无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化

合集下载

人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定

中国组织工程研究第19卷第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。

通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究

【摘
要】目的通过分离、培养脂肪问充质干细胞观察其生物学特性及诱导分化为心肌细胞，为心肌再
胶原酶消化分离成人脂肪来源的问充质干细胞并进行传代培养，置相差显微倒
生提供良好的干细胞来源。方法
镜观察细胞形态，流式细胞仪测定Ｃ２、Ｄ１Ｃ３、Ｄ４及细胞周期，Ｔ绘制细胞生长曲线。用第３Ｄ９Ｃ３、Ｄ４Ｃ４ＭＩ代细胞进行诱导分化，观察不同浓度５氮杂胞苷（－ｚ，，，，０１，０ＩｏＬ及不同作用时间（２２，８７）一５Ａａｌ３５ｌ，５２ｍｌ）ｘ／１，４４，２ｈ诱导其向心肌细胞分化的差别，采用最佳浓度１ｍｌ，０ＩｏＬ最佳作用时间２￣／４ｈ进行实验，分别在第７ｌ，ｌ２天用，４２，８免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞一横纹肌、肌球蛋白重链（Ｃ、ＭＨ）心肌肌钙蛋白Ｉｃｎ）（ＴＩ表达，ｌ第４天反转录一聚合酶链反应（ＴＰＲ）Ｒ — Ｃ法检测心肌发育幸关基因ＮＸ．ＨＫ２５的表达。结果倒置相差显微镜下观察原代细胞，可见细胞呈梭型、圆形或椭圆形，核偶见双核。传代细胞核原代细胞形态相似，排列有了一定的方向性。流式细胞仪检测结果显示，１３５第、、代细胞均高表达Ｃ２Ｄ９和Ｃ４；Ｃ３始终表达很弱，Ｄ４而Ｄ１可认为呈阴性表达；Ｄ４在第Ｃ３１３、代细胞弱表达，在第５代细胞表达逐渐减弱为阴性。细胞生长曲线显示前３ｄ处于细胞潜伏状态，４天进第
ｓｕｒｆｓｅｃｌｓｆｒｍｙｅｒａｅｅｅａｉｎＭｅｈｏｄｓｏｃｅｏｔｍｅｌｏａｄｉｌｒｇｎｒｔｏ．ｏｔＡＤＭＳｒｓｌｔｔｏｌｇｎａｅｄｇｓｉｎａｕ — Ｃｓｗｅｅｉｏａｅｄｗｉｈｃｌｅｓｉｅｔｏｎｄｃｌａ

干细胞诱导分化具体步骤及注意事项

干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。

干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。

在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。

在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。

在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。

干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。

二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。

2. 定向诱导干细胞分化。

3. 成长曲线测定。

4. 诱导分化后细胞鉴定。

5. 结果统计分析。

原代培养的人皮下和网膜前脂肪细胞分化特性比较

量指标油红０高于皮下来源细胞（２５６Ｐ＝．２）ｔ＝．０，００５。结论
之皮下来源细胞的脂肪含量增加，提示前脂肪细胞的分化存在部位特异性。
【关键词】人类；前脂肪细胞；细胞分化；下；皮网膜【中图分类号】Ｒ３９２．２【文献标识码】Ａ【文章编号】１０ — ３６２１）０２０ — ３０２７８（００２ — ８６０
【ｂｔｃ】ＯｊｔｅＴｖｓｇｔｔｉｒｃｏｔｉｒｔｔｎｃａｃｒｔｓｅｅｎｔＡｓａｔｒＩｃｖｏｉｅｉｅｈｄｆｅｅｆｈｄｆｅｉｉｈｒｔｓｃｂｔｅｅｂｉｅｎｔａｅｆｎｅｆｎａｏｅｅａｅｉｗｉｈ
ｐｅｄｐｃｔｒｒｕｔｒＺＡＧＨｎ，１ＮＦｎｓｉＬＯ舶，ｔ１ＴｎｎＧｎ ’ ｎＨｓｉｌｒａｉｏｙｅｉｐｉｙｃｌｅＨＮｏｇＴＡｅｇｈ，Ｕｓｎｍａｕｅａ．ｉｊｏｇａｏｔ，ａｉｐａＴｎｎ３０４，ｈｎｉｊ００２Ｃｉａｉａ
ｏｓｒｅｕｎｈｉｅｅｔｔｎＴｅａｕｔｆｌｃｓｏｓｍｐｉｎｗｓｕｅｅｅｍｉｅｔｅｉｓｌｅｓｔｉｂｅｖｄｄｒｇｔｅｄｆｒｎｉｉ．ｈｍｏｎｕｏｅｃｎｕｔａｓｄｔｄｔｒｎｕｉｓｎｉｖｔｉｆａｏｏｇｏｏｈｎｎｉｙｏｒａｉｏｙｅ．ＲｅｕｔｆｐｅｄｐｅｔｓｓｌｓＴｅｅｈｒｗａｎｓｎｆａｔｉｅｅｃｂｔｅｎｈｅｍｅｔｌｎｓｂｕａｅｕｓｏｉｉｃｎｄｆｒｎｅｅｗｅｔｏｎａａｄｕｃｔｎｏｓｇｉｆ

