCR固相分析 免疫PCR 反转录PCR(RT-PCR) 原位PCR………
荧光PCR技术(Real Time PCR)
荧光是响应于一个短波光的激发， 一个长波长光被发射出来 每个荧光分子都有一个最有效的激发波长 -被激发的荧光分子越多，发射的荧光越强
芯片技术
-Gp +Gp
芯片技术
T I II III IV C C
登革热病毒检测芯片: 1. 通用探针的设计, 合成和筛选, 修饰 2. 分型探针的设计, 合成和筛选, 修饰 3. 预试验, 样品的处理; 4. 杂交及洗涤, 条件优化等 5. 数据库的建立 6. 应用评价 7. 与多重PCR技术的比较
PCR一般过程：
1.变性（denaturation）： 加热使DNA双螺旋的氢 键断裂,双链解离形成单 链DNA。 2.退火（annealling）： 温度降低时使引物和其 互补的模板在局部形成 杂交链。 3.延伸（extension）： 在DNA聚合酶和4种脱 氧核糖核苷酸及Mg2＋存在 的条件下，催化DNA链延 伸反应。