分子生物学常用技术ppt
合集下载
2024版分子生物学常用技术共35张
电泳法
在电场作用下，利用蛋白质带电 性质和分子大小的差异进行分离， 如SDS-PAGE、双向电泳等。
亲和层析法
利用生物分子间的特异性相互作 用进行分离纯化，如免疫亲和层 析、金属螯合亲和层析等。
蛋白质鉴定和定量分析手段Fra bibliotek质谱法
通过测量蛋白质分子的质 量和碎裂模式进行鉴定和 定量分析，如MALDI-TOF MS、LC-MS/MS等。
信号传导途径涉及多种分子，包括受体、配体、信号转导蛋白和效应器等。
信号传导途径的异常与多种疾病的发生和发展密切相关，如癌症、神经退 行性疾病等。
受体介导信号传导途径研究方法
01
受体结合实验
利用放射性标记的配体或抗体， 检测受体与配体的结合情况，确 定受体的类型和数量。
02
信号转导蛋白活性 检测
通过检测信号转导蛋白的磷酸化、 去磷酸化等修饰状态，评估其活 性。
发展历程
自20世纪50年代以来，随着DNA双螺旋结构的发现、遗传密码 的破译、基因工程技术的建立等一系列重大突破，分子生物学 迅速崛起并渗透到生物学的各个领域，推动了整个生物科学的 飞速发展。
分子生物学研究内容
基因与基因组研究 包括基因的结构、功能、表达调控以 及基因组的结构、功能与进化等。
DNA复制、转录与翻译
工具使用
BLAST、Bowtie、BWA等软件进行序列比对；CAP3、Velvet、 SPAdes等软件进行序列拼接。
基因结构和功能预测方法
基因结构预测
通过识别编码区、非编码区、启动子、终止子等 元素，预测基因的结构和组成。
基因功能预测
利用基因表达谱、蛋白质互作网络、代谢通路等 信息，预测基因的功能和调控机制。
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
分子生物学技术ppt课件
• 核酸研究中的应用十分广泛。
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
医学分子生物学ppt完整版
2024/1/30
切除修复
对于较复杂的DNA损伤 ，如嘧啶二聚体或DNA 链断裂，通过切除损伤 部位并合成新的DNA片 段进行修复。
重组修复
在DNA双链断裂等严重 损伤情况下，通过DNA 重组机制进行修复，涉 及同源序列的搜索和交 换。
13
DNA重组的方式与意义
同源重组
发生在同源序列之间的重组，通过交 换DNA片段实现遗传信息的重新组合
6
02
基因与基因组
2024/1/30
7
基因的概念与结构
01 基因的定义
基因是遗传信息的基本单位，控制生物性状的遗 传。
02 基因的结构
基因由编码区和非编码区组成，编码区包括外显 子和内含子。
03 基因的遗传效应
基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状。
2024/1/30
8
基因组的组成与特点
01 基因组的定义
基因表达的调控方式
基因表达受到多种因素的调控，包括 转录因子、表观遗传学修饰、 microRNA等。
2024/1/30
10
03
DNA复制、修复与重组
2024/1/30
11
DNA复制的过程与特点
1
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种酶和蛋白 质的参与，确保DNA的准确复制。
2 3
DNA复制的特点
结合分子生物学指标，对 药物疗效进行评估，为新 药研发和临床应用提供依 据。
29
分子生物学技术在个体化医疗中的应用
基因检测
通过基因检测分析个体基 因组信息，为个体化医疗 提供基础数据。
2024/1/30
个体化用药指导
根据基因检测结果和药物 代谢特点，为患者提供个 体化用药建议，提高药物 治疗效果。
切除修复
对于较复杂的DNA损伤 ，如嘧啶二聚体或DNA 链断裂，通过切除损伤 部位并合成新的DNA片 段进行修复。
重组修复
在DNA双链断裂等严重 损伤情况下，通过DNA 重组机制进行修复，涉 及同源序列的搜索和交 换。
13
DNA重组的方式与意义
同源重组
发生在同源序列之间的重组，通过交 换DNA片段实现遗传信息的重新组合
6
02
基因与基因组
2024/1/30
7
基因的概念与结构
01 基因的定义
基因是遗传信息的基本单位，控制生物性状的遗 传。
02 基因的结构
基因由编码区和非编码区组成，编码区包括外显 子和内含子。
03 基因的遗传效应
基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状。
2024/1/30
8
基因组的组成与特点
01 基因组的定义
基因表达的调控方式
基因表达受到多种因素的调控，包括 转录因子、表观遗传学修饰、 microRNA等。
2024/1/30
10
03
DNA复制、修复与重组
2024/1/30
11
DNA复制的过程与特点
1
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种酶和蛋白 质的参与，确保DNA的准确复制。
2 3
DNA复制的特点
结合分子生物学指标，对 药物疗效进行评估，为新 药研发和临床应用提供依 据。