雄激素对人网膜脂肪细胞分泌瘦素的影响

ｌ材料与方法
１１实验材料．
３ ℃恒温水浴振荡消化１后向离心管中再加人适量基础７ｈ
培养基，并用吸管反复吹打使组织块分散。然后依次通过８０目和２０目的不锈钢筛网过滤，集滤液。将滤液以０收６０ｇ离心５ｍｉ０ｎ弃上清。人基础培养基制成细胞悬液。加获得的细胞悬液混匀计数，照１４ｃ２密度接种于按０个／ｍ的２４孔培养板里，３于７℃ ，％ｃｈ培养箱中培养。５ｃ１２３前脂肪细胞分化过程的观察：脂肪细胞接种．．前ｌ～１后基本完全贴壁，２６ｈ加人含血清的基础培养液继续培养２～４ｄ换为分化培养液诱导细胞分化，后改用不３ｄ含ＩＭＸ的分化培养基诱导，日倒置显微镜下观察细胞Ｂ每并照相。用油红０染色以证实细胞分化情况。１２４睾酮对已分化的前脂肪细胞分泌瘦素的影响：．．细胞接种及干预方式同１２３诱导分化至第９天后收集细胞．．，
维普资讯
・
３４・９
鱼堡堑垒查
生墨签查第５７期ＳａＭｅＭａ０８Ｖ１７Ｎ．ｈｒ￣ｄ，ｙ２０，ｏ．，ｏ５Ｊ３
雄激素对人网膜脂肪细胞分泌瘦素的影响
山西医科大学（３Ｏ１杨００Ｏ）坤杨静
２结
果
２１原代培养人前脂肪细胞分化的形态学观察：．人前脂肪细胞接种１后可以基本贴壁。为类圆形，２ｈ初体积较小。后细胞逐渐变为梭形或多角形，显微镜下观察形态类似成纤维细胞并开始迅速增殖。待细胞铺满培养板的７％以０

人骨髓MSC分离培养及诱导分化为脂肪细胞的实验研究

ＡｓａｔＯｂｅｔｅＴｅａｏｔｉｓｄｓｏｒｅｒｉｈｍａｏｅｌＷＭＣｉｌｎ、ｕｉｄａｐｉｄｍｔｏｄｂｔｃ：ｊｃｖｈｉｆｈｕｙｉｔｅａｈＯｕｎｂｎｍａＯＳｓｓａｇｐｒｉ、ｍｌｅｅｄａｒｉｍｓｔｓｃｌｌｏｔｉｆｅｉｆｈｎ
中国实验诊断学
２ＯＯ９年１月
第１３卷
第１期
一
２一７
文章编号：０７— ２７２１）１０７３１０４８（￣９０ —０２ —００
人骨髓ＭＳＣ分离培养及诱导分化为脂肪细胞的实验研究
王莹，罗速
（北华大学基础医学部，吉林吉林１２１）３０３
Ｐｓａｅ３ｄｆｒｎａｅｄｐｃｔｎＬＤＭＥｃｎａｎｎ０％ｈｒｅ￣ｒｌ。ｅｔｉｎｓｔａｏｉｖ．ｎｈｓｎＡａｓｇｉｅｅｔｔｔａｉｏｙｅｉ－ｉｄｏＭｏｔｉｉｇ２ｏｓｔｎＲｌｄＯｓａａｒｕｓｐｓｅＣｏｅｔｏ，ｇｅｌｗｉｔｌ
ａｌｅｔ．ｍｐｉｄｉｖｒｉｆｎｉｏ
Ｋｅｒｓｂｎｌｗｍｅｅｃｙｌｔｍｌ；ｅａａｏ；ｕｔｒ；ｐｉｃｔｎｙｗｏｄ：ｅｍａｏｓｎｈｍａｅｃｌｓｐｒｔｎｃｕｅａｌａｏｏＴｓｅｓｉｌｍｉｆｉ
发生形态学改变，无衰老征象；传代培养ＭＣ（３在２％马血清的ＬＤＥＳｓＰ）ｏ－ＭＭ培养液中分化为脂肪细胞。结论

