生理生化鉴定

2.2.4.3 生理生化特征测定

2.2.4.

3.1 生长温度测定

将待测菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，置于10 ℃、15 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的培养箱中恒温培养，每隔12 h观察菌株的生长情况，确定菌株生长的最低及最高温度。

2.2.4.

3.2 需氧性测定和运动性测定

将待测菌株活化24 h后，穿刺接种到牛肉膏蛋白胨半固体培养基，30±1℃培养，3 d后观察生长状况。

2.2.4.

3.3 pH 5.7培养基中生长状况观察

取营养肉汤中培养的菌株接种在液体基础培养基(葡萄糖0.5 g、MgSO4·7H2O 0.02 g、NaC1 0.02 g、K2HPO4 0.02 g、CaSO4 0.01 g、酵母浸膏1.0 g、蒸馏水100 g)试管中，30±1 ℃培养1～7 d，观察菌株生长状况。

2.2.4.

3.4 耐盐性试验

采用PB培养基，分别加入2%、5%、7%、l0%的NaC1。取幼龄菌种接种培养，30±1 ℃培养7 d，在第3 d、第7 d各观察一次，设未接菌的空白对照。

2.2.4.

3.5 接触酶试验

将待测菌株在牛肉膏蛋白胨斜面上30±1 ℃培养24 h，滴入3%的H2O2观察气泡的产生情况。

2.2.4.

3.6 脲酶试验

将待测菌株接种在牛肉膏蛋白胨斜面上，在第3 d和第7 d进行脲酶试验的测定。方法参照东秀珠，蔡妙英等编著《常见细菌系统鉴定手册》[91]。

2.2.4.

3.7 淀粉水解

将培养基(肉汁胨中加0.2%的可溶性淀粉)倒成平板，倒置过夜后，接种新鲜菌种，30±1℃培养，待形成明显菌落后滴加卢哥氏碘液，观察菌落四周颜色变化。

2.2.4.

3.8 明胶液化

培养基：蛋白胨0.5 g、明胶10 g、蒸馏水100 mL、pH 7.2～7.4。

取斜面培养18～24 h菌体穿刺接种，并设未接种的空白对照，置于20±1 ℃培养箱中培养，第2、7、10、14和30 d观察明胶液化情况。

2.2.4.

3.9 糖、醇类发酵

培养基(NH4)2HPO4 1 g、MgSO4 0.2 g、KCl 0.2 g、酵母膏0.2 g、葡萄糖10 g、琼脂6 g、溴甲酚紫微量、蒸馏水1000 mL、pH 7.0～7.2)中分别加入L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇代替葡萄糖。将斜面培养的幼龄菌株穿刺接种于上述培养基，30±1 ℃培养5 d，第1、3、5 d观察培养基显色情况，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝（紫）色为阴性。

2.2.4.

3.10 V-P试验

于液体培养基（蛋白胨0.5 g、葡萄糖0.5 g、NaCl 0.5 g、蒸馏水100 mL、pH 7.0～7.2)中接种待测菌株，2 d后取出培养液和40% NaOH等量混合，加入少许肌酸，猛烈振荡，3 min后观察培养液颜色。

2.2.4.

3.11 M.R试验(甲基红试验)

将待测菌种接种于培养基（蛋白胨0.5 g、葡萄糖0.5 g、NaCl 0.5 g、蒸馏水100 mL，pH 7.0～7.2)中，30±1 ℃培养6 d，在培养液中加入一滴甲基红试剂观察培养液显色情况。

2.2.4.

3.12 硝酸盐还原试验

将待测菌株接种于硝酸盐液体培养基(肉汁胨培养基1000 mL、KNO3 1 g、pH 7.0～7.6)，以不接种作对照，培养2 d后取干净的空试管倒入少许培养液，各滴1滴A液(对氨基苯磺酸0.5 g，10%稀醋酸150 mL)及B液(a-萘胺0.1%、蒸馏水20 mL、10%稀醋酸150 mL)，在对照管中同样加入A、B液各1滴，观察培养液的颜色。

2.2.4.

3.13 溶菌酶试验

将待测菌株接种于含有0.001%溶菌酶的牛肉膏蛋白胨培养基中，放入37±1 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察培养基上是否有菌落长出。

2.2.4.

3.14 柠檬酸盐利用试验

采用西蒙斯(Simmons)氏柠檬酸盐培养基(NaCl 5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、(NH4)H2PO4 1 g、K2HPO4·3H2O 1 g、柠檬酸钠2 g、溴百里酚蓝1%水溶液10 mL、琼脂12 g、蒸馏水990 mL)斜面接种并设空白对照。30±1 ℃培养7 d，观察培养基显色情况。

2.2.4.

3.15 吲哚反应

培养基：1%胰胨水溶液，调pH为7.2～7.6，分装1/3～1/4试管，115 ℃灭

菌30 min。

试剂：对二甲基氨基苯甲醛8 g，95%乙醇760 mL，浓HCl 160 mL。

培养1、2、4、7 d的培养液，沿管壁缓缓加入3～5 mm高的试剂于培养液表面，在液层界面出现红色，即为阳性反应。如颜色不明显，可加4～5滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂，如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。

2.2.4.

3.16 丙二酸盐的利用

将待测菌株接种于丙二酸盐培养基(丙二酸钠3 g、K2HPO4 0.6 g、NaCl 2 g、溴百里酚蓝(溶于蒸馏水)0.025 g、酵母膏1 g、(NH4)2SO4 2 g、KH2PO4 0.4 g、蒸馏水1000 mL、pH 7.0～7.4)，培养1～2 d后，培养液由绿变蓝者为阳性；培养基不变色为阴性。

2.2.4.

3.17 卵磷脂酶

培养基：无菌条件下取卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取10 mL上述悬液加入到融化的，约50～55 ℃的200 mL肉汁胨琼脂中，混合均匀后倒入培养皿内。

将待测菌株点接在上述平板上，室温培养18～24 h观察，如菌落四周和下面有不透明的区出现，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶产生。

2.2.4.

3.18 酪氨酸水解

将L-酪氨酸0.5 g悬浮于10 mL蒸馏水中，灭菌后与100 mL无菌的营养肉汤琼脂混合，倒平板。将待测菌株点接于平板上，30±1 ℃培养7～14 d，观察菌落周围是否有透明圈出现。

2.2.4.

3.19 H2S产生试验

将大肠杆菌(阳性对照)、待测菌株穿刺接入醋酸铅培养基中，于30±1 ℃恒温培养箱中培养48 h后，观察是否有黑色小点产生。