29
分子生物学技术在个体化医疗中的应用
基因检测
通过基因检测分析个体基 因组信息，为个体化医疗 提供基础数据。
2024/1/30
个体化用药指导
根据基因检测结果和药物 代谢特点，为患者提供个 体化用药建议，提高药物 治疗效果。
分子生物学(共19张PPT)
04
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成与结构
氨基酸通过肽键连 接形成多肽链，即 蛋白质的一级结构 。
多条多肽链组合在 一起，形成蛋白质 的三级结构。
蛋白质的基本组成 单位是氨基酸，共 有20种常见氨基酸 。
多肽链经过盘绕、 折叠形成二级结构 ，主要形式包括α螺旋和β-折叠等。
在特定条件下，蛋 白质可形成四级结 构，由多个亚基组 成。
发展历程
从20世纪50年代DNA双螺旋结构 的发现开始，分子生物学经历了 飞速的发展，成为现代生命科学 中最为活跃和前沿的领域之一。
分子生物学的研究对象与任务
研究对象
主要包括DNA、RNA、蛋白质Байду номын сангаас生 物大分子，以及它们之间的相互作用 和调控机制。
研究任务
揭示生物大分子的结构、功能及其相 互作用机制；阐明基因表达调控的分 子机制；探索生物大分子在生命过程 中的作用和意义。
转录因子
01
真核生物中存在大量转录因子，它们与DNA特定序列结合，激
活或抑制基因转录。
表观遗传学调控
02
通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式，改变染色质结构，影响
基因表达。
microRNA调控
03
microRNA是一类小分子RNA，通过与mRNA结合，抑制其翻
译或促进其降解，从而调节基因表达。
基因表达调控的分子机制
发育生物学研究生物体的发育过程，而分子 生物学则揭示了发育过程中基因表达和调控 的分子机制。
02
DNA的结构与功能
DNA的分子组成与结构
DNA的基本组成单位
脱氧核糖核苷酸，由磷酸、脱氧核糖 和碱基组成。
DNA的碱基
DNA的双螺旋结构
分子生物学课件(共51张PPT)
二级结构
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
《分子生物学全套》ppt课件
分子生物学定义
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
《分子生物学技术》课件
基因克隆和序列分析
获取目标蛋白质的基因序列， 进行必要的克隆操作和序列分 析。
表达和纯化
将改造后的基因导入表达系统 ，表达并纯化目标蛋白质。
确定目标蛋白质
根据实际需求，选择需要改造 的蛋白质。
基因突变和改造
根据需要，对基因进行突变和 改造，以改变蛋白质的结构和 功能。
性能评估
对改造后的蛋白质进行性能评 估，包括结构和功能分析。
CHAPTER 03
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术的定义与原理
蛋白质工程技术的定义
蛋白质工程技术是通过基因工程技术 对蛋白质进行改造，以达到改善或优 化蛋白质的特性和功能的一种技术手 段。
蛋白质工程技术的原理
基于基因工程技术，通过改变蛋白质 编码基因的序列，实现蛋白质结构和 功能的优化。
蛋白质工程技术的操作步骤
《分子生物学技术》 ppt课件
contents
目录
• 分子生物学技术概述 • 基因工程技术 • 蛋白质工程技术 • 基因组学技术 • 生物信息学技术
CHAPTER 01
分子生物学技术概述
定义与分类
定义
分子生物学技术是以分子为研究 基础，通过分析分子的结构、功 能和相互作用的科学方法。
分类
分子生物学技术包括基因工程技 术、蛋白质工程技术、基因组学 技术和生物信息学技术等。
详细描述：基因工程技术是一种利用重组DNA技术对生物体的遗传物质进行操作 的方法。其原理基于分子遗传学和生物化学的基本原理，通过人工设计和构建基 因表达载体，将外源基因导入受体细胞，实现基因的转移、表达和调控。
基因工程技术的操作步骤
总结词：全面解析
详细描述：基因工程技术主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检 测等步骤。其中，基因表达载体的构建是整个技术的核心环节，涉及到限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶的应用。
获取目标蛋白质的基因序列， 进行必要的克隆操作和序列分 析。
表达和纯化
将改造后的基因导入表达系统 ，表达并纯化目标蛋白质。
确定目标蛋白质
根据实际需求，选择需要改造 的蛋白质。
基因突变和改造
根据需要，对基因进行突变和 改造，以改变蛋白质的结构和 功能。
性能评估
对改造后的蛋白质进行性能评 估，包括结构和功能分析。
CHAPTER 03
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术的定义与原理
蛋白质工程技术的定义
蛋白质工程技术是通过基因工程技术 对蛋白质进行改造，以达到改善或优 化蛋白质的特性和功能的一种技术手 段。
蛋白质工程技术的原理
