包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程
ELISA实验步骤
操作步骤1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。
同时作稀释液对照。
37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA步骤及注意事项
1.蛋白包板：选择合适的蛋白包被浓度梯度，计算上样体积并用包被液稀释（50 μl/孔）。
2. 4 ℃过夜或者37 ℃孵育2 h。
3.用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
4.封闭：（1）新配1～2% BSA或5% 脱脂奶粉（都用PBS配制）（2）上样量100μl/孔（3）37 ℃孵育1～2 h（4）作用：封闭未被蛋白结合上的位点，防止待测抗体与板上空白位点的结合，减少非特异性反应。
5．用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
6. 封闭期间完成一抗的浓度梯度选择和稀释:（1）用新配1% BSA 对一抗进行稀释（BSA可以中和一抗中可能存在的抗BSA的抗体，降低非特异性反应），计算所需稀释液体积后配制。
（2）上样量50μl/孔（3）空白对照和阴性对照孔加等体积PBS（4）37 ℃孵育1 h7．用PBST洗涤3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
8. 一抗孵育期间配制酶标二抗稀释液（1）用新配1% BSA进行稀释，计算所需稀释液体积后配制（一般1:5000）（2）上样量50μl/孔（3）阴性对照孔也加等体积二抗稀释液（4）37 ℃孵育45min～1 h(同一批次二抗孵育时间必须固定，如1h)9. 用PBST洗涤3～4次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
10.显色：（1）A液和B液等体积混合，在使用前需在室温下放置30 min。
（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板（A：B= 5ml: 5ml）（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积显色液（4）显色液上样速度一定要快速并保持匀速（5）37 ℃孵育10 min或者室温避光15 min(从加完第一块板即开始计时)11.终止：（1）2M H2SO4作为终止液（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积终止液（4）终止液上样速度一定要快速并保持匀速12.读数，分析数据于酶标仪测得各孔OD值（终止后10min内），分析处理数据(一)注意事项1.加样在ELISA中除了包被外，一般需进行4－5次加样。
ELISA操作流程
ELISA操作流程一、基本操作流程方法一双抗体夹心法用于检测未知抗原的1. 包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml,按100ul/孔加入酶标板,4℃包被过夜;2. 洗板：次日弃去孔内液体,在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体,加入洗涤液约280-300ul/孔,漂洗2-3次,每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液,室温2-3小时或37℃1-2小时,也可4℃封闭过夜,然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品含未知抗原稀释至所需浓度；5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度定性分析可省略本步骤；6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照,室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8. 加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书,按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体,室温或37℃孵育1小时；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液,室温避光反应15～30分钟;11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液;12. 结果判定：可于白色背景上,直接用裸眼观察结果,反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示;也可在酶标仪上于450nm 若以ABTS显色,则410nm处测OD值;检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值,若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍,即为阳性;方法二间接法用于检测未知抗体1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml,按100ul/孔加入酶标板,4℃包被过夜,次日洗涤2-3次；2. 洗板：次日弃去孔内液体,在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体,加入洗涤液约280-300ul/孔,漂洗2-3次,每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液,室温2-3小时或37℃1-2小时,也可4℃封闭过夜,然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度定性分析可省略本步骤；6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品含未知抗体,阴性对照及阳性对照,室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8. 加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体抗抗体,室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液,室温避光反应15～30分钟;11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液;12. 