无血清培养骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化条件的优化

ａｎｄＳｐｉｎａｌＣｏｒｄ，２００７，１７（５）：３７２－３７５
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍ
ＣＵＬＴＵＲＥ）ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ２％ＵｔｒｏｓｅｒＧ．ＣｅｌｌｓＨｉｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｙ．ｒＳｉｘ
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ
ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｓｅｒｕｍ— ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ／ＷＵＢｉｎ，ＺＨＥＮＧＱｉｘｉｎ，ＧＵＯＸｉａｏｄｏｎｇ，ｅｔａｉ／／ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｐｉｎｅ
用于脊髓损伤的ｆ临床治疗创造条件。方法：用含２％ＵｔｒｏｓｅｒＧ的ＵｈｒａＣＵＬＴＵＲＥ无ｆ札清培养体系体外扩增人ＢＭＳＣｓ，采用流式细胞仪检测培养细胞的表面标志，再以全反式维甲酸、Ｂ一巯基乙醇和神经生长子为主要成分组成６种诱导液诱导ＢＭＳＣｓ向神经细胞分化，镜下观察细胞形态学变化，用抗人Ｂ微管蛋ｆＬ１（Ｂ — Ｔｕｂｕｌｉｎ）抗体和抗人胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）抗体进行免疫荧光染色鉴定诱导后的神经细胞，通过流式细胞仪检测诱导后细胞的凋亡率。结果：无血清培养的ＢＭＳＣｓ在６种诱导条件下均可不同程度地分化为神经样细胞，镜下可见诱导后细胞表现为神经细胞形态特征，免疫荧光染色显示Ｂ — Ｔｕｂｕｌｉｎ和ＧＦＡＰ均有阳性表达，诱导后细胞发生不同程度的凋ｒ＿，其中全反式维甲酸和神经生长冈子组成的复合诱导液的诱导效率较高，诱导后细胞凋ｒ：率较低。结论：全反式维甲酸与神经生长子联合应用可存体外高效、稳定地诱导无』『『Ｌ清培养的ＢＭＳＣｓ分化为神经样细胞，是较佳的诱导条件

人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定

人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红;张阳春;张常然;杨兴【摘要】背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。

目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。

方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。

倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。

选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。

选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。

结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。

②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。

③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。

④DAPI是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI不损伤细胞活性，对细胞标记率高。

%BACKGROUND:Adipose-derived stem cels are a kind of mesenchyam stem cels with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cels in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cels from human subcutaneous adipose tissues folowed byin vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. METHODS: Adipose-derived stem cels were isolated from human subcutaneous adipose tissue andcultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cel morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cels at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cel counting kit-8 method, and then cel growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cels underwentosteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cels can be successfuly isolated from human adipose tissues.(2) The growth process of human adipose-derived stem cels includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cels. Moreover, the population doubling time is shorter. (3). Human adipose-derived stem cels are positive for stem cel-related antigens, with low immunogenicity and the multi-differentiation potential. (4) Labeling human adipose-derived stem cels with DAPI is a simple efficient labeled method, and the labeling rate is high but the cytotoxicity is low【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)032【总页数】7页(P5155-5161)【关键词】干细胞;脂肪干细胞;人来源的脂肪干细胞;细胞分化;脂肪组织;细胞培养;细胞鉴定;国家自然科学基金【作者】肖建红;张阳春;张常然;杨兴【作者单位】中山大学附属第一医院东院普通内科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院普通内科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。

3T3L1 preadipocyte

Mature Replaced every 2 days
DMEM containing 1% PS, 10% FBS, and PBE
24h
We first determined the maximal concentration of PBE to be added to mature 3T3-L1 adipocytes based on MTT and LDH assays.
2012
Brown Remodeling of White Adipose Tissue by SirT1-Dependent Deacetylation of Pparγ
We treated 3T3-L1 cells overnight with resveratrol (10 μM), troglitazone (10 μM), rosiglitazone (5 μM), nicotinamide (20 mM), or GW9662 (10 μM). Activating SirT1 with resveratrol or Pparγ with troglitazone increased Ucp1 while the SirT1 inhibitor nicotinamide mimicked the Pparγ antagonist GW9662 to repress it.
(A) Expression of white genes in 3T3-L1 adipocytes treated with 50 μM resveratrol or vehicle (Veh) overnight on differentiation day 7. *: P<0.05, **: P<0.01 vs. vehicle (n=3).

