植物生理测定方法

1 叶圆片放氧活性的测定

原理：同光合速率一样，叶片光合放氧速率是反应光合能力的一项重要指标，其大小本质上取决于PSII活性的大小。

称取2～3 cm2 叶片约0.2g，用打孔器2-3 mm2的小圆片后放入含有200mmol Trincine-NaOH，100 mmol NaHCO3，pH7.0 的缓冲液中，并用注射器抽真空1min 左右，使缓冲液充分渗入到叶肉细胞里，最后将叶圆片连同缓冲液转移至极谱氧电极(Hansatech，英国)的反应杯里测定放氧活性，测定在20℃及800μmol.m-2.s-1光强下进行，每个样品测定3个重复。

2 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBPCase）活性测定

原理：Rubiscase是光合作用中最重要的关键酶，它既催化RuBP羧化反应，又催化RuBP加氧反应，对植物的光合作用具有重要的调控作用。

参照李合生等[57]的方法，称取0.5g叶片加入匀浆液6ml（100mmol/L Tris-HCl 缓冲液pH7.8，10 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L EDTA，20 mmol/L 2-巯基乙醇，2%聚乙烯吡咯烷酮）冰浴研磨匀浆，14000g、4℃离心20min，上清液作酶液活性分析。反应液总体积为200µL，内含反应介质100mmol/L Tris- HCI 缓冲液(pH7.8)、0.4mmol/L EDTA、12 mmol/L MgCl2）93.3µL、50 mmol/L ATP、50mmol/L 磷酸肌酸，200mmol/L NaHCO3各13.3µL，160 u/ml 磷酸肌酸激酶，160 u/ml 磷酸甘油酸激酶，160 u/ml 磷酸甘油醛脱氢酶各6.7µL，5mM/L NADH，蒸馏水各13.3µL，RuBPCase提取液6.7µL 30℃恒温水浴10 min, 最后加入9 mmol/L RuBP 6.7µL反应开始，用Theymo1500型酶标仪96孔板测定340 nm下光吸收的变化。以ΔA340·min-1下降0.01为l U，每个样品测定3个重复。

3 磷酸烯醇式丙酮酸（PEPCase）活性测定

原理：PEPCase通过催化CO2和HCO3-之间的快速结合，促进CO2在细胞中扩散并提供羧化底物[。

参照郑炳松[58]的方法，称取0.5g左右叶片加入匀浆液6ml（0.1mol/L Tris-H2SO4，10 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L EDTA ,7 mmol/L 2-巯基乙醇，1%聚乙烯吡咯烷酮，5%甘油pH8.2）冰浴研磨成匀浆，15000g下冷冻离心20min，上清液作酶液活性分析。反应液总体积为200µL，内含反应介质（0.1mol/L Tris-H2SO4 pH9.2）66.7µL、10 mmol/L MgSO4、10mmol/L NaHCO3各6.7µL，1 mg/mL NADH，50 u/ml 苹果酸脱氢酶各20µL ，蒸馏水，PEPCase提取液各33.3µL，28℃恒温水浴10 min, 最后加40mmol/L PEP 13.3μl反应开始，用Theymo 酶标仪1500型96孔板测定340 nm下光吸收的变化。以ΔA340·min-1下降0.01为l U。每个样品测定3个重复。

4 类囊体膜的制备

选用新鲜的植物叶片，4℃冰箱中放置过夜使其消耗一部分淀粉，在预冷的匀浆液（含0.4mol/L 蔗糖，20m mol /L Tris-Hcl，15m mol /L NaCl，2 m mol /L EDTA- Na2 pH 7.8）中快速匀浆，8层纱布过滤，4℃，2000g下离心10min，沉淀为叶绿体，用低渗涨破液（含20mmol/L Tris-Hcl，15mmol/L NaCl，5 mmol/LMgCl2 pH 7.8）悬浮沉淀，匀浆后4℃，500g低速离心去除未破碎的叶绿体和其他大的残渣，上清液在4℃，5000g离心10min得到初提的类囊体膜，涨破液洗涤去除淀粉得到纯化的类囊体膜，保存液（含0.4mmol/L蔗糖，20mmol/L Tris-Hcl，

