昆虫基因组DNA的提取(CTAB法)

果蝇基因提取实验报告

一、实验目的1. 熟悉并掌握果蝇基因提取的基本原理和实验操作步骤。

2. 学习利用CTAB法从果蝇唾腺中提取DNA。

3. 探讨不同提取方法对果蝇DNA提取效率的影响。

二、实验原理果蝇作为遗传学研究的经典模式生物，其基因提取实验对于后续的分子生物学研究具有重要意义。

本实验采用CTAB法从果蝇唾腺中提取DNA，该方法简单、高效，适用于小量DNA的提取。

CTAB法的基本原理是利用CTAB与DNA的结合能力，以及酚-氯仿抽提法去除蛋白质和RNA等杂质，从而获得纯净的DNA。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）唾腺2. 试剂：CTAB缓冲液、酚-氯仿、异丙醇、70%乙醇、TE缓冲液、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等四、实验步骤1. 果蝇唾腺的制备：将果蝇麻醉后，用解剖针轻轻挑取唾腺。

2. DNA提取：a. 将唾腺置于1.5ml离心管中，加入CTAB缓冲液（含EDTA）；b. 加入酚-氯仿，充分振荡混匀；c. 12,000r/min离心10min，取上清液；d. 加入等体积的异丙醇，充分混匀；e. 12,000r/min离心10min，弃上清液；f. 用70%乙醇洗涤沉淀，12,000r/min离心5min，弃上清液；g. 将沉淀溶于TE缓冲液中，即可获得DNA溶液。

3. DNA纯度检测：采用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA纯度。

五、实验结果与分析1. 通过CTAB法从果蝇唾腺中提取的DNA，在琼脂糖凝胶电泳中呈现出清晰的DNA条带，说明提取的DNA质量较好。

2. 与其他DNA提取方法相比，CTAB法具有操作简便、提取效率高、DNA纯度好等优点。

六、实验结论本实验成功从果蝇唾腺中提取了高质量的DNA，为后续的分子生物学研究奠定了基础。

CTAB法是一种简单、高效的果蝇DNA提取方法，适用于小量DNA的提取。

七、实验注意事项1. 操作过程中要避免DNA的污染，实验器材要清洗干净，操作时要戴口罩和手套。

CTAB法提取动物DNA

ｉｒｖｄＣＴｓｕｅｎｇｎｍｉｍｐｏｅＡＢｗａｓｄｉｅｏｃＤＮＡｘｒｃｉｎｆｏａｉｌｉｓｅ．ｅｒｓｌｓｉｄｃｔｄｔａｈｍｐｏｅＡＢｅｔａｔｏｒｍｎｍａｓｕｓＴｈｅｕｔｎｉａｅｈｔｔｅｉｒｖｄＣＴｔｍｅｈｄｈｄｐｉｉｇｓｏｈｒｉｐｎｈｇｅｑａｉｆＤＮＡｒｄｃ，ｗｏｓ，ｎｏｖｎｉｎｒｍｏｅｕａｉｌｇｔｏａｒｖｌｅｆｓｏｔｔｍｅｓａ，ｉｈｒｕｌｙｏｅｔｐｏｕｔｏｃｔａｄｃｎｅｅｔｆｌｃｌｒｂｏｏｙｌｏｌｂｔａｈｉｇｉｉｈｔｅｓｍｅｍｅｈｄｗａｌｏｕｅｎＤＮＡｎｄＲＮＡｘｒｃｉｎｆｏｐａｔｍａｉｇｉａｓｓｅｔｃａｅｃｎ．ｗｈｃｈａｔｏｓａｓｓｄｉｎａｅｔａｔｒｍｌｎ．ｋｎｔｙｔｍａｉｏ
ｍｅｈｄｉｈｂｔａｈｎｇＡｎｈｓＣＴｔｄｗａｅｈｄｎｔｏｌｓｄｉｅｅｒｈｂｌｏｕｓｄｉａｇｃｌｂｔｏｔｅｌｅｃｉ．ｄｔｕ．ＡＢｍｅｈｏｓａｍｔｏｏｎｙｕｅｒｓａｃ，ｕｔｓｅｎｌｒｅｓａｅｌｎａｎａａ
组ＤＡＮ的提取。结果表明，改进后的ＣＡ法具有时间短、质量高、成本低的优点，与实验教学中植物ＤＡＮ提取的方ＴＢＮ和ＲＡ
法相一致，使分子生物学教学用品一体化，价格低廉化，效果改进，是一个不仅可以用于研究，也可以大规模用于实验

ctab法提取dna的原理

ctab法提取dna的原理
CTAB法（Cetyltrimethylammonium Bromide）是一种常用于
提取DNA的方法，原理是利用CTAB结合DNA形成稳定的DNA-CTAB复合物。