结果判定：裸眼观察结果或用酶标仪测OD值,有色产物的生成量＝抗体量;二、ELISA常用的四种方法1．直接法测定抗原将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物；加入底物；结果判定：有色产物的生成量＝抗原量;2．间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体表面；加待检抗体, 形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体抗抗体；加入底物；结果判定：有色产物的生成量＝抗体量;3．双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原,形成抗原-抗体复合物;加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物;加酶标抗抗体第二种动物抗体的抗体;加入底物；结果判定：有色产物的生成量＝抗原量;4. 竞争法测定抗原将抗体吸附在固相载体表面;加入酶标抗原和待测抗原；加入底物；结果判定：对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关;。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于测定生物样本中特定分子的定量方法。
它结合了免疫化学和酶学原理。
下面是对ELISA方法的详细过程及步骤的完整版说明：1.准备工作：首先，准备实验室材料，包括ELISA板、试剂、标样、洗涤液、试管、酶标板读取器等。
确保所有物品都是干净且无污染的。
2.涂覆抗原或抗体：将要测定的抗原或抗体在ELISA板的孔中涂覆。
可以将抗原或抗体溶液加入每个孔中，然后在37°C的恒温箱中孵育2到4个小时，以便其吸附在板上。
3.孔的封闭：将孔洗涤掉未吸附的物质，并用阻断液封闭孔，以防止非特异性结合。
4.样本和标准品的加入：将待测样本和不同浓度的标准品加入对应的孔中。
将ELISA板返回恒温箱，孵育一段时间，使样本和标准品中的抗原或抗体与固相相结合。
5.洗涤：将洗涤液加入孔中，用洗涤机或手动洗涤涡流器洗涤孔，以去除未结合的物质。
6.加入检测抗体：加入检测抗体，该抗体具有与待测物质结合的亲和性。
将ELISA板返回恒温箱进行孵育，使检测抗体与待测物质结合。
7.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的检测抗体。
8.加入次级抗体：加入与检测抗体结合的二抗，通常是与酶结合的抗体。
这个二抗具有抗体结合和酶活性。
9.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
10.反应底物：加入染色底物，它通常是可以与酶发生反应并产生可见信号的底物。
11.反应停止：通过加入停止液，中止底物的反应并停止信号的产生。
12.读板：使用酶标板读取器，在特定波长下测量每个孔的吸光度。
这个吸光度与待测样本中目标物质的含量成正比。
13.数据分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标物质的浓度。
总结：ELISA方法是一种常用的免疫学定量方法，它可以用于测定生物样本中特定分子的含量。
在ELISA方法中，首先将待测物质（抗原或抗体）固定在ELISA板上，然后加入待测样本和标准品，进行孵育和洗涤的步骤，以去除未结合物质。
ELISA包被指南
ELISA包被指南如果做ELISA完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液。
1、免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月。
有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。
以下简述固相载体和包被过程。
1.1固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。
可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。
以微量滴定板最为常用，专用于EILSA 的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。
为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。
ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。
现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。
常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。
ELISA法检测抗体效价
ELISA间接法检测抗体效价实验原理：ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），酶联免疫吸附实验。
指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
ELISA操作过程：（一）抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5 ug-10 ug）①准备ELISA酶标板，根据检测的量包被抗原。
②用包被液（NaHCO3-Na2CO3溶液）梯度稀释抗原，包被100 ul/孔，设置双复孔。
③用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4℃过夜（16h-24h）。
（二）洗涤①取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
②加入洗涤液，300 ul/孔，震荡，室温放置3 min。
甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
③共洗涤3次。
④用纯水再洗两次。
（三）封闭①用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。
②洗涤后加入封闭液300 ul/孔。
③保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37 ℃培养箱2h。
④封闭之后无需洗涤。
（四）一抗孵育①封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。
同时设置空白组（空白封闭液），阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。
