生理指标测定

生理指标测定_16种1、冻害指数——3~5株观察形态【４种常绿水生鸢尾抗寒性的初步研究】张京，2012李刚，姜卫兵，翁忙玲，等．木兰科６种常绿树幼苗抗寒性的初步研究［Ｊ］．园艺学报，２００７，３４（３）：７８３－７８６．描述叶色变化：在最冷月( 2月中旬) , 所有供试树种均有不同程度的冻害表现, 乐东拟单性木兰受冻害最轻,只有部分植株的少量叶片有些许水渍状, 大部分植株完好无损, 冻害指数为041, 基本不受冻害;阔瓣含笑也长势良好, 有少部分叶片出现褐色水渍状, 冻害指数为14, 受轻度冻害; 金叶含笑受到了中度水平的冻害, 部分植株的叶片整个叶面呈现红褐色水渍状, 冻害指数为25; 红花木莲、醉香含笑和观光木受到了重度冻害, 大多数植株的部分叶片呈焦黄、褐色脱落, 有的整个植株呈萎蔫状,长势非常差, 冻害指数分别为3.2、3.9、4.3.2、相对含水量叶片相对含水量采用饱和称重法［21］测定。

选取各处理部位一致、成熟完好的叶片迅速称其鲜重，再用蒸馏水浸泡8~24 h，使组织吸水达到饱和状态，取出后吸去表面水后立即称其饱和重，然后在105 ℃下杀青30min，在80 ℃下烘干至恒重（1h~24h），放在干燥器中冷却，称其烘干重。

根据公式计算:LRWC( %) = [ (鲜重－干重) /(饱和重－干重) ] × 100%3、光合参数（光合仪测定）光合速率、CO2浓度、光合有效辐射、叶绿素或用95%乙醇浸泡法，浸泡4~5d，测定叶绿素。

《植物生理生化实验原理和技术》4、膜质过氧化：相对电导率（略）、MDAMDA（丙二醛）的测定试剂：三氯乙酸10% （TCA 溶液）：称取100g溶于1L 蒸馏水中；0.6％硫代巴比妥酸溶液（6%TBA）：1.8g溶于300ml TCA 溶液中（加热溶解）称取植物叶片0.3克, 先加入2ml TCA和少量石英砂研磨至匀浆，再加入4ml 10%三氯乙酸(TCA)进一步研磨（总体积为6ml），然后以4000g离心10min, 取上清液待测。

吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0.6% TBA，混匀物于沸水浴上反应15分钟，迅速冷却后再离心(在冰箱中冷却较快)。

取上清液测定在532，600和450nm波长下比色。

公式CMDA(nmol L-1)＝[(A532－A600)-0.0571×(A450-A600)]/0.155计算MDA量（排除多糖干扰），用每克干（鲜）重中MDA的量表示MDA的含量，单位μmol g-1干（鲜）重或nmol g-1干（鲜）重。

1、含量计算双组分光光度计法：已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm波长下的比吸系数分别为85.40,7.40；MDA与 TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收，其吸收系数为0，532nm下比吸收系数为155，根据双组分光光度计法建立方程组，计算公式如下：C1（mmol/L）=11.71 D450C2=[6.45(D532—D600) — 0.56 D450]X提取液总体积/测定时用的提取液体积*样品鲜重C1:可溶性糖的浓度, C2为MDA的浓度, D450D532D600分别代表450,532,600nm下的消光度值.参：Brege J G.Microsomal lipid peroxiodation. Methods in Ezymmology.1978,52:302-306 J.G. Buege and S.D. Aust, Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol.52(1978), pp. 302–306.注: 沸水浴时,可使用小试管,然后上部用保鲜膜包扎.(如橡皮筋)附4.1 MDA、可溶糖含量—硫代巴比妥酸加热显色法【原理】植物遭遇逆境胁迫或衰老过程中，由于自由基、活性氧的积累引起膜脂过氧化，产生脂质自由基，进一步诱发膜脂连续过氧化并导致蛋白质交联变性，而引起细胞损伤或死亡。

MDA 是膜脂过氧化的最终产物，通过其含量的测定可了解膜脂氧化伤害的程度，比较不同植物抗逆性的差异。

在酸性和高温条件下，MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成红棕色的产物三甲川（3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮）。

该产物在532nm处有最大吸收峰，测定反应产物在532nm处的光密度值，可计算出MDA含量。

但植物组织中的可溶性糖亦与TBA产生颜色反应，其产物对532nm 光的吸收干扰测定。

采用双组分光光度法及其计算式，可排除干扰，计算出MDA的含量。

【器材】分光光度计离心机水浴锅研钵剪刀试管【试剂】（1）10%（W/V ）三氯乙酸（TCA ）：称取10gTCA 定溶于100ml 水中（2）0.6%硫代巴比妥酸（TBA ，以10%的TCA 配制）：取0.6035g 溶于100ml 上述TCA 中（适当加热，否则难溶） 【方法】（1）取0.1g （取0.25g 或0.3g ）叶片，加10%TCA10ml （8ml ）研磨，研磨后在4000r/min 下离心10min （15min ），上清液为样品提取液（2）取上清液2ml （对照加2ml 蒸馏水），加0.6%的TBA2ml ，混合后在100℃水浴上煮沸10min （15min ）（以小试管冒小气泡开始计时），迅速冷却后如有沉淀再离心一次。