与DNA相结合的CTAB可以将其他细
胞组分如蛋白质和RNA等溶解。

下面将介绍CTAB法的操作
步骤：
1. 准备样品：将待提取DNA的生物材料如植物叶片或动物组
织切碎，并放入离心管中。

2. 加入CTAB溶液：向离心管中加入含有CTAB的提取缓冲液，CTAB会结合DNA并分离细胞组分。

3. 细胞破碎：将离心管置于60-65°C的水浴中，短暂加热使细
胞完全破碎。

4. 酚/氯仿提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇匀并离心。

这一步可以将DNA从细胞残渣和其他溶解物中提取出来。

5. DNA沉淀：将上清液转移到新的离心管中，加入等体积的
异丙醇，再次轻轻摇匀。

在冰上静置几分钟后离心，可使
DNA沉淀到离心管底部。

6. 溶解DNA：倒掉上清液，加入70%乙醇洗涤DNA沉淀，
离心去除乙醇。

再次离心后，将残留的乙醇洗涤液倒掉，将离心管倒置在纸巾上，将DNA自然风干。

通过以上步骤，利用CTAB法可以提取到高质量的DNA样品。

此方法的优势在于CTAB的高度阳离子性可以有效溶解其他
细胞组分，而不影响DNA的稳定性。

同时，CTAB法适用于
不同种类的生物材料，如植物，微生物和动物组织等。

ctab法提取dna

ctab法提取dnaCTAB (cetyltrimethylammonium bromide) is a detergent that is commonly used in DNA extraction protocols. It helps to break down the cell wall and release the DNA, which can then be purified using techniques such as centrifugation or precipitation. To extract DNA using CTAB, you will need to follow a protocol that typically involves the following steps:1.Grind the tissue or cells that you want to extract DNA from using a mortarand pestle or other mechanical method.2.Add a lysis buffer (usually containing CTAB and other reagents) to the groundtissue or cells and incubate at a high temperature (usually around 65-70°C) to denature the proteins and release the DNA.3.Add a precipitation agent (such as isopropanol or ethanol) to the lysis mixtureto help the DNA come out of solution and form a precipitate.4.Spin the mixture in a centrifuge to pellet the DNA.5.Carefully remove the supernatant (the liquid above the pellet) and wash thepellet with a wash solution (such as 70% ethanol) to remove any remaining contaminants.6.Dissolve the DNA pellet in a suitable buffer (such as Tris-EDTA or TE) andstore it at 4°C until you are ready to use it.7.It is important to carefully follow the steps of the protocol and use goodlaboratory practices when extracting DNA, as contaminants or mistakes can affect the quality and yield of the final DNA sample.翻译CTAB（乙基三甲基氨基甲酸铬）是一种洗涤剂，常用于DNA提取协议。

CTAB法提取植物总DNA

CTAB法提取植物总DNACTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide法）是一种常用的植物总DNA提取方法，其优点是简单、高效、成本低、适用性广，能够快速提取高质量的DNA。

CTAB法利用季铵盐CTAB（Cetyltrimethylammonium bromide）和NaCl共同提取植物样品中的DNA。

下面就CTAB法的步骤进行详细介绍。

材料：- 植物样品- CTAB提取缓冲液（含0.6 M CTAB和NaCl）- 65℃和37℃的水浴- 70%、95%和100%的乙醇- TE 缓冲液（含10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA，pH 8.0）步骤：1. 准备植物样品将新鲜植物样品（约0.1g）用液氮粉碎成粉末，加入2 mL CTAB提取缓冲液中，研磨均匀。

可以使用带球磨器或者手持器具进行研磨。

2. 加入蛋白酶K加入加入50μL蛋白酶K (20mg/L) 溶液后，65℃恒温振荡2~3 h。

蛋白酶K的作用是降解蛋白质，提高DNA的纯度。

3. 加入腰芽菜素和EB加入5μL腰芽菜素（10mg/mL）和5μL EB（1mg/mL）后，65℃水浴12~15min，使溶液呈现棕黄色，使样品中的腰芽菜素结合到DNA上。

4. 加入氯仿和异丙醇加入等体积氯仿和异丙醇后，轻轻摇匀，离心10min。

离心之后，样品分为四层：上层是异丙醇、第二层是氯仿，中间是粘稠的蛋白质、细胞碎片和杂质，最下面是DNA层。

5. 取出DNA层用200μL的容器沿着DNA层边缘吸取DNA，转移到新管中，并加入300μL75%乙醇洗涤，旋转离心5min，弃上清液，重复一次，最后用吹风机将残留的乙醇风干。