②加入一抗100 ul/孔。
③孵育：37℃，1h。
（五）洗涤（六）二抗孵育①用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。
②洗涤后，加入二抗，100 ul/孔。
③孵育：37℃，45 min。
（七）洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）（八）底物显色①配制底物液（一块板用量，96孔，10 ml）：1×甲液4.86 ml +1×乙液5.14 ml + 4 mgOPD（3-4粒），迅速混匀。
待充分溶解后加入30% H2O2 50ul 即可。
注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。
底物液需现用现配，H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immuno sorbn ent Assay)的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELI SA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
ELISA包被板与抗原抗体反应板操作步骤
ELISA包被板与抗原抗体反应板操作步骤包被ELISA板：（包被缓冲液稀释口蹄疫病毒兔抗血清（1:1000）在ELISA板上每孔加50µl，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜）1.每孔加50µl兔抗稀释血清 （ELISA包被板）抗原抗体反应板：(在U型血凝板上按50µl/孔量用PBST将待检血清从1:4开始做2倍连续稀释至1:512。
同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔加入50 µl用 PBST稀释到使用浓度的A型口蹄疫病毒抗原，病毒抗原对照孔加100µl。
振荡混匀，封板，4℃过夜。
加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。
)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGH1.A1-A10每孔加入75µl PBST液，A11-A12加入50µl PBST液；B1-B10至H1-H10每孔加入50µl PBST液;B11-H11每孔50µl PBST液，B12-D12每孔50µl PBST液.病毒抗原对照不加。
2.A1-A10加入被检测血清25µl（血清与PBST为1:4）往下做倍比稀释至1：256如图加入阳性对照血清（出厂为1:8稀释）50µl在第A11孔往下做倍比稀释1:2048如图加入阴性对照血清（原浓度）50µl在第A12孔往下做倍比稀释1:4如图C12-D12为空3.所有孔加入稀释好的口蹄疫病毒抗原50µl，病毒抗原对照孔加100µl。
振荡混匀，封板，4℃过夜*注意：口蹄疫病毒兔抗血清的稀释倍数1:1000。
*注意：ELISA板室温过夜，抗原抗体反应板4℃过夜（放置于冰箱冷藏内）。
酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附（ELISA）实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
（2）研究抗酶抗体的合成。
（3）显现微量的免疫沉淀反应。
（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。
本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。
因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。
我们用在霍乱肠毒素的测定。
HbSAg及HbS的测定。
具体步骤一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。
二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。
四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。
六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。
八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。
九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。
注意事项1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。
ELISA步骤、试剂及注意事项
ELISA步骤、试剂及注意事项操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法：1.包被：用0.05M PH9。
牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0。
1ml,4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
（简称洗涤，下同)。
2.加样:加一定稀释的待检样品0。
1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤.（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3。
加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度)0。
1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0。
1ml,37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深,阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm （若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2。
1倍，即为阳性.方法二用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0。
1ml，4℃过夜.次日洗涤3次。
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。
(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体）0。
