质粒DNA提取及纯化.

用途 Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白 质的溶剂，还有许多重要用途。Tris被 用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。 Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线 虫（C. elegans）核纤层蛋白（lamin） 的中间纤维的形成。Tris也是蛋白质电 泳缓冲液的主要成分之一，其在电泳缓 冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳定电 泳过程中的PH。此外，Tris还是制备表 面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中 间物。Tris也被用作滴定标准物。 作为 蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱， 则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪 可耐受的缓冲液。
用途 EDTA是一种重要的络合剂。 乙二胺四乙酸能与 EDTA用途很广，可用作彩 Mg2+、Ca2+、Mn2+、 色感光材料冲洗加工的漂 Fe2+等二价金属离子 白定影液，染色助剂，纤 结合的一种螯合剂。由 维处理助剂，化妆品添加 于多数核酸酶类和有些 剂，血液抗凝剂，洗涤剂， 蛋白酶类的作用需要 稳定剂，合成橡胶聚合引 Mg2+，故常用做核酸 发剂，EDTA是螯合剂的代 酶、蛋白酶的抑制剂； 表性物质。能和碱金属、 也可用于去除重金属离 稀土元素和过渡金属等形 子对酶的抑制作用。 成稳定的水溶性络合物。
SDS SDS（全称为sodium dodecyl sulfate,sodium salt）是一 种化学品，中文名为十二烷基硫酸钠。 主要成分： 纯品 外观与性状： 白色粉末。 理化 熔点(℃)： 204-207 沸点(℃)： 无资料 相对密度(水=1)： 1.09 溶解性： 溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。 主要用途： 用作洗涤剂原料、印染工业的匀染剂、矿物 的浮选剂。还可作为表面活性剂，起到助溶作用。
碱裂解小量制备 法
DNA的提取 和纯化
小量制备
煮沸小量制备法
大量制备ຫໍສະໝຸດ Baidu
碱裂解法制备粗 制裂解物
氯化铯/溴化乙 锭平衡力新法
名词解释 1.质粒 质粒zhì lì （Plasmid）是附加到细胞中的非细胞 的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小 的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大 部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细 菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等 胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler（天蓝色链霉菌）等放线菌以及在 Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋体）等原核生物 中，又相继发现线形质粒。
溶液三 由醋酸以及钾盐所形成，前 者在于中和碱性，后者有利 于染色体DNA的沉淀。
实验原理
质粒是一种独立于染色体DNA之外的能自主复制的双链，闭合，环装小分子的DNA ，其大小范围从 1kb~200kb以上不等。广泛存在于细胞中，在一些动，植物细胞中也发现有质粒的存在。目前提纯 质粒的方法比较多，如碱裂解法，煮沸法和SDS法等。最常用的是碱裂解法，其优点为效率高，价 廉简单易学等。碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与变性与质粒DNA的复性的差异而达到分离的 目的。在PH12.0~12.6的碱性环境中，宿主的染色体DNA变性（是氢键断裂，破坏碱基配对），蛋白 质变性。质粒DNA的碱基对也被破坏，闭环的DNA链处在缠绕状态而不能彼此分开。加入乙酸钾缓冲 液中和后，PH调至中性，小分子的变性质粒DNA迅速复性为可溶状态，而变性的染色体DNA因分子量 巨大而难以复性，随同高分子量RNA以及K+/SDS/蛋白质/膜复合物形成沉淀，故经离心，即可将染 色体DNA和质粒DNA分离。在实验步骤中，加入溶解液1的目的主要是将细菌团块重新悬浮于缓冲溶 液中。溶液2含有SDS和NaOH，前者可将细菌溶解，后者可将DNA变性。溶液3由醋酸及钾盐所形成， 前者在于中和碱性，后者则由于DNA的沉淀。加入溶液3后离心，大部分蛋白质和染色体DNA沉在下 面，而上清液中所含的质粒DNA可继续进行纯化。纯化质粒采用氯化锂沉淀和聚乙二醇沉淀的方法。 进一步用RNA酶消化可去除残余的RNA。用酚：氯仿：异戊醇抽提可除去PEG和残余的蛋白质。在经 乙醇沉淀和离心回收，即可得到高度纯化的质粒DNA。制备的质粒DNA可用于酶切，连接，转化，以 及PCR等。
2.基因工程 基因工程（genetic engineering）又称基因 拼接技术和DNA重组技 术。所谓基因工程是在 分子水平上对基因进行 操作的复杂技术，是将 外源基因通过体外重组 后导入受体细胞内，使 这个基因能在受体细胞 内复制、转录、翻译表 达的操作。
它是用人为的方法将所需要的某一供体 生物的遗传物质——DNA大分子提取出 来，在离体条件下用适当的工具酶进行 切割后，把它与作为载体的DNA分子连 接起来，然后与载体一起导入某一更易 生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物 质在其中“安家落户”，进行正常的复 制和表达，从而获得新物种的一种崭新 技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
分子式：C4H11NO3 分子量：121.14 溶液一 CAS号：77-86-1 50mmol/L葡萄糖 ， 25mmol/L Tris-Cl 密度：1.353 10mmol/LEDTA 熔点：167-172℃ 沸点：219-220℃ (10 mmHg) Tris-Cl 闪点：100℃ Tris-HCl缓冲液 水溶性：550 g/L (25℃) （0.05mol/L，25℃）， 外观：白色结晶 水溶性：无色， 中文别名：三（羟甲基） 澄清 氨基甲烷；氨丁三醇； 毒性：毒性低，可致癌，不要 缓血酸铵；三羟甲基氨 直接接触皮肤。 基甲烷；Tris，英文名称： Tris(hydroxymethyl)ami nomethane
EDTA溶液
溶液一的作用 溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl,pH=8.0 葡萄糖增稠,使悬浮后的大肠杆菌不会快速 沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的 活性.这一步溶液中还可以加入RNase,不受 EDTA影响,并且可以在后续步骤中被除去
溶液二 200mmol/LNaOH 1/100SDS(临用前配置)