6. 测定DNA浓度用TE缓冲液稀释后测定DNA的浓度和纯度，可以用紫外线光度计进行测定。

测定的结果应该控制在1.8-2.0左右。

总之，CTAB法是一种有效、简单的DNA提取方法，与其他方法相比具有简便易行、节省时间和成本的优势。

CTAB法提取植物基因组DNA

CTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。

当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。

CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

主要试剂与溶液的配制：PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）巯基乙醇氯仿︰异戊醇（24︰1）异丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA无水乙醇CTAB 溶液：CTAB——20g/LNaCl（58.44）——1.4 mol/L（81.816g）EDTA（292.25）——10 mmol/L（2.9225g）Tris（121.14）——100 mmol/L（12.114g）pH 8.01×TE 缓冲液：EDTA（292.25）——1 mmol/L（0.29225g）Tris（121.14）——10 mmol/L（1.2114g）pH 8.0NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）pH 4.0植物总DNA的提取1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。

CTAB法提取基因组DNA

CTAB法[30]提取玉米（或其余植物）基因组DNA1) 取 ~1 g 玉米叶片，加入液氮粉碎，加入2mL 2% 65℃保温的 2×CTAB抽提液，混匀， 65℃保温 30～60min。

2)加入等体积的氯仿 / 异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀， 10000r/min ，离心 5min。

3)取上清，加入 1/10 体积（约）的 65℃的 10× CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。

4)用等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24：1）抽提， 10000r/min ，离心 5min。

5)取上清，加入（正好）等体积的 CTAB积淀液，颠倒混匀，如积淀可见，持续做下步，否则， 65℃保温 30min。

6)4℃， 2700 r/min ，离心 5min。

7)去上清，用高盐的 TE buffer 重悬（～）。

（可 65℃保温 30min，至大多数溶解）。

8) 加入体积的异丙醇积淀核酸，充分混匀， 4℃， 10000 r/min ，离心 15min。

9) 去上清， 80%乙醇洗涤积淀，干燥，用尽可能少的 TE buffer 重悬。

高盐的 TE buffer终浓度配制 50ml10mM , (1M 母液 )0.1mM EDTA, (0.5M 母液 )1M NaCl 1.8g室温可保留几年CTAB提取液终浓度配制 200ml2%(W/V) CTAB 4g100mM , 20ml(1M 母液 )20mM EDTA, 8ml(0.5M 母液 )1.4M NaCl 10.22g室温可保留几年10×CTAB/NaCl溶液 (10%CTAB/0.7M NaCl)在 80ml H2O 中溶解 4.1g NaCl ，迟缓加入 10g CTAB，同时加热并搅拌。

如果需要，可加热至 65℃溶解。

定容至 100ml。

CTAB积淀液终浓度配制 100ml1%(W/V) CTAB 1g50mM , 5ml(1M 母液 )10mM EDTA, 2ml(0.5M 母液 )室温可保留几年CTAB法提取植物干品（或真菌）基因组DNA（自己改良版）10)取 0.2g 叶片，加入液氮粉碎，加入 800μL 2% 65℃保温的 2×CTAB抽提液，混匀， 65℃保温 30～60min。

CTAB法提取DNA原理及步骤、制胶、电泳

CTAB法提取DNA的原理及步骤：冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。

通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。

低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。

CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。

通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。

随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB 。

1.研磨2.加1000ul预处理液，10-15min，4000r，10min,弃上清（重复）预处理液：Tris-hcl (PH8.0)提供缓冲环境，防止核酸被破坏。

EDTA （螯合二价阳离子）0.5M抑制DNase活性。

Nacl 5M提供高盐环境，使DNA充分溶解。

β-巯基乙醇抗氧化剂，去除酚，糖，能与酚形成络合物，也可与糖结合。

3.加800ul2×CTBA(预热），10ul β-巯基乙醇，65℃水浴1-2h。

15min 震荡4.冷至室温，离心1000r ,10min ,取上清750ul，加800ul氯仿-异戊醇（24:1），抽提10min，1000r，15min,重复3次。

氯仿：加速有机相与水相分层，去除核酸溶液中残余酚，抽提蛋白质等杂质。

5.取上清，加2倍体积的无水乙醇，-20℃,1h,沉淀DNA.无水乙醇：DNA不溶于酒精，CTAB和一些蛋白质可以，低温乙醇可抑制DNase 活性，降低分子运动，易于DNA沉淀。

6. 4℃，1000r,10min,倒乙醇，收集DNA.7. 70％乙醇洗涤2遍，风干（不可太干），溶于40-60ul dd水。

DNA在凝胶中涌动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此能以同样的速率向正极移动。

在一定电场强度下，DNA分子的歉意速率取决于分子筛效应，即DNA本身的大小。

CTAB法提取真菌(霉菌、酵母)基因组DNA

CTAB法提取真菌（霉菌、酵母）基因组DNA--试剂配制方法及操作步骤一、试剂配制（一）2%CTAB缓冲液：1、各试剂终浓度：CTAB粉末——20g/L即10X TE{ Tris-HCl PH8.0——100 mmol/LEDTA PH8.0——20 mmol/L }NaCl——1.4mol/L2、配制方法：（1）配制1L: 20gCTAB+100mlTris-HC母液（1m/L）+40mlEDTA母液（0.5m/L）+81.816gNaC I 定容至1L。

