厌氧菌检验(实验)PPT课件

合集下载

厌氧菌的药敏方法介绍PPT课件

1.取上述准备好的受试菌液0.5ml，加入灭菌瓷板槽孔中,按顺序并作标记。
2.用30-50点种针在上述各孔中沾取菌液,用手工或机械手点种到已准备好的抗生素平板面上(每点1 l-3 l)
3.被点种平板做好标记并记录好顺序,同时点种两块不含抗生素平板，留一块作需氧对照, 其余全部进入厌氧手套箱中,一般37 ℃厌氧培养48h。
抗生素
脆弱类杆菌 ATCC 25285
多形类杆菌 ATCC 29741
迟缓真杆菌 ATCC 43055
头孢替坦
4-16
32-128
32-128
（cefotetan）
头孢唑肟
NO
（ceftizoxime）
4-16
16-64
头孢曲松
32-128
64-256
NO
（ceftriaxone）
头孢孟多
32-128
4. 也可将菌的混悬液经厌氧培养4-6h（生长缓慢菌应培养12h），这时应注意菌的浓度，如仍在0.5号MF管内就不作处理, 超过此浓度宜作稀释后再使用。
5.每次药敏试验受试菌中应注意加入标准菌株作为质控.
①B.fragilis脆弱类杆菌(ATCC 25285或NCTC 9343)
②B.thetaiotaomicron多形类杆菌(ATCC 29741) ③C.perfringens产气荚膜梭菌(AATCC 13124) ④E.lentum迟缓真杆菌(ATCC 43055)
≤16
32
≥64
≤8
16
≥32
≤4
8
≥16
续表3 MIC法解释标准（琼脂稀释法）
抗生素
MIC(µg/ml或mg/L)
敏感
中介

厌氧菌的培养方法 ppt课件

2 0.1 0.2
厌氧
无色
残存有氧气
蓝色
10
卢卡斯固体厌氧指示剂
2％硼砂溶液
5毫升
9％硫乙醇酸
1毫升
酚红溶液
0.1～0.2毫升
0.02％美兰溶液
10毫升
琼脂
1％
厌氧
无色
残存有氧气
蓝色
11
布鲁氏指示剂
60％羟甲基氨基甲酯 4％葡萄糖 0.02％美蓝
厌氧
无色
残存有氧气
蓝色
1 1 1
12
疱肉培养基:
牛肉渣
0.5g
牛肉浸液
7ml
液面上加盖3～4mm厚的融化凡士林，灭菌。
生物好氧厌氧培养方法
30
2.7 转管技术和气体喷射培养法
钢瓶进气除氧气体
微 H2源
360℃
铜柱
（亮黄色）
量
O2
CuO （黑色）
31
2.8厌氧手套箱法
又称厌氧室法
32
33
3 厌氧培养方法的选择
亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技术、气体喷射培养法
Gas-Pak法的使用操作程序平皿培养基装入平皿架中置厌氧罐内；打开内盖居中金属网袋，装入触媒钯粒；打开锡箔纸袋，取出厌氧指示剂片；剪开气体发生袋一角，注入10毫升水，迅速紧闭
罐盖，置培养箱中培养。约经5～10分钟后，放入厌氧指示剂片。
注：操作较复杂，需注入水作为触媒。
13
2.2.1 简易厌氧罐
22
氧气指示剂颜色变化图解
1.新鲜指示剂为粉红色（无氧，左）和蓝色（有氧，右），重复使）和淡蓝色（有氧，中右）。 2.厌氧培养2-3小时后指示剂颜色变化稳定。