分别测定上清液在450nm ，532nm ，600nm 处的吸光值。

【计算】MDA 浓度（umol/L ）=6.45（A 532-A 600）-0.56A 450 MDA 含量（umol/gFW ）=MDA 浓度*VT*10-3/FW 可溶糖浓度（umol/L ）=11.71A 450可溶糖含量（umol/gFW ）=可溶糖浓度*VT*10-3/FW VT ——提取液总体积（ml ） FW ——样品鲜重（g ）【注意】低浓度的铁离子能够显著增加TBA 与蔗糖或MDA 显色反应物在532、450nm 处的吸光值，所以在蔗糖、MDA 、TBA 显色反应中需一定量的铁离子，通常每克干重植物组织中铁离子的含量为100-300ug ，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe 3+的终浓度为0.5umol/L附4.2 过氧化氢（MDA 和过氧化氢用同一提取液）参考Matsubara 等（1983），Partterson 等（1984），林植芳（1988）和刘俊等（2000）的方法，利用H 2O 2与和钛离子形成有色的[TiO （H 2O 2）]2+配合离子（特异吸收峰在410 nm ）的原理对H 2O 2含量进行测定。

【药品】10%三氯乙酸：称10g 三氯乙酸定容至100ml20%TiCl 4浓HCl 液：吸取2ml TiCl 4，用10ml 浓HCl 溶解（注意：两者皆为强挥发性强腐蚀性液体，务必轻拿轻放，通风橱中进行，注意避光保存） 1mol/L 硫酸：吸取5.4ml 浓硫酸，稀释至100ml1mmol/L 过氧化氢1000ml ：取0.15ml30%过氧化氢，定容至1000ml 【方法】准确称取0.5 g （最佳）不同人工老化大豆的新鲜胚轴于6 mL 10％三氯乙酸中研磨成匀浆，定容至10 mL （就用8ml 研磨）。

提取液在10000×g 室温下离心10 min 。

取上清液1 mL 加入0.1 mL 20％TiCl 4的浓盐酸液，再加入0.2 mL 浓氨水。

4500×g ，室温下离心10 min 。

沉淀用3mL 1 mol L －1硫酸充分溶解后，置紫外可见分光光度计上测定410 nm 处吸光光度值。

用标准过氧化氢溶液（0-1mmol L －1）用以上方法做标准曲线。

根据样品吸光光度值对应标准曲线求出过氧化氢量，并计算过氧化氢含量，单位μmol min －1 g －1干重( or 鲜重)。

5、游离脯氨酸【原理】当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性印三酮加热处理，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。

色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低，在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

【器材】【药品】（1）80%乙醇（8ml乙醇加2ml水），人造沸石，活性炭（2）6mol/L磷酸：取纯的磷酸40.92ml，用100ml容量瓶定容。

（3）茚三酮试剂：将1.25g茚三酮（重结晶）于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中加热（70℃）溶解。

4℃保存，试剂两天内稳定，但最好现配现用。

茚三酮的用量与脯氨酸的含量有关，一般当脯氨酸含量在10μg/ml以下时，显色液中茚三酮的浓度要达到10mg/ml,才能保证脯氨酸充分显色。

（4）脯氨酸标准液：准确称取10mgPRO溶于少量80%乙醇中（也可直接用蒸馏水溶），定容到100ml，其浓度为100μg/ml。

（再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标液——一般不做此步）【方法】（制样和标准曲线一起做）（1）绘制标准曲线吸取脯氨酸母液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0ml分别放入8个50ml容量瓶中，分别加入蒸馏水定容，配成1ug/ml，2，3，4，5，6，7，8μg/ml。

分别吸取上述标准溶液2ml,加冰醋酸2ml，茚三酮试剂2ml入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热30min。

冷却后准确加入4Ml甲苯，剧烈震荡30S，静置10min，待红色物质全部转入甲苯溶液时，用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，用分光光度计在520nm下进行比色测定，以甲苯溶液为空白对照，以脯氨酸浓度（或含量）为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。

（2）样品液提取取叶片0.1g（0.3g为宜）加5ml3%磺基水杨酸，加盖（有塞试管），在沸水浴中提取10min，提取过程中要经常摇动，冷却后，以3000r/min离心10min，上清液待测。

取2ml待测液于另一干净的带玻塞试管，加入2ml冰乙酸，2ml酸性茚三酮，在沸水浴中加热30min，溶液即成红色。

冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，用吸管轻轻吸取上层红色脯氨酸甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，比色【计算】脯氨酸含量=浓度*提取液体积*2.5/（样品干重*106）【注意】配制的茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好现配现用。

茚三酮的用量与脯氨酸的含量相关。

一般当脯氨酸的质量浓度在10ug/ml时，显色液中茚三酮的质量浓度要达到10mg/ml时才能保证充分显色称量可以大些，且称量基本一致6、POD、CAT、SOD、可溶性蛋白POD,CAT, SOD，可溶性蛋白含量用同一提取液。