（2）配制100ml: 2gCTAB+10mlTris-HC母液（1m/L）+4mlEDTA母液（0.5m/L）+8.1816gNaCl 定容至100ml。

（3）配置 1 x TE100ml10ml Tris-HCl母液（1m/L）+ 4ml EDTA母液（0.5m/L)（二）巯基乙醇分装1ml于离心管中，2%CTAB缓冲液与巯基乙醇以50:1体积混合。

（三）Tris-苯酚、氯仿、异戊醇1 、各试剂浓度：苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）2、配制方法：Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混合均匀，即，移入棕色玻璃瓶中4C保存。

（四）NaAc 和Nacl1 、浓度：3mol/L2、配制方法：（ 1 ）3MNaAc10ml：称取2.46gNaAc，pH4.0，用ddH2O定容到10ml;（称量40.8gNaOAc.H2O#于烧杯中，加入冰醋酸调节pH到5.2，定容到100ml）；（2）5M NaCl 100ml：称取29.22g NaC,用ddH2O 定容到100ml 称取292.2gNaCI置于1L烧杯中，加入约800 ml的去离子水后搅拌溶解加去离子水将溶液定容到1L后，适量分成小份高温高压灭菌后，4C保存。

二、试验准备（一）1 、高压1.5ml无核酸酶离心管Xn个样品、2ml、5ml离心管；2、高压超纯水500ml （去离子水）用于试剂配制；3、枪头10 小200 小1000";（二）1、巯基乙醇10" X个样品，分装于2ml管；2、T ris-苯酚500" X个样品，分装于5ml管；3、氯仿480" X个样品，分装于5ml管；4、异戊醇20" X个样品，分装于5ml管；5、70%乙醇1.2ml X个样品，分装于5ml管；6、水浴锅65C预热、37C预热；7、N aAc150" X个样品，分装于5ml管；& -20 C预冷无水乙醇1.1ml X个样（或异丙醇），800" X个样品、氯仿异戊醇（24:1） 500" X个样品；9、RaseA B（10mg/ml）解冻；三、试验步骤1、2%CTAB裂解液500" X个样品，放于65C水浴锅中预热；2、真菌悬液离心得到大约100mg 真菌组织于2.0 mL 离心管；3、10" X个样品巯基乙醇加到预热的2%CTAB裂解液中；4、每个样品中加510"CTAB和巯基乙醇混合液，100mg玻璃珠，旋涡震荡研磨裂解30min 或以上（裂解一定要彻底）；5、放入65C水浴锅中，保温30~60min,期间轻摇数次（一般20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔）。

2016生理生化实验课资料

硕士研究生《昆虫生理生化实验技术》课程代码：3012100018开课单位：植物科技学院责任教师：牛长缨研究生：学号：实验一昆虫血淋巴中蛋白质的分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳法）一、实验目的掌握凝胶电泳基本方法，并测定各种昆虫，以及同一种昆虫不同发育阶段的血淋巴的蛋白谱。

二、实验原理昆虫的各种组织，均含有多种蛋白质和各种酶类。

在血淋巴中经分离和纯化后已鉴定的蛋白质有：卵黄原蛋白，脂蛋白，贮存蛋白，滞育蛋白，抗菌蛋白，抗冷蛋白等。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离蛋白质和酶类，可以得到满意的蛋白谱和酶谱，通常能分离到20－30条带。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂（过硫酸胺）与加速剂（四甲基乙二胺）的作用下，聚合交联而成，具有三维网状结构，能起分子筛的作用，因此常用它作为电泳支持物。

对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。

此外，凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH和凝胶孔径梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带。

从而提高了分离效果。

三、实验材料和仪器供试昆虫：菜青虫试剂及配制：1．Acr:丙烯酰胺Bis:甲叉双丙烯酰胺TEMED:四甲基乙二胺AP:过硫酸胺Tris:三羟甲基氨基甲烷A：1mol/L HCl 48ml；Tris 36.3g；加水至100ml，pH 8.9；贮存于棕色瓶内，4℃保存。

B：Acr 30g；Bis 0.8g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存。

C：10%AP 1gAP加9ml水，最好现用现配，贮存于棕色瓶内。

D：1mol/L HCl 48ml；Tris5.98g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存.E：Tris6g；甘氨酸28.8g；加水至1000ml，pH8.3(电极缓冲液)2．1％溴酚蓝指示剂，苯硫脲3．染色液：考马斯亮蓝R250 1.25g; 水227ml; 冰乙酸46ml; 甲醇227ml; 共500ml,溶解后过滤。