1ml,37℃孵育30—60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
试剂器材1.试剂（1）包被缓冲液（PH9。
6 0。
05M碳酸盐缓冲液)：NaCO3？1.59克NaHCO32。
93克加蒸馏水至1000ml（2）洗涤缓冲液(PH7。
4 PBS）:0.15M KH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl 8。
elisa检测流程
elisa检测流程Elisa检测流程Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验室检测方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。
它具有高灵敏度和特异性，被广泛应用于医学、生物学、生物技术等领域。
本文将介绍Elisa检测流程的详细步骤和注意事项。
一、实验前准备在进行Elisa实验之前，需要准备试剂、标准样品和实验器材等。
试剂包括抗体、抗原、辅助试剂（如酶标底物、底物缓冲液等）等。
标准样品是已知浓度的抗体或抗原，用于建立标准曲线。
实验器材包括酶标板、离心管、试管、移液器等。
二、酶标板上样1. 将酶标板中的每个孔分别加入待检测样品、标准样品和阴性对照，每个样品重复3次，以确保结果的准确性。
2. 将加入样品的酶标板在室温下孵育一段时间，使样品中的抗体或抗原与酶标板中的特异性抗体或抗原结合。
三、洗涤1. 轻轻倾斜酶标板，将孔内的液体倒出。
2. 用洗涤缓冲液洗涤酶标板中的每个孔，洗涤次数根据实验要求而定，一般为3-5次。
3. 每次洗涤后，用吸球吸干酶标板中的液体，避免孔内残留的液体影响后续步骤的准确性。
四、添加检测抗体1. 加入特异性检测抗体，使其与已经固定在酶标板上的抗体或抗原结合。
2. 孵育一段时间，使检测抗体与酶标板上的复合物形成。
五、洗涤重复第三步骤，将酶标板中的非特异性结合物洗去，保留特异性结合物。
六、添加底物1. 加入底物缓冲液和酶标底物，使其与酶标板上的复合物发生反应。
2. 孵育一段时间，使底物转化为可检测的产物。
七、终止反应加入终止液，停止底物的反应。
终止液的选择根据酶标底物的性质而定。
八、测量结果使用酶标仪或光度计测量酶标板中每个孔的吸光度值。
根据吸光度值可以计算出样品中抗体或抗原的浓度。
九、结果分析根据标准曲线和吸光度值，可以确定样品中抗体或抗原的浓度。
同时，还可以根据阳性对照和阴性对照的结果，判断样品是否阳性或阴性。
十、实验注意事项1. 严格按照实验操作规范进行操作，避免污染和误差。
2. 注意试剂的保存条件和有效期，避免使用过期或变质的试剂。
包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的规程
包涵体蛋白包被E L I S A 板检测抗体的规程集团标准化小组：[VVOPPT-JOPP28-JPPTL98-LOPPNN]包涵体蛋白包被E L I S A板检测抗体的流程一、包涵体包被抗原制备：在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被ELISA 板。
（1）完成包涵体的制备和洗涤流程。
（2）按照常规流程溶解使用8M尿素或者1%SKL（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。
剧烈震动后，室温静置30分钟至2小时或者4℃过夜，使其缓慢溶解。
注：每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含8M尿素的BufferA溶解；或者每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含1%SKL的BufferA溶解（使用前混合，1.97mlBufferA加入0.03ml20％的SKL贮存液）。
（3）抗原稀释：使用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液（CBS）4倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20℃冰箱，减少冻融次数。
注意必须由少到多逐渐加入CBS，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。
DMSO溶解的用CBS稀释4倍。
加入1:2-5倍PBS/TE/SW液体后切胶磨碎，4度放置3-7天，最高转速4度离心取上清冻存。
二、包涵体包被抗原浓度的确定：1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4℃融化。
在ELISA板每孔加入100μLCBS。
将100μL抗原加入ELISA板第一竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第二竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的100μL液体弃去。
注：每种抗原至少稀释3行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含8M尿素的BufferA做对照。
2、包被：4℃过夜或37℃温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次）。
拍干！3、封闭：5%脱脂乳300μL，37℃温育2小时或4℃过夜。
ELISA操作流程
ELISA操作流程（一）、基本操作流程方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）1.包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度；5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8.加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处测OD值。
检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
方法二间接法（用于检测未知抗体）1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8.加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
elsa检测步骤
"ELISA"（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
以下是ELISA的一般步骤：