厌氧菌及检验

二、厌氧菌感染
（一）厌氧菌在正常人体的分布
厌氧菌与需氧菌一起组成了人体的正常菌群。人体许多部位厌氧菌在种类和数量上远多于需氧菌，如在结肠中 99%的细菌都是厌氧菌。临床厌氧菌感染中，由正常菌群的无芽胞厌氧菌的感染最为多见。
常见厌氧菌在正常人体的分布
主要菌属
芽胞厌氧菌梭菌属无芽胞厌氧菌革兰阳性杆菌丙酸杆菌属双歧杆菌属乳杆菌属优杆菌属放线菌属革兰阴性杆菌类杆菌属普雷沃菌属紫单胞菌属梭杆菌属革兰阳性球菌消化球菌属消化链球菌属革兰阴性球菌韦荣菌属 0 ＋＋＋＋－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－＋－＋＋＋＋ 0 0 0 0 ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－＋＋＋＋＋ 0 0 ＋＋ 0 ＋ 0 0 ＋－＋－＋＝＋＋＋＋＋＋－＋＋＋＋＋＋＋＋－ 0 ＋－ 0 0 ＋－＋－＋＋＋－ 0 0 0 ＋＋＋－＋－
5. 厌氧袋运送法
6. 棉拭运送法（略）应在20~30min内处理完毕，最迟不超过2h，防止标本中兼性厌氧菌过度生长，抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，应将标本保存于室温（因冷藏对厌氧菌有害气味直接涂片染色镜检
分离培养
（接种非选择性及选择性培养基）
（二）厌氧菌感染的原因 1. 局部组织的氧化还原电势降低如血管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧，使 Eｈ降低；此外，大面积外伤伴有需氧菌感染消耗了氧，为厌氧菌感染提供了条件。 2 . 机体免疫功能下降如接受免疫抑制剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病病人及老人、婴幼儿、早产儿等，因免疫力下降易併发厌氧菌感染。

厌氧菌的检验课件

厌氧产气袋法：操作简便，不需要特殊实验条件，适合临床常规操作。但应注意厌氧产气袋产热导致细菌死亡，造成假阴性的产生。
厌氧菌的检验课件
厌氧菌的检验课件
培养及鉴定
1.培养：标本应迅速接种，然后放厌氧环境，一般培养48小时;特殊的可以延长。
2.鉴定：首先做耐氧试验，耐氧试验阳性的做革兰染色等染色方法，再做生化鉴定。
在临床是有重要意义的主要有：消化球菌消化链球菌韦荣球菌
厌氧菌的检验课件
厌氧菌的检验课件
革兰阴性无芽胞厌氧杆菌
类杆菌：是临床上分离最多的厌氧菌
厌氧菌的检验课件
厌氧菌的检验课件
梭状芽胞杆菌属
为一大群厌氧或微需氧的粗大芽胞杆菌，革兰阳性，均具有芽胞，故名。临床上有致病性的主要有以下几种：
破伤风梭菌产气荚膜梭菌肉毒梭菌艰难梭菌
厌氧菌的检验课件
破伤风梭菌
可引起破伤风，故名。形态特征：本菌细长，革兰阳性，动力
阳性，芽胞正圆形，比菌体大，位于菌体顶端，使菌体呈“鼓槌状”，为该菌的特征。
厌氧菌的检验课件
微生物检验：根据临床表现可作出诊断，一般不作细菌学检查，若临床需要可按下列方法进行。
1、直接涂片 2、厌氧培养 3、毒力试验 4、鉴定
厌氧菌的检验课件
产气荚膜梭菌
是引起气性坏疽的主要病原菌，或产生外毒素和多种侵袭性酶类。
形态特征：革兰阳性粗短大杆菌，两端纯圆，呈单
或双排列，芽胞体于菌体中央或次极端，不大于菌体，镜下不易观察到。动力阴性。
厌氧菌的检验课件
培养特性：不严格厌氧，在血平板上，多数菌株呈双层溶血环，内环为β 溶血，外环为不完全溶血。
厌氧菌的检验课件