CTAB法提取植株基因组DNA

CTAB法提取植株基因组DNA（1）采摘健康幼叶作为提取植株基因组DNA的材料，用蒸馏水洗净，用纸吸干。

（2）取新鲜的叶片150mg置于1.5ml离心管中，使用MM301细胞破碎仪进行研磨破碎。

（若样品暂时不用，应保存于-80°C）（3）加入已预热的2×CTAB提取缓冲液700µl浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴60 min，其间轻柔混合2-3次。

（65°C预热CTAB，准备1000μl枪头，新离心管，镊子，厚手套，-20°C预冷异丙醇、无水乙醇）（4）取出离心管，冷却至室温，加入700µl的氯仿/异戊醇（24/1），轻缓颠倒混匀，静置10 min。

（5）13000rpm离心10min。

（离心温度不可过低，CTAB低于15°C会析出沉淀）（6）取上清600µl转移至新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，轻缓颠倒混匀，室温放置10min。

（取上清时一定要小心，不可将杂质混入，上清不够则少提）（7）13000rpm离心10min，取上清400µl转移至新离心管中，加等体积已预冷的异丙醇，保存于-20℃，静置20 min。

（8）13000rpm离心10min，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清，用600µl 70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干。

加入300µl去离子水溶解沉淀。

（沉淀一定要充分溶解，可用枪头将沉淀从离心管底部弹起，放于4°C 0.5h—1.0h）（9）加入1µl RNase（10mg/ml）置于37℃水浴60 min，每个离心管加300µl去离子水，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次。

（此步抽提很重要，一定要避免分离层中的白色薄膜吸入枪头，否则所得到的DNA中会含杂质而呈现乳白色）（10）吸取上清400µl 转入新离心管，加入上清体积1/10的3mol/LNaAC溶液，2.5倍体积的预冷无水乙醇沉淀DNA，置于-20℃，20 min左右，12000rpm离心10min，弃上清。