GW9662

GW9662对正常人和甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响作者：雷翔许雪亮来源：《维吾尔医药》2013年第05期摘要：目的：研究GW9662对正常人和甲状腺相关眼病（Thyroid-associated Ophthalmolpathy， TAO）患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响。

方法：培养正常人和TAO 患者眼眶前脂肪细胞，在其增殖和分化的过程中加入GW9662。

MTT法观察GW9662对前脂肪细胞增殖的影响，油红O染色定量的方法观察GW9662对前脂肪细胞分化的影响。

结果：各浓度实验组的GW9662对眼眶前脂肪细胞的增殖影响较小，各组数据间差异无统计学意义。

在各个实验时间段， GW9662对眼眶前脂肪细胞有抑制分化的作用，在48h时作用最明显。

与正常人比较，GW9662对TAO患者眼眶前脂肪细胞的抑制分化作用更明显。

结论：GW9662可抑制正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞的分化，并可能缓解因眼眶前脂肪细胞过度分化导致的TAO临床症状。

关键词：GW9662；眼眶；前脂肪细胞；细胞增殖；细胞分化眼眶内脂肪组织的增生是引起TAO眶内容体积增加的重要因素，该过程的发生与眼眶内成熟脂肪细胞的前体细胞——前脂肪细胞的分化增强有关。

其中，TAO患者眼眶前脂肪细胞及其分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）表达的增强在该过程中起重要作用。

GW9662是PPARs的拮抗剂，可以竞争性结合PPARs配体结合域，从而阻断PPARs 配体的作用途径。

已有动物模型及实验研究证明GW9662可抑制脂肪细胞的分化[1，2]。

本实验研究GW9662对正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响，以期为临床研究提供实验依据。

1 材料和方法1.1眼眶脂肪组织取自行眼球摘除术的患者眼眶，共4例4眼，年龄38～45（平均42）岁。

TAO眼眶脂肪组织取自眼眶减压术中，病情分级均为6级，共4例4只眼，年龄37～48（平均44）岁。

无血清培养促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化

中国组织工程研究第７７卷笫３６
２０１３— ０９— ０３出版
ＷＷＷ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｍａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｎｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｐｔｅｍｂｅｒ３．２０１３Ｖｏ１．１７Ｎｏ．３６
ｄｏｉ：ｌＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－４３４４．２０１３．３６．０１０ｔｔｐ：ｌｌｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ，ｏｒｇ］雾垣杉．颜玲无盘清培养促进§ 舫子细跑囱瞧管内皮细匏分佬．中国组织Ｉ程研究．２０１３． ’ ７（３￣：６４４３－６４４８．
无血清培养促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化木 ★
郭垣杉，颜
文章亮点：
玲（中山大学附属第三医院整形外科，广东省广州市５１０６３０）
１实验创新性地采用无血清培养大鼠脂肪干细胞２４ｈ，模拟慢性难愈性创面长期所处的低氧缺血环境，观察由此产生的大鼠脂肪干细胞向血管内皮诱导的影响。２结果证实经无血清培养后大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞分化效率明显提高，且分化而来的细胞具备血管内皮细胞的形态及基本功能。
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ：Ｔｈｅｒｅａｒｅｆｅｗｒｅｐｏｔｓａｂｏｕｔｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅｃｕｌｔｕｒｅｏｎｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒａｔ

人脂肪间充质干细胞体外培养鉴定与诱导分化的初步研究

究
郭常敏，王达利，魏在荣，龙艳
（遵义医学院烧伤整形外科，贵州遵义５６３０９９）
［摘
要］目的分离培养人脂肪间充质干细胞（ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ），观测表型及表达
长状态好，仍保持良好干性，经诱导可多向分化，表明ＡＤＳＣｓ可作为良好的细胞治疗或组织工程种子细胞的来源，
且有潜在广泛应用前景。
【关键词】脂肪阃充质干细胞；体外培养；人；鉴定
［中图法分类号］Ｒ３２９［文献标识码］Ａ［文章编号】１０００－２７１５（２０１３）０１－０３２－０５
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｓｏｌａｔｅａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｈｕｍａｎａｄｉｐｏｓｅｄｅｉｒｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＡＤＳＣｓ）
特异性蛋白与多向诱导分化的能力。方法取人脂肪组织，机械法与酶消化法分离、培养，观察细胞形态及增殖活力，免疫细胞化学和ＦＣＭ检测其标志蛋白。第９代ＡＤＳＣｓ向成脂、成软骨和成骨细胞诱导分化。结果原代细胞贴壁后多呈多角形，传代后呈均一梭形。免疫细胞化学结果显示：ＡＤＳＣｓ不表达ＣＫ１９，而波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）阳性表达，间充质干细胞表面标志ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ７３均高表达，ＣＤ４５十３４＋１ｌｂ＋ｌ９＋ＤＲ为０．４８％。第９代ＡＤＳＣｓ诱导培养后分别出现脂肪、软骨、骨细胞特征性染色阳性。结论酶消化法可有效分离ＡＤＳＣｓ，第９代生