基于基因工程技术，通过改变蛋白质 编码基因的序列，实现蛋白质结构和 功能的优化。
蛋白质工程技术的操作步骤
《分子生物学技术》 ppt课件
contents
目录
• 分子生物学技术概述 • 基因工程技术 • 蛋白质工程技术 • 基因组学技术 • 生物信息学技术
CHAPTER 01
分子生物学技术概述
定义与分类
定义
分子生物学技术是以分子为研究 基础，通过分析分子的结构、功 能和相互作用的科学方法。
分类
分子生物学技术包括基因工程技 术、蛋白质工程技术、基因组学 技术和生物信息学技术等。
详细描述：基因工程技术是一种利用重组DNA技术对生物体的遗传物质进行操作 的方法。其原理基于分子遗传学和生物化学的基本原理，通过人工设计和构建基 因表达载体，将外源基因导入受体细胞，实现基因的转移、表达和调控。
基因工程技术的操作步骤
总结词：全面解析
详细描述：基因工程技术主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检 测等步骤。其中，基因表达载体的构建是整个技术的核心环节，涉及到限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶的应用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第十七章
分子生物 学常用技
术
分子生物学常用技术
凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片
第一节 凝胶电泳
(gel electrophoresis)
电泳概念 基本原理
Q μ＝
6πrη
μ: 迁移率 电荷量 r : 粒子半径（分子量） η: 度
答疑：1.10 (9:00-11:30; 3:00-5:30) 地点：逸夫楼3楼生化实验室
三、探针(probe)
探针的概念 探针的类型 标记物的种类 标记方法
1. 探针的概念
特异结合和检测靶分子的活性物质
–抗原－抗体 –配体－受体 –同源DNA/RNA
2. 探针的类型
1. 电荷效应
核酸是两性电解质
pH = 3.5 ,
正电荷
pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极
2.分子筛效应
小分子移动快 ，大分子移动慢
3. 分子构象
-
+
闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA
（二）操作要点
支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收
35ul/100ml
PAGE装置
电泳
4. 凝胶中DNA的检测
溴乙锭染色法 银盐染色法
Ag+－DNA
放射自显影法
Ag（黑褐甲色醛） 还原
5.DNA片段的回收
压碎浸泡法
– <1kb – 纯度高，回收率低
（三）PAGE优点
机械强度好、化学稳定性高 分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高
5. 样品制备
上样缓冲液
– 50%甘油/蔗糖 – 0.5%溴酚蓝/二甲苯
青
点样
6.电泳条件
潜水电泳 恒压电泳
– 低压: 1~2V/cm – 中压: 8~10V/cm – 高压电泳：>几十V/cm
温度：15~25℃
潜水电泳
7.电泳染色
溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法
固相支持物的种类
硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter
membrane) 尼龙膜(nylon membrane)
1.硝酸纤维素滤膜
特点
– 吸附ssDNA和RNA – 杂交信号本底低
不足
– 不适于重复杂交 – 滤膜较脆 – 不适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(<200bp)结合能力弱
（四）PAGE应用范围
分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析
第二节 分子杂交
分子杂交的基本原理 固相支持物 探针 几种常用杂交技术
一、分子杂交的基本原理
核酸的变性和复性
分 子 杂 交
DNA-DNA
DNA-RNA
–加入凝胶液中 –电泳结束后染色
EB染色原理
紫外灯下显色
8. DNA片段的回收
低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(>5kb) DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)
（三）应用围
DNA的分离、纯化和鉴定
– 限制性酶切图谱分析 – 重组体的分离、鉴定 – 杂交分析 – PCR产物的分离鉴定
试剂
制备浓度(%)
(ml) 3.5 5.0 8.0 12 20
30%Acr 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6
ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5XTBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
10%AP 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED
杂交条件
靶分子 探针 杂交袋 杂交炉
杂交种类
被检核酸种类和方法
– 原位杂交 – 斑点杂交 – Southern杂交 – Northern杂交 – Western杂交
反应介质
– 液相杂交 – 固相杂交()
二、固相支持物
固相支持物的特性
–结合能力强 –不影响杂交反应 –结合牢固 –非特异性吸附少 –机械性能良好
2. 尼龙膜
特点
– 结合能力强 – 可反复杂交 – 韧性强 – 适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(10bp)结合能力强
不足
– 杂交信号本底较高
分子生物学考试
时间：2005.1.11(晚7:00-9:00) 地点
– 9教讲演厅 (150人) – 9-2-1 (50人) – 9-2-2 (50人) – 9-3-1 (50人)
琼脂糖凝胶电泳
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis,
分离原理
PAGE)
操作要点
优点
应用范围
（一）分离原理
电荷效应 分子筛效应
PAGE支持物
单体－丙烯酰胺(Acr) 交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂－过硫酸胺(AP) 加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二
胺(TEMED)
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶
（二）操作要点
凝胶的分类 凝胶浓度的选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测 DNA片段的回收
1. 凝胶的分类
非变性凝胶：dsDNA 变性凝胶: ssDNA
–尿素 –甲酰胺 –SDS
2. 凝胶浓度的选择
3. 凝胶液的配制
Q: 介质粘
电泳的用途
–分离 –鉴定纯度 –测定分子量
凝胶电泳的种类
–琼脂糖凝胶电泳 –聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis)
分离核酸原理 操作要点 应用范围
（一）分离核酸原理
电荷效应 分子筛效应 分子构象
1. 支持物
商品化的琼脂糖
琼脂糖种类
普通 低熔点 高纯 高筛分
熔点 80~90℃ <70℃ 80~90℃ 80~90℃
机械强度 中
差
高
高
分辨率 中
差
中
高
2. 凝胶浓度的选择
凝胶的制备
3. DNA marker
DNA marker
DNA 长度标准曲线
4. 电泳缓冲液
Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0
基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 蛋白质或多肽探针
分子生物 学常用技
术
分子生物学常用技术
凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片
第一节 凝胶电泳
(gel electrophoresis)
电泳概念 基本原理
Q μ＝
6πrη
μ: 迁移率 电荷量 r : 粒子半径（分子量） η: 度
答疑：1.10 (9:00-11:30; 3:00-5:30) 地点：逸夫楼3楼生化实验室
三、探针(probe)
探针的概念 探针的类型 标记物的种类 标记方法
1. 探针的概念
特异结合和检测靶分子的活性物质
–抗原－抗体 –配体－受体 –同源DNA/RNA
2. 探针的类型
1. 电荷效应
核酸是两性电解质
pH = 3.5 ,
正电荷
pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极
2.分子筛效应
小分子移动快 ，大分子移动慢
3. 分子构象
-
+
闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA
（二）操作要点
支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收
35ul/100ml
PAGE装置
电泳
4. 凝胶中DNA的检测
溴乙锭染色法 银盐染色法
Ag+－DNA
放射自显影法
Ag（黑褐甲色醛） 还原
5.DNA片段的回收
压碎浸泡法
– <1kb – 纯度高，回收率低
（三）PAGE优点
机械强度好、化学稳定性高 分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高
5. 样品制备
上样缓冲液
– 50%甘油/蔗糖 – 0.5%溴酚蓝/二甲苯
青
点样
6.电泳条件
潜水电泳 恒压电泳