ctab法提取dna流程

ctab法提取dna流程CTAB法是一种常用的DNA提取方法，它能够从植物、真菌、昆虫等样品中高效地提取DNA。

本文将介绍CTAB法提取DNA的主要步骤及注意事项。

1. 样品制备首先，需要准备好待提取的样品。

对于植物样品，应在新鲜或经过冷冻保存的样品中选取新生叶片或芽。

对于昆虫样品，应选取腹部组织或头部组织，并将其切碎。

2. 组织破碎将样品放入研钵中，并加入适量的液氮使其快速冷冻。

然后使用研钵和研杵将样品彻底破碎，直到完全成为粉末状。

3. 细胞裂解将粉末转移到离心管中，并加入适量的CTAB缓冲液和蛋白酶K，混合均匀后放入65℃水浴中静置30分钟左右。

此过程中CTAB缓冲液能够裂解细胞壁并溶解蛋白质，而蛋白酶K则能够降解核酸外侧的核蛋白质。

4. 分离DNA将上述混合液加入等体积的氯仿中，轻轻摇晃后放置静置。

此时，DNA会在上层形成白色的沉淀，而RNA和蛋白质则会在下层。

使用移液管将上层沉淀转移到新的离心管中，并加入70%的乙醇进行洗涤。

最后将DNA沉淀干燥即可。

5. 检测DNA使用紫外分光光度计或琼脂糖凝胶电泳检测提取得到的DNA。

如果需要保存DNA，则应将其溶于TE缓冲液中，并放置于-20℃冰箱中保存。

注意事项：1. 样品制备时应避免污染，使用无菌操作器材。

2. 细胞裂解时应注意温度和时间的控制，避免过度裂解或过短时间裂解。

3. 在分离DNA时应注意不要将底部物质搅拌到上层沉淀中。

4. 检测DNA时应注意样品的稀释和纯化程度，避免误判结果。

总之，CTAB法是一种简单、高效、适用范围广的DNA提取方法。

在实际操作中，应严格控制每个步骤的条件和操作方法，以确保提取得到高质量的DNA。

利用CTAB法提取植物基因组DNA

利用CTAB法提取植物基因组DNA植物基因组DNA提取是分子生物学领域中常用的技术之一。

目的是为了获取高质量的DNA样品，以便进行PCR、测序、基因克隆以及染色体制备等实验。

目前，CTAB法是植物基因组DNA提取中广泛采用的方法之一。

本文将介绍利用CTAB法提取植物基因组DNA的步骤及注意事项。

1. 准备植物组织样品首先需要准备好待提取的植物组织样品，这些样品可以是叶子、花、芽、根等。

样品应该分别收集、标记，冷藏保存并尽快进行提取。

2. 样品研磨取一小段样品，用液氮将其冷冻，然后用研钵和研杵将其研磨成细碎的粉末状。

如果样品过多，则可以用离心管研磨器等仪器进行批量高效研磨。

3. 细胞壁裂解将磨细的植物组织加入CTAB裂解缓冲液中，加热至65℃，开启混合器磁子，同时混合2-3分钟左右，以破坏细胞壁，释放出DNA。

4. 除去蛋白质加入一定量的氯仿，并短暂的混合均匀，待混合物静置后，可以观察到混合液结成两层。

上层为水相，在此基础上加入同体积的异丙醇，沉淀出DNA进行洗涤和离心。

离心后，上清液含有蛋白质，可以废弃，而下沉淀可以进行枸橼酸溶解。

5. 获取DNA加入枸橼酸缓冲液后，可以分别进行洗涤和沉淀。

最后，通过乙醇提取，可以得到纯度较高的基因组DNA样品。

注意事项：1. 必须严格控制植物组织样品的数量，避免混入过多的杂质干扰提取效果。

2. 在DNA分离过程中，所有试剂、试管和磨具等物品都必须干燥无水，以免水分对提取质量产生干扰。

3. CTAB裂解缓冲液中的NaCl浓度和pH值的调节必须准确，其浓度和pH值直接关系到DNA的结晶和浓度。

4. 在进行DNA纯化过程中，必须注意所有材料的稳定性和纯度，同时要充分保护目标DNA，避免DNA被降解。

总之，CTAB法提取植物基因组DNA是一种安全、高效、可靠的方法。

在实际操作中，应充分掌握其原理、步骤和注意事项，以获取高质量的DNA样品，为后续的实验打下良好的基础。

实验一--CTAB法提取植物基因组

实验一--C T A B法提取植物基因组D N A(总3页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--实验一 CTAB法提取植物基因组DNA实验目的：学习从植物组织中（幼叶）提取基因组DNA的基本原理和方法。

实验原理：采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类），其对DNA的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐的溶液中（>L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。

CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必须预热（65度），且离心温度不要低于15度。

实验步骤：1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入离心管内。

加入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h。

2、加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于12000rpm离心10分钟。

3、吸取上层水相，重复步骤2一次。

4、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。

将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。

5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA（10mg/ml），37℃保温1h以除去DNA中的RNA。

6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。

利用改进的CTAB 法提取昆虫全基因组DNA

实验概要利用改进的CTAB 法提取昆虫全基因组DNA。

主要试剂1. 蛋白酶K[美国Merck公司]2. 三羟甲基氨基甲烷(Tris)[美国Amresco公司]3. Taq DNA聚合酶及dNTP[NEB公司]4. 琼脂糖及溴化乙锭(EB)[美国Amresco公司生产]5. 乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA)[美国Amresco公司]6. 苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇等[国产分析纯]7. 电泳缓冲液TBE：浓贮存液5×TBE：54.0 g Tris碱，57.1 g硼酸，20 ml 0.5 M EDTA，pH=8.0，加蒸馏水定容至1 L，工作液为稀释的0.5×TBE主要设备1. 高速冷冻离心机(3K-30)[德国Sigma公司]2. 恒温水浴锅[北京六一仪器厂]3. 电泳仪[美国Bio-Rad公司]4. 水平电泳槽[美国Bio-Rad公司]5. 凝胶成像系统(Gel Doc EQ)[美国Bio-Rad公司]6. 4℃、-20℃冰箱[日本Sanyo公司]7. 紫外分光光度计(Beckman Du 650)[日本Sanyo公司]8. 高压灭菌锅[日本Sanyo公司]实验材料烟粉虱成虫实验步骤改进的CTAB 法提取昆虫全基因组DNA:1. 加入50 µL TE 缓冲液，充分悬浮细胞样品；2. 加入60 µL 10% SDS 溶液，10 µL 20 mg/mL 蛋白酶K，温和混匀，37℃温育1 h；3. 加入100 µL 5 mol/L 的NaCl 溶液，上下颠倒离心管十多次，充分混匀；4. 加入80 µL CTAB/NaCl 溶液，温和混匀，65℃下温育10 min；5. 加入700 µL 氯仿/异戊醇，温和混匀，12000 r/min 高速离心2 min；6. 吸取上清至另一干净离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，12000 r/min 高速离心2 min；7. 吸取上清至另一干净离心管，加入2 倍体积冰冷的无水乙醇沉淀DNA，温和混匀；8. 离心（12000 r/min，30 min，4℃），彻底去除上清；9. 用300 µL 70% 预冷的乙醇洗涤沉淀，离心（12000 r/min，15 min，4℃），弃上清，再离心几秒，用移液器彻底除去酒精，风干；10. 沉淀溶于100 µL TE 溶液中，-20℃保存；11. 以紫外分光光度法和0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 浓度和质量。

实验一--CTAB法提取植物基因组DNA.doc

实验一--CTAB法提取植物基因组DNA.doc
CTAB法是一种提取植物基因组DNA的标准技术，它是将植物组织或细胞固定剂与有机溶剂混合溶解后，利用高通量PCR技术显微镜适用的植物DNA提取方法，将病毒与细菌遗
传学上的DNA提取技术应用到植物DNA提取上来。