无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化

无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化1朱惠娟，史轶蘩，邓洁英，龚凤英中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院内分泌科（100730）E-mail：huijuanzhu@摘要：采用胶原酶消化法从人皮下脂肪中分离并原代培养人前脂肪细胞，通过对细胞形态学的观察、油红O对细胞内脂质染色，以及脂肪细胞标志性酶G-3-PDH活性的测定对细胞进行鉴定。

摸索在无血清条件下培养并诱导人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的条件。

在无血清的基础培养基中前脂肪细胞可以维持增殖，增殖期的第3-10天为对数增长期。

无血清分化培养基培养4天后细胞形态逐渐变圆，并出现球性脂滴，脂滴的数量逐渐增多至分化培养的第21天到达顶峰。

在无血清培养的状态下成功诱导前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，为研究激素或细胞因子对前脂肪细胞的增殖或分化机制的研究打下了的基础。

关键词：无血清培养，原代培养，前脂肪细胞，增殖，分化1．引言随着全球经济的迅猛发展和物质的高度丰富，肥胖症正在以惊人的速度取代感染性和营养不良性疾病威胁人类的健康。

导致机体肥胖的脂肪组织是由脂肪细胞、前脂肪细胞、微血管内皮细胞和细胞外的基质成分组成的（1），过多热量以甘油三脂的形式存储在脂肪细胞内，脂肪细胞是在不同的转录因子诱导一系列特异基因表达下由前脂肪细胞分化而来的，而前脂肪细胞起源于胚胎中胚层的多能干细胞（2-4）。

目前认为在胚胎期就存在分化的脂肪细胞，在胚胎发育的后期和出生后的儿童期脂肪细胞迅速分化，到了成人期，虽然主要以脂肪细胞的体积增加为主，但前脂肪细胞仍然保留了分化能力，在适当的生理条件诱导下能够不断地分化成为脂肪细胞。

目前对前脂肪细胞的研究主要是通过体外细胞培养的方法进行的。

目前体外用于前脂肪细胞和脂肪细胞研究的细胞系主要有三类：1）来自胚胎的全潜能（totipotent）胚胎干细胞,能生成各种细胞系（ES细胞）(5)。

12）以C3H10T1/2、NIH3T3为代表的多潜能（multipotent）干细胞系；3）以3T3-L1、3T3-F442和Ob17为主的前脂肪细胞系是目前应用最广泛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞研究的细胞系。

脂肪细胞培养

脂肪细胞培养人脂肪细胞（adipocyte）是十分好的讨论对象。

它们是正常细胞，常用来自大网膜脂肪组织或皮下结缔组织培养。

在特别培养条件下，它们不增殖，能分化成类似成熟的脂肪细胞。

在无血清培养液中，前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，能生长增殖、汇集，并可传代。

常用前脂肪细胞（preadipocyte）原代培养法来讨论脂肪细胞的发育。

【材料】 1．组织来源腹股沟区皮下或腹膜后的脂肪组织。

2．培养用试剂 (1）清洗液：HBSS，不含Ca2+, Mg2+和，加入100U/ml和100ug/ml。

(2）消化液：Trypson/EDTA,0.05％，0.53 mmol EDTA ; Ⅱ型胶原酶，配成1 mg/ml HBSS液。

(3)溶解红细胞缓冲液10mmol KHC03,0.1 mmol EDTA,0.154mol NH4Cl，溶于去离子蒸馏水中。

(4）分化液 1）分化液（EDTA/F12+)：DMEM/F12添加15mmol HEPES,15mmol NaHC03,33umol、0.5 umol17 umol 泛酸（pantothenic acid),0.2nmol（triiodo-thyronine) ,0.1umol （dexamethasone) ,50U/ml、50ug/ml。

2）地塞米松：制备5 mmol 的EtOH干液，储存于-20℃中，稀释成10-5 mol的DMEM/F12的稀释液，用法时加入至1.Oml/l00ml的DMEM/Fl2。

3)三碘甲状腺原氨酸：制备蒸馏水配0.2mmol干液（106x终浓度）保存于-20℃，用DMEM/F12稀释