– 低压: 1~2V/cm – 中压: 8~10V/cm – 高压电泳：>几十V/cm
温度：15~25℃
潜水电泳
7.电泳染色
溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法
固相支持物的种类
硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter
membrane) 尼龙膜(nylon membrane)
1.硝酸纤维素滤膜
特点
– 吸附ssDNA和RNA – 杂交信号本底低
不足
– 不适于重复杂交 – 滤膜较脆 – 不适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(<200bp)结合能力弱
（四）PAGE应用范围
分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析
第二节 分子杂交
分子杂交的基本原理 固相支持物 探针 几种常用杂交技术
一、分子杂交的基本原理
核酸的变性和复性
分 子 杂 交
DNA-DNA
DNA-RNA
–加入凝胶液中 –电泳结束后染色
EB染色原理
紫外灯下显色
8. DNA片段的回收
低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(>5kb) DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)
（三）应用围
DNA的分离、纯化和鉴定
– 限制性酶切图谱分析 – 重组体的分离、鉴定 – 杂交分析 – PCR产物的分离鉴定
试剂
制备浓度(%)
(ml) 3.5 5.0 8.0 12 20
30%Acr 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6
ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5XTBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
10%AP 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED
杂交条件
靶分子 探针 杂交袋 杂交炉
杂交种类
被检核酸种类和方法
– 原位杂交 – 斑点杂交 – Southern杂交 – Northern杂交 – Western杂交
反应介质
– 液相杂交 – 固相杂交()
二、固相支持物
固相支持物的特性
–结合能力强 –不影响杂交反应 –结合牢固 –非特异性吸附少 –机械性能良好
2. 尼龙膜
特点
– 结合能力强 – 可反复杂交 – 韧性强 – 适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(10bp)结合能力强
不足
– 杂交信号本底较高
分子生物学考试
时间：2005.1.11(晚7:00-9:00) 地点
– 9教讲演厅 (150人) – 9-2-1 (50人) – 9-2-2 (50人) – 9-3-1 (50人)
琼脂糖凝胶电泳
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis,
分离原理
PAGE)
操作要点
优点
应用范围
（一）分离原理
电荷效应 分子筛效应
PAGE支持物
单体－丙烯酰胺(Acr) 交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂－过硫酸胺(AP) 加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二
胺(TEMED)
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶
（二）操作要点
凝胶的分类 凝胶浓度的选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测 DNA片段的回收
1. 凝胶的分类
非变性凝胶：dsDNA 变性凝胶: ssDNA
–尿素 –甲酰胺 –SDS
2. 凝胶浓度的选择
3. 凝胶液的配制
Q: 介质粘
电泳的用途
–分离 –鉴定纯度 –测定分子量
凝胶电泳的种类
–琼脂糖凝胶电泳 –聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis)
分离核酸原理 操作要点 应用范围
（一）分离核酸原理
电荷效应 分子筛效应 分子构象
1. 支持物
商品化的琼脂糖
琼脂糖种类
普通 低熔点 高纯 高筛分
熔点 80~90℃ <70℃ 80~90℃ 80~90℃
机械强度 中
差
高
高
分辨率 中
差
中
高
2. 凝胶浓度的选择
凝胶的制备
3. DNA marker
DNA marker
DNA 长度标准曲线
4. 电泳缓冲液
Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0
基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 蛋白质或多肽探针