35mM/L NaCl pH 7.0）悬浮保存在-80℃冰箱备用。

5 类囊体膜PSI、PSII电子传递活性测定

用Clark—氧电极参照Leong 和Anderson的方法[59]并略做修改。PSⅡ电子传递速率（H2O→DCBQ）反应液组成为：蔗糖400mmol/L，DCBQ0.2mmol/L，Ferricya 1mmol/L，Tricine-NaOH(pH 6.5) 50 mmol/L；PSⅠ光合电子传递速率（DCPIP/AsA→MV) 反应液组成为：Sucrose 400mmol/L，MgCl2 5mmol/L，NaCl 10mmol/L，DCPIP 200μmol/L，sodium azide 1mmol/L，MV 0.5mmol/L，DCMU 10umol/L，sodium ascorbate 1mmol/L，Tricine-NaOH (pH 7.5) 50 mmol/L。测定温度为20℃，光强为600μmol photons m-2s-1，叶绿素浓度为20μg/mL，每个样品测定3－5个重复。

6 类囊体膜室温吸收光谱的测定和Gaussian解析

用日本岛津UV一3100型分光光度计测定样品在360——720nm处OD值，每隔0.5nm测定1次，叶绿素浓度为l0μg/mL。吸收光谱用Origin6.1进行Gaussian 解析，解析的具体方法和各个组分的定义参考French[60]，Brown[61]以及Ginkel[62]。

7 SDS-PAGE电泳

参照Laemmli方法。

（1）凝胶配制：15％分离胶（pH8.8，3.75 mM/mL Tris-HCl，15％Arc-Bis(15:0.4)，60mM/mL尿素）；5.4％浓缩胶（pH6.8，3.125 mM/mL Tris-HCl，5.4％

Arc-Bis(2.16:0.058)），聚合时分离胶和浓缩胶各加10％过硫酸铵30μl/10ml，TEMED 10μl/10ml。

（2）样品处理：取等体积和等叶绿素含量的样品增溶液进行增溶，样品增溶液含4% SDS，10% β-巯基乙醇，0.002% 溴酚蓝,1mM/mL Tris-HCl, 5%甘油。混合后沸水浴温育3min，10000g下离心5分钟。

（3）上样和电泳：每电泳槽加2μg叶绿素含量的样品。电极缓冲液含0.1%SDS, 50mM Tris, 384mM 甘氨酸, pH 8.3。采用Bio-Rad Mini-protein II 型电泳槽0.75mm凝胶板，恒压条件下，浓缩胶中60V, 分离胶中110V 电泳约150min，直到溴酚蓝接近凝胶板下沿停止电泳。第一泳道上样4μl 低分子量标准蛋白（上海宝生物）(99kD, 66kD, 45kD, 30kD, 20kD, 14.4kD)。

（4）固定，染色和脱色：凝胶板在固定液（50％乙醇，10％乙酸）中固定4h, 在染色液（1.16％考马斯亮蓝R-250, 25%乙醇，8％乙酸）中染色4h，在脱色液中（25%乙醇，8％乙酸）脱色至背景很浅, 照相保存。

8 细胞色素氧化酶活性测定

参照Terry M等[63]方法。

（1）凝胶配制：15％分离胶（pH8.8，3.75 mmol/mL Tris-HCl，15％Arc-Bis(15:0.4)）；

5.4％浓缩胶（pH

6.8，3.125 mmol/mL Tris-HCl，5.4％Arc-Bis(2.16:0.058)），聚合时分离胶和浓缩胶各加10％过硫酸铵30μl/10ml，TEMED 10μl/10ml。

（2）样品处理：取等体积和等叶绿素含量的样品增溶液进行增溶，样品增溶液含2% LDS，10% β-巯基乙醇，1mM/mL Tris-HCl, 5%甘油。冰浴混合后增溶