CTAB法的提取策略主要是先收缩细胞壁，然后分解细胞质，使DNA与蛋白质、核酸等其他物质分离。

有两种方法可以用于收缩细胞壁，一种是使用脱水剂，另一种是使用温和
的柱状体破碎物质，这两种方法可以使细胞壁被开裂。

随后，有机溶剂被用来分离DNA，
有机溶剂会与蛋白质和核酸结合，然后消除组织成份，使DNA易于收集。

在有机溶剂洗涤后，用CTAB溶液在冰上半小时沉淀DNA，紧接着用脱盐水冲洗，最后用70%的乙醇对DNA
进行沉淀。

最后，DNA可以被收集，净化，脱水或冻存，随时可用。

此外，为了获得精确的结果，在使用CTAB法提取植物基因组DNA时也有一些需要考
虑的因素，其中包括样本所处的第一步，样品消毒，采取合适的收缩细胞壁和有机溶剂剂量，CTAB溶液沉淀时间，脱盐水洗涤次数，乙醇沉淀次数，DNA注射缓冲液等，如果这些
步骤都能得到恰当的处理，则可以保证获得的 DNA 极为纯净。

为了提高植物DNA提取效率，CTAB法在提取植物基因组DNA时也可以使用DNA限制酶，例如酸性磷酸酶和热胡萝卜素变性酶之类的酶，这种方法可以使细胞壁更易被分解，从而
使DNA更容易被收集。

总而言之，CTAB法提取植物基因组DNA是一种比较有效的方法，能够获得更高质量的DNA，但是在使用这种技术提取植物DNA时，需要注意一些关键的步骤及酶的使用，以确
保获得的DNA有较高的纯度。

CTAB提取基因组,步骤及注意事项

●蛋白酶K的配制常用浓度（20mg/ml）：称取20mg蛋白酶K，溶于1ml灭菌去离子水中。

轻摇直至溶解。

●Rnase A 配制常用浓度（10mg/ml）：称取10mg Rnase A,溶于1ml灭菌去离子水中。

100℃煮沸15min，冷却至室温。

-20℃保存。

因为移液枪量程限制，本实验配置2mg/ml的溶液，即称取10mg Rnase A，溶于5 ml灭菌去离子水中。

100℃煮沸15min，冷却至室温。

-20℃保存。

*提取之前准备：CTAB提前65℃预热,蛋白酶K配好,37℃水浴锅开启，37℃预热SDS溶液，异丙醇-20℃预冷，无水乙醇-20℃预冷1.取生长3天的菌液25ml加入到灭过菌的40ml离心管中，绿菌、白菌各两管，5000rpm离心20min，弃上清➢3天的菌液较好。

4天的菌液提取的DNA较多，但是步骤7及后面的步骤中上清均有黄色出现2.分别混合两管绿菌和白菌，加入9.5ml TE缓冲液悬浮沉淀，并加入0.5 ml 10% SDS，100ul20mg/ml的蛋白酶K，混匀，37℃水浴1h。

水浴过程中轻缓颠倒离心管。

➢混合时可以先将菌渣混合再加入TE重悬，也可以先将TE加入到一管，吹打重悬后再全部加入另一管吹打重悬。

➢本步骤的目的是是使细胞破碎，因为菌液比较粘稠，水浴过程中颠倒有助于使细菌与酶及SDS充分接触，SDS有裂解细胞膜的作用➢蛋白酶K消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。

3.加入1.5 ml 5M的NaCl，混匀4.加1.5 ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴30~40min，每10min轻缓颠倒离心管数次。

期间配制酚-氯仿-异戊醇（V:V:V=25：24：1）约40ml。

➢高离子强度的溶液中(>1.4mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而DNA 溶解于液相中➢轻缓颠倒有助于反应液充分接触5.以后操作要尽可能轻缓，不要剧烈震动6.冰上孵育10min直至离心管内液体冷却➢此步目的是为了防止温度过高以至于后面加入的酚立刻被氧化掉7.加入等体积（约15ml）酚-氯仿-异戊醇，轻轻摇晃，5000rpm离心20min，将上清移至干净50ml离心管➢酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去➢氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，氯仿有助于水相与有机相分离和除去DNA 溶液中的酚➢离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中（上层水相可能会有颜色），蛋白质则沉淀于两相之间。