临床微生物检验：厌氧菌

(1)革兰阳性有芽胞杆菌(梭状芽孢杆菌属）破伤风芽孢杆菌产气荚膜梭状芽孢杆菌肉毒梭状芽孢杆菌艰难梭状芽孢杆菌
种类
1、生物学分类
(2) 革兰阳性无芽胞杆菌（正常菌群）乳酸杆菌、双歧杆菌、优杆菌属、丙酸杆菌属
(3) 革兰阴性无芽胞杆菌类杆菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、梭杆
菌属 (4) 革兰阳性厌氧球菌
脉炎等 5.有恶臭的分泌物 6.胃肠和生殖道手术后感染、流产后发生的感染 7.其它：镜检有菌而培养阴性，或在液体及半固体
培养基深部长的细菌等
厌氧菌的检验
临床标本
肉眼观察及直接镜检
需氧培养
分离培养
厌氧培养
2-7d
确定厌养培养
增菌培养厌氧培养
生长
无生长
生长
兼性厌氧菌
专性厌氧菌
保存菌种
分类鉴定
药物敏感试验
引起人类疾病的各种常见厌氧芽胞梭菌
细菌名称
所致疾病
破伤风梭菌产气荚膜梭菌
肉毒梭菌
艰难梭菌
破伤风气性坏疽、毒血症、坏死性肠炎、
E试验
布氏血琼脂 0.5麦氏比浊度 24－48H MIC精确
ß内酰胺酶琼脂培养基单个菌落
30－50min 经济快速检测对青
霉素G和AMP的耐药
耐药性：甲硝唑敏感，氨基糖甙类耐药
梭状芽胞杆菌属
• 厌氧菌中唯一有芽孢菌属 • 厌氧的粗大革兰阳性杆菌 • 是目前细菌中最大的一个菌属 • 广泛分布在自然界（以芽孢的形式）
• 发生内源性感染危险因素（条件） 1.局部组织血液供给障碍：局部缺氧 2.机体局部屏障作用破坏：组织氧张力↓ 3.机体免疫功能↓ 4.菌群失调 5.长期应用氨基糖苷类药物可诱发厌氧菌感染

厌氧性细菌 PPT课件

全国成人高等医学教育系列教材
18
（二）致病性
致病物质：产气荚膜梭菌能产生10余种外毒素和侵袭性酶。
α毒素-----5型细菌均能产生，以A型产生量最大。能分解细胞膜上磷脂和蛋白形成的复合物，造成红细胞、白细胞、血小板和内皮细胞溶解，引起血管通透性增加伴大量溶血、组织坏死、肝脏、心功能受损，在气性坏疽的形成中起主要作用。 β、ε、ι(iota)毒素-----引起坏死损伤和血管通透性增加肠毒素------主要作用于回肠，其次为空肠。其作用机制是肠毒素肽链嵌入细胞膜，破坏膜离子运输功能，改变膜的通透性，而引起腹泻。
全国成人高等医学教育系列教材
19
所致疾病（1）气性坏疽：60%~80%由A型引起。该病多见于战伤，但也见于平时的工伤、车祸、地震等。致病条件与破伤风梭菌相同。气性坏疽潜伏期短，一般仅为8~48小时，使该病发展迅速，病情险恶。如不及时治疗，死亡率高达40%~100%。临床表面为局部剧痛、组织水肿、气肿，触摸有捻发感，伴组织坏死、分泌物恶臭。病菌产生的毒素和组织坏死的毒性产物被吸收入血，引起毒血症、休克。
厌氧培养，但不十分严格。在血琼脂平板上，多数菌株有双层溶血环。
本菌代谢十分活跃，可分解多种常见的糖类，产酸产气。在牛奶培养基中能分解乳糖产酸，使其中酪蛋白凝固，同时产生大量气体，可将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，气势凶猛，称“汹涌发酵”。
全国成人高等医学教育系列教材
17
双层溶血环
内环是由θ毒素引起的狭窄的完全溶血，外环是由α毒素引起的不完全溶血。
全国成人高等医学教育系列教材
20
21
（2）食物中毒：A型产气荚膜梭菌的某些菌株可产生肠毒素引发食物中毒。因食入被本菌大量污染的食物（主要为肉类食品）而引起，潜伏期8~24小时，临床表现为剧烈腹痛、腹胀、水样腹泻、便血。一般1~2天后自愈，但年老体弱者可致死亡。

实验6 厌氧菌、棒状杆菌、分枝杆菌等

血琼脂平板：双层溶血环内环完全溶血-θ毒素外环不完全溶血- α毒素
蛋黄琼脂平板：Nagler反应牛奶培养基：“汹涌发酵”
Nagler反应
产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶分解卵黄
中卵磷脂所致
汹涌发酵
将产气杆菌接种于紫牛奶培养基中
在牛奶中分解乳糖，使其中酪蛋白凝固
细菌产生大量H2和CO2
白喉棒状杆菌生物学特性
蛋黄, 马铃薯, 甘油，孔雀绿
麻风分枝杆菌
•形态、染色与结核分枝杆菌相似 •麻风分枝杆菌是一种典型胞内菌 (麻风细胞) •体外人工培养至今仍未成功
Albert 染色法
•制片同革兰染色 •甲液染5分钟→水洗→再以乙液（碘液）染1分钟 →水洗→印干→油镜检
抗酸染色法
抗酸染色法(acid-fast stain) ：以5％石炭酸复红
Albert染色(异染颗粒)
Elek平板试验结果
白喉杆菌菌苔沉淀线(阳性) 含白喉抗毒素滤纸片
Elek Test
结核杆菌
形态与染色
细长略带弯曲细胞壁脂质含量高，肽聚糖外大量分
枝菌酸齐－尼抗酸染色阳性
培养特点
专性需氧 • 液体培养基：表面生长 ( 菌膜) • 固体培养基：粗糙型菌落 (菜花状) 生长缓慢,营养要求高,常用罗氏培养基
实验六
厌氧性细菌、棒状杆菌、分枝杆菌等
Content
示教破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的形态、染色性及培养特性 Nagler反应、汹涌发酵结核分枝杆菌：抗酸染色法，液体、固体培养麻风分枝杆菌：抗酸染色白喉棒状杆菌： Albert染色法、吕氏血清斜面、亚碲酸盐平板
操作产气荚膜梭菌致病性实验病人痰液（结核分枝杆菌）抗酸染色法口腔螺旋体的检查肠道致病菌粪便标本的分离与鉴定（续）——血清学反应

厌氧菌课件ppt

应在20~30min内处理完毕，最迟不超过2h，防止标本中兼性厌氧菌过度生长，抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，应将标本保存于室温（因冷藏对厌氧菌有害）。
二、检验程序
临床标本
肉眼观察及有无气味
直接涂片染色镜检
需氧培养
分离培养
（接种非选择性及选择性培养基）
增菌培养
（接种液体培养基）
厌氧培养
产黑素普氏菌
四、鉴定试验
初步鉴定；菌体形态、染色反应、菌落性状、对某些抗生素的敏感性；最后鉴定：依据生化反应和终末代谢产物。
1. 形态与染色：对其鉴定较为重要。
2. 菌落性状：包括其形态、大小、色素、荧光及溶血等。
色素：产黑色素普雷沃菌、不解糖紫单胞菌 —
2~10天—黑色素
龋齿放线菌 3~4天粉红色色素
卡那万古冻溶血平板（KVLB，可抑制大多数兼性厌氧
菌，使产黑色素普雷沃菌早期产生黑色素）
FS培养基（梭杆菌选择培养基）
VS培养基（韦荣球菌选择培养基）
CCFA培养基（艰难梭菌）
上述培养基使用注意：①尽量使用新鲜培养基，2~ 4ｈ内用完；②使用前放入无氧环境，预还原处理24~ 48ｈ；③也可采用预还原灭菌法制备的培养基；④液体培养基应煮沸 10min，驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种。
胞外酶快速鉴定试验：利用厌氧菌产生的酶，与少量的生化基质反应，不需培养，只需浓菌液即可，4小时可观察结果。
6. 气液相色谱技术
厌氧罐
厌氧袋
VITEK全自动微生物分析系统的基本配置
MicroScan自动微生物鉴定／药敏测试系统
衣氏放线菌在厌氧血平板上的光滑型菌落
MicroScan自动微生物鉴定／药敏

