植物生理生化指标测定(精)

小黑豆相关生理指标测定

1. 表型变化:鲜重、株高、主根长和叶面积

鲜重 :取处理好的植株,擦干根和叶表面水分,测量整株植物的重量,每个测 6个重复。

株高 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度,记录,每个测6个重复。

主根长 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到主根最远点长度,记录,每个测6个重复。

叶面积 :取处理好的植株,选择第二节段的叶片,测量叶面积,叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长, 测叶片最窄处长度作为叶的宽, 叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测 6个重复。

2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA 和 H2O2含量测定

样品处理:取 0.5g 样品(叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净 ,速在液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨,然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.4 抽提, 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中, 于 4℃, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20℃下,上清液可用于总蛋白、丙二醛(MDA 、可溶性糖和 H2O2含量测定。

总蛋白测定(Bradford 法 :样品反应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品 , 空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford 。测定后带入标准曲线 Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,计算得出蛋白含量。

可溶性糖测定:样品反应体系(1ml 蒽酮 +180ul ddH2O+20ul样品提取液 ; 空白对照 (1ml 蒽酮 +180ul ddH2O , 测定 OD625后带入标准曲线 :

Y=0.0345X+0.0204(Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量(ug

蒽酮配方:称取 100mg 蒽酮溶于 100ml 稀硫酸(76ml 浓硫酸 +30mlH2O . 注意:浓硫酸加入水中时,一点一点递加,小心溅出受伤。

丙二醛 (MDA 测定:在酸性和高温条件下, 丙二醛可与硫代巴比妥 (TBA 反应生成红棕色的 3,5,5-三甲基恶唑 2,4-二酮,在 532nm 处有最大吸收波长,但该反应受可溶性糖的极大干扰,糖与 TBA 的反应产物在 532nm 处也有吸收,但其最大吸收波长在 450nm 处。采用双组分分光光度法,可计算出 MDA 含量。 MDA 的计算公式为:MDA (umol/L =6.45OD532-0.56OD450.

反应体系为:400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品, 80℃水浴 10min 后, 测

OD532和 OD450。对照用 Tris-HCl.

0.6%TBA配方:称取硫代巴比妥 0.6g ,溶于少量 1M NaOH中,待其完全溶解后用 10%TCA(称取 10gTCA 三氯乙酸,溶于 100ml 蒸馏水中,待其溶解即可定容至100ml 。

H2O2测定(二甲酚橙法 :样品反应体系(82ul 溶液 A+820ul溶液 B (A:B=1:10

+150ul样品提取液 , 30℃水浴 30min ,测 OD560。标准曲线为 :Y=0.01734X-

0.0555(Y代表 OD560, X 代表 H2O2含量

溶液 A (200ml :FeSO4.7H2O 0.1835g; (NH42SO4 0.0872g; H2SO4(浓硫酸

18M4.58ml ,加水定容。

溶液 B (200ml :二甲酚橙 0.0234g ;山梨醇 6g ,加水定容到 200ml

3. 可溶性蛋白、 SOD 、 POD 和 CAT 活性测定

样品处理:取 0.5g 样品,速在液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨, 然后加入1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.0 (内含有 20%甘油、 1mmol/L ASA(抗坏血酸、 1mmol/L DTT(二硫苏糖醇、 1mmol/L EDTA、 1mmol/L GSH(还原型谷胱甘肽、 5mmol/L MgCl2抽提,将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中,于 4℃, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20℃下, 上清液可用于可溶性蛋白、 SOD 、 POD 和 CAT 含量测定。

1mmol/L的 ASA 配制:先配制 10mmol/L的母液—称取 176.13mg 的 ASA , 溶于100ml 的 Tris-HCl (pH7.0中即可,然后稀释 10倍即可。

1mmol/L的 DTT 配制:先配制 10mmol/L的母液—称取 154.25mg 的 DDT 溶于100 ml的 Tris-HCl (pH7.0中即可,然后稀释 10倍即可。

1mmol/L的 EDTA 配制:用 30mmol/L的 EDTA 稀释 30倍即可。

5mmol/L的 MgCl2配制:称取 MgCl2.6H2O 的 101.5mg 溶于 100ml 的 Tris-HCl (pH7.0 ,即可。

样品提取液的配制(200ml :取 10mmol/L的 ASA 母液 20ml , 10mmol/L的母液DTT20ml , 取 30mmol/L的 EDTA 母液 7ml , 称取 203mg 的 MgCl2.6H2O , 最后再量取 20ml 的甘油,将最终体积定容到 200ml ,即可。

可溶性蛋白测定 (Bradford 法 :样品反应体系 (800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品 ,空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford 。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,计算得出蛋白含量。

SOD 测定 :SOD 活性的测定是根据照光时,体系中产生氧自由基使硝基四唑蓝还原成蓝色甲 (在 560nm 处有一吸收峰 , 而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。• 一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半 (50% 时所需的酶量。

14.5mmol/L的 dl-甲硫氨酸(分子量 149.21 (现用现配 :称取甲硫氨酸 216.4mg ,加少量 Tris-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0定容到 100ml ,即可。

30mmol/L的 EDTA (292.25 (现用现配 :称取 EDTA 药品 876.75mg ,加少量Tris-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0定容到 100ml ,即可。

2.25mmol/L的 NBT (硝基四唑蓝 (817.6 (现用现配 :称取 NBT 药品 18

3.96mg ,加少量 Tris-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0定容到 100ml ,即可。