CTAB—硅珠法提取DNA实验流程

CTAB—硅珠法提取DNA实验流程前言:实验是要求非常严谨的过程,每个一步骤都可能对后面的操作产生很大影响,乃至影响后面的结果.一步错,步步错,每一个操作的失误都可能导致整个实验的失败.事实求是与踏踏实实的作风是每个做实验的人必备的基本品质.永远记住,任何弄虚作假的行为都是可耻的.在这个充满学术腐败的科学界,保持自己的纯真.谨记1.材料的采集采取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回,置于-70℃冰箱保存.2.CTAB—硅珠法提取DNA实验流程各加入液体的配制：1、CTAB提取液：2%（W/V g/mol ）CTAB；5%（W/V g/mol）PVP；1.4mol/lNaCl；20mmol/L EDTA PH=8.0；l00mmol/l Tris-HCl PH=8.0；2%(V/V)巯基乙醇(临时加入)配制量：500ml配制方法：(1)计算所需组分量CTAB 10g 需热磁力搅拌PVP 25gNaCl 40.908gEDTA.Na2.2H2O 3.7224g 调PH=8 冷却为常温时(母液)Tris 6.057g(2)称取CTAB 10 g，NaCl 40.908g，PVP 25g置于500ml烧杯中(3)加入约300dd H2O(双蒸水)充分磁力搅拌溶解(注意：EDTA和PVP较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止)(4)量取20mlEDTA(0.5mol/l PH=8 )，50ml Tris-HCl(1 mol/l PH=8)溶液于烧杯中，均匀混合(5)将烧杯溶液定容至500ml后，高温高压灭菌(6)室温保存。

0.5mol/LEDTA 配制组分浓度：0.5mol/l EDTA，PH=8配制量：500ml配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500 ml烧杯中(2)加入约400ml dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌(3)用NaOH调节PH值到8，约用10克固体NaOH(4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8(5)加dd H2O将溶液定容到500 ml(6)高温高压灭菌后，室温保存NaOH溶液的配制组分浓度：5 mol/l NaOH配制量：100 ml配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中(2)加入dd H2O定容到100 ml100 mmol/l Tris-HCl的配制组分浓度：mmol/l Tris-HCl，PH=6.4配制量：250 ml配制方法(1)称取3.025克Tris于250 ml烧杯中.(2)加入约200ml dd H2O充分搅拌溶解.(3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3 ml(4)将溶液定容至250ml(5)用棕色瓶分装于4度冰箱中(6)如使用，用水浴加热溶解.2、氯仿-异戊醇的配制：配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可(2)储存于棕色玻璃瓶子中(3)置于4度冰箱以便日后使用3总的实验流程3.1．总的DNA的提取：1. 在10ml离心管（eppendorf管）中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇，在65℃水浴锅中预热2. 取材料1-2g于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的CTAB提取液中，用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟，保温过程中轻晃几次，保持摇匀.3. 取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的4ml氯仿-异戊醇（24：1），轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后4℃下离心12000rpm 10min，轻轻将上清液吸取1ml于1.5ml离心管，放于-20℃冰箱中备用.各加入液的用途：（1）去污剂：CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性. EDTA：能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA.（2）还原剂巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.（3）氯仿—异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开除去.（4）RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA.3.2．总DNA的纯化操作步骤：1. 取出1.5ml离心管，内含所取DNA，加入100ul硅珠悬浮液（此液要求先行涡旋再使用），使用涡旋振荡器大约15s，使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm 15s 4度，去除上清液得到硅珠——核酸复合物.2. 将复合物用镊子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液1ml，再涡旋充分混匀，后离心8000rpm 15s 弃掉上清液.3. 重复上一步一次.4. 用70%的1ml乙醇将硅珠——核酸复合物漂洗两次.每次涡旋充分混匀后，离心8000rpm 15s，弃上清液，打散，最后用1ml无水乙醇再漂洗一次，用涡旋混匀离心8000rpm 15s，然后将离心管管口打开倒置在吸水纸上，再将沉淀置于真空冷冻干燥机中风干复合物10分钟.5. 加入100ulTE缓冲液充分混匀后，于56度水浴中保温10分钟，然后离心12000rpm 5min.取上清液即为所需的DNA.6. 将余下的复合物再次完全打散（即涡旋），加入100ulTE缓冲液进行第二次重旋，并于56度水浴中保温10min，12000rpm 5min，取上清液于步骤5管中共存.7. 将两次二合一的上清液离心混匀14000rpm 10min ，取上清液存于-20℃冰箱中.仪器的使用真空干燥器：在使用前要求先预热30分钟，只打开1号阀门.打开盖子平衡放入离心管，然后顺次开启2号——3号——4号——5号门.进行干燥处理5分钟.关闭各阀门.顺序为5号——4号——3号——2号——1号阀门.各加入液的配制1、硅珠悬浮液的配制（1）称取1.2g硅珠粉，溶解于10ml无菌水中.（2）放入4℃冰箱备用.（3）使用时先涡旋使其混合均匀.2、漂洗液的配制称取GuSCN（可能产生有毒气体，要求在通风橱中进行）120克溶解于100mlTris-HCl(100mM PH6.4)中.要求在60℃水浴中溶解.3、TE缓冲液的配制10×TE，500ml配制如下：将100mM Tris-Hcl（PH=8.0）6.057g与10mM EDTA（PH=8.0）1.8612g溶于400ddH2O 中，调PH=8.0，定容到500ml。