1. 血清或样品制备：从实验对象中收集血清或样品，并进行适当的处理和稀释，以便在ELISA 中使用。
2. 涂覆抗原或抗体：将待检测的抗原或抗体溶液添加到微孔板（也称为ELISA板）的孔中，并将其静置一段时间，使其与孔壁结合。
3. 孔洗涤：将洗涤缓冲液加入孔中，倒掉孔内余液，重复此步骤数次，以去除非特异性结合物。
4. 加入抗体或样品：将需要检测的样品（如血清）或已知浓度的标准抗体添加到孔中，使其与已固定在孔壁上的抗原或抗体相互结合。
5. 孔洗涤：重复步骤3，以去除未结合的抗体或样品。
6. 添加检测抗体：将与酶标记物结合的二抗或探针抗体添加到孔中，使其与已结合的抗原或抗体相互结合。
7. 孔洗涤：重复步骤3，以去除未结合的检测抗体。
8. 加入底物：将酶底物加入孔中，使其与结合的检测抗体反应。
酶底物的反应产物会显示出可观察的颜色变化。
9. 反应停止：将反应停止液加入孔中，以停止底物的反应。
10. 测量：使用酶标仪或光度计测量每个孔中产生的颜色变化，检测并量化被测物的浓度。
ELISA方法可根据特定需要进行多种形式的变体和优化。
具体的步骤和试剂使用可能会因实验目的、检测对象和实验设计而有所不同，因此在进行ELISA实验时，应根据具体实验方案和相关说明书进行操作。
包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程
包涵体蛋白包被E L I S A 板检测抗体的流程集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-包涵体蛋白包被E L I S A板检测抗体的流程一、包涵体包被抗原制备：在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被ELISA板。
（1）完成包涵体的制备和洗涤流程。
（2）按照常规流程溶解使用8M尿素或者1%SKL（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。
剧烈震动后，室温静置30分钟至2小时或者4℃过夜，使其缓慢溶解。
注：每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含8M尿素的BufferA溶解；或者每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含1%SKL的BufferA溶解（使用前混合，1.97mlBufferA加入0.03ml20％的SKL贮存液）。
（3）抗原稀释：使用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液（CBS）4倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20℃冰箱，减少冻融次数。
注意必须由少到多逐渐加入CBS，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。
DMSO溶解的用CBS稀释4倍。
加入1:2-5倍PBS/TE/SW液体后切胶磨碎，4度放置3-7天，最高转速4度离心取上清冻存。
二、包涵体包被抗原浓度的确定：1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4℃融化。
在ELISA板每孔加入100μLCBS。
将100μL抗原加入ELISA板第一竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第二竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL 加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的100μL液体弃去。
注：每种抗原至少稀释3行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含8M尿素的BufferA做对照。
2、包被：4℃过夜或37℃温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次）。
拍干！3、封闭：5%脱脂乳300μL，37℃温育2小时或4℃过夜。
elisa蛋白包被原理
elisa蛋白包被原理
嘿，你们知道不，这elisa蛋白包被原理啊，其实就跟咱们平时穿衣服差不多，讲究个合身，讲究个精致。
咱先得把那层“衣服”选好，对吧？这层“衣服”就是抗原抗体复合物，得精挑细选，得跟咱们要检测的那个抗原牢牢结合。
然后，咱们得把这个抗原抗体复合物固定在平板上，就像咱们把衣服穿在身上一样，得让它稳稳当当的。
固定完了，再给平板洗个澡，把没粘牢的分子洗掉，就像咱们穿衣服前得洗个澡，干净利索。
接下来，把那个elisa蛋白包被，也就是那个复合物，铺到平板上。
这就像咱们穿上衣服，得让衣服贴合身体，不能有空隙，要让抗原抗体复合物均匀分布在平板上。
然后，再来一层抗体，这就像咱们再穿上一件外套，外面再套一件，增加保护。
这层抗体可就厉害了，它能够跟平板上的抗原结合，形成一个牢固的复合物。
最后，再给这层复合物洗个澡，洗掉没结合上的抗体。
这就像咱们穿衣服后，回家得脱掉外套，只留下需要的衣服。
这elisa蛋白包被原理，其实就是这么一环扣一环，讲究的就是个精细操作。
就像咱们穿衣服一样，得讲究搭配，讲究颜色，讲究款式。
所以啊，这elisa实验，得咱们一步一步来，用心去做，才能出好结果。
你们说呢？这elisa实验，是不是就像咱们穿衣服一样，讲究个细致入微呢？。
包被抗体检测抗原的步骤
包被抗体检测抗原的步骤今天咱们来了解一下包被抗体检测抗原是怎么一回事儿呢。
这就像是一场小小的侦探游戏哦。
我们先要有一个小盘子，这个小盘子就像是一个特别的战场。
我们要把抗体放在这个盘子里，就像在战场上布置我们的小战士一样。
比如说，这个抗体就像一个个小小的手，它们要在盘子里站好位置，准备抓住抗原这个小坏蛋。
接下来呀，我们得让抗体在盘子里待得稳稳的。
这就好比我们盖房子，要把地基打得牢牢的。
我们会用一些特别的东西，让抗体紧紧地贴在盘子上，就像用胶水把小贴纸贴在本子上一样牢固。
然后呢，我们要把可能有抗原的东西放进去。
这就像是把一群小动物放到一个有小陷阱（抗体）的地方。
如果有抗原这个小坏蛋在里面，那些抗体小战士就会一下子抓住它们。
就像小猫咪看到小老鼠，会一下子扑上去一样。
再之后呀，我们要想办法知道有没有抓住抗原。
这时候我们会用到另外一些小帮手，这些小帮手能和抗原或者抗体发生一些有趣的反应。
比如说，就像我们给小战士和小坏蛋都穿上了有颜色的衣服，如果小战士抓住了小坏蛋，我们就能看到颜色的变化啦。
要是看到了颜色变化，那就说明有抗原被抓住啦。
就像我们在草丛里找小虫子，看到小虫子动了一下，就知道找到它了。
如果没有颜色变化呢，那就可能没有抗原在里面。
这个包被抗体检测抗原的过程是不是很有趣呢？就像是一场微观世界里的小战斗。