厌氧菌ppt课件

三、临床常见的厌氧菌
• （一）厌氧性球菌 • （二）革兰阴性无芽胞厌氧杆菌 • （三）革兰阳性无芽胞厌氧杆菌 • （四）梭状芽胞杆菌属
（一）厌氧性球菌
• G＋C：主要包括消化球菌属（黑色消化球
菌Peptococcus niger）和消化链球菌属（Peptostreptococcus anarobius）等9个种。
表1-2 不同部位标本采集法
标本来源封闭性脓肿妇女生殖道下呼吸道分泌物
胸腔组织尿道窦道、子宫腔、深部创伤
收集方法针管抽取后穹窿穿刺抽取肺穿刺术胸腔穿刺术无菌外科切开上阴部膀胱穿刺用静脉注射的塑料导管穿入感染部位抽吸
在紧急情况下，可用棉拭子取材，并采用适合的培养基传送，做厌氧菌培养，最理想是能取得组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长，而且组织标本可真实反映出感染过程的细菌学变化。
3.厌氧菌的感染遍及临床各科，且多为混合感染；
4.厌氧菌对常用的氨基糖甙类抗生素耐药，而对甲硝唑（灭滴灵）普遍敏感。 5.厌氧菌的分离鉴定较繁琐，目前国内大多医院尚未开展此工作，而发达国家早已列为临床检验常规。
种类
•主要可分为两大类，一类是有芽胞厌氧菌，
另一类是无芽胞厌氧菌。
•据目前最新资料显示，有芽胞厌氧菌只有
以及深部脓肿渗出物，经气管抽取的肺渗出物或直接由肺抽取渗出物以及其它组织穿刺液等。
下列标本无送检价值，不宜做厌氧菌培养：
①鼻咽拭子；②齿龈拭子；③痰和气管抽取物；④胃和肠道内容物、肛拭；⑤接近皮肤和粘膜的分泌物；⑥褥疮溃疡及粘膜层表面；⑦排出的尿或导尿；⑧阴道或子宫拭子；⑨前列腺分泌物。
每次标本接种前均应观察标本的性状，包括标本的气味、是否脓性、带血或腐败物质等，厌氧菌的代谢产物中有某些带气味的物质，对厌氧菌的鉴定很重要。均要求详细记录。

(新)厌氧菌的检验

破伤风梭菌能产生强烈的外毒素，即破
伤风痉挛毒素（Tetanospasmin）或称神经毒素(Neurotoxin)。破伤风毒痉挛毒素是一种神经毒素，为蛋白质，由十余种氨基酸组成不耐热，可被肠道蛋白酶破坏，故口服毒素不起作用。在菌体内的痉挛毒素是单一和一条多肽链，分子量 15万。破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素。破伤风梭菌没有侵袭力
1
厌氧菌标本的采集和送检
标本的采集和送检------------
1 标本决不能被正常菌群污染； 2 应尽量避免空气
标本的采集
标本来源封闭性脓肿妇女生殖道下呼吸道分泌物胸腔窦道，子宫腔，深部创伤组织尿道收集的方法针管抽取后穹隆穿刺抽取肺穿刺术胸腔穿刺术静脉注射的塑料导管穿入无菌外科切开上阴部膀胱穿刺
24～48小时后，可形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徒扩散。在血液琼脂平板上有明显溶血环，在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇（有腐败臭味）及硫化氢。
一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化
氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。对蛋白质有微弱消化作用。本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似，但芽胞抵抗力强大。在土壤中可存活数十年，能耐煮沸 40～50分钟。对青霉素敏感，磺胺类有抑菌作用。
0 + + +
+ ++ ++ ++
++ ++ ++ +
0 + ± ±
± + ++ +