我们通过这些小小的步骤，就能知道有没有抗原这个小角色存在啦。
是不是感觉像在玩一个很神秘又很有趣的游戏呢？我们可以想象一下，这个小盘子是一个小小的城堡，抗体是城堡里的小卫士，抗原是来捣乱的小怪兽。
小卫士们严阵以待，只要小怪兽一进来，就会被抓住。
这样一想象，是不是这个检测过程就变得特别好理解啦？所以呀，包被抗体检测抗原虽然听起来有点复杂，但只要我们把它想象成有趣的故事或者游戏，就很容易明白这个过程是怎么进行的啦。
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包涵体蛋白包被ELISA 板检测抗体的流程
一、包涵体包被抗原制备：在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作
为检测原
包被ELISA 板。
（1）完成包涵体的制备和洗涤流程。
（2）按照常规流程溶解使用8M尿素或者1%SK（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。
剧烈震动后，室温静置30分钟至2小时或者4°C过夜，使其缓慢溶解。
注：每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含8M尿素的Buffer A溶解；或者每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含1%SK啲Buffer A 溶解（使用前混合，1.97 ml Buffer A 加入0.03 ml 20 %的SKL贮存液）。
（3）抗原稀释：使用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液（CBS 4倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20C冰箱，减少冻融次数。
注意必须由少到多逐渐加入CBS边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。
DMS瞻解的用CBS稀释4倍。
加入1:2-5倍PBS/TE/SW液体后切胶磨碎，4度放置3-7天，最高转速4度离心取上清冻存。
二、包涵体包被抗原浓度的确定：
1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4C融化。
在ELISA板每孔加入100卩L CBS。
将100卩L抗原加入ELISA板第一竖排
孔中；吹打4-5次后，吸出100 g L加到第二竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100g L加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的100 g L液体弃去。
注：每种抗原至少稀释3行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含8M尿素的Buffer A 做对照。
2、包被：4C过夜或37C温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST室温静
置 5 分钟后弃去，反复三次）。
拍干！
3、封闭：5%兑脂乳300 g L，37C温育2小时或4C过夜。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次，拍干！。
封闭不彻底会导
致假阳性！
4、稀释阳性血清：在本实验中，傅强的阳性血清和李仕超的阴性血清均做1000倍稀释。
5、加样：将100 g L稀释好的血清加入上述已包被之反应孔中，置37 C孵育1-2小时。
用PBST洗3次，拍干！。
6、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗100g L o 37 C孵育不超过1小时，PBST洗涤3次，拍干！。
7、加底物液显色：各反应孔中加入100 g L TMB （避光），37 C 10-30min显色。
注：商品化的TMB其实是TMB和双氧水的混合物，长期光照、高温甚至生产日期超过1个月都会导致试剂失效。
&终止反应：于各反应孔中加入50 g L 2M浓硫酸。
9、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，
依据所呈颜色的深浅，以“ +”号表示。
也可测定OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
10、结果分析：观察阴性对照是否也发生反应；选择检测阳性的最高稀释倍数前3-4 孔的稀释度作为最佳包被浓度。
例如，阳性血清如果前8孔为阳性，那么以后检测时抗原可以做24-5稀释后包板为宜。
三、包涵体包被ELISA板检测未知抗体：
1、稀释抗原：按照前期实验结果，用CBS稀释抗原。
每孔加入100 g L抗原稀释液。
2、包被：4C过夜或37C温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST室温静
置 5 分钟后弃去，反复三次）。
拍干！
3、封闭：加入300 g L 5%兑脂乳，37 C温育2小时或4 C过夜。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次。
拍干！封闭不彻底会
导致假阳性！
4、加样：将25-100 g L细胞上清或者待检血清加入上述包被孔中，置37C孵育1-2小时或4C过夜。
用PBST洗3 次,
拍干。
（根据实验设计，同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔）
5、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗100 g L o 37C孵育不超过1小时，PBST洗涤3次。
拍干！
6、加底物液显色：各反应孔中加入100 g L TMB （避光），37 C 10-30min显色。
注：商品化的TMB其实是TMB和双氧水的混合物，长期光照、高温甚至生产日期超过1个月都会导致试剂失效。
7、终止反应：于各反应孔中加入50卩L 2M浓硫酸。
8结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ +”号表示。
也可测定OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
计算公式：(待测样OD-空白OD / (阴性对照OD-空白OD。
大于2.1可判读为阳性。
试剂与耗材
(1) SDS 裂解液200mL
)
(3) 洗涤缓冲液(pH 7.4，0.15 M PBS )：
(4) 封闭液：
(5) 终止液(2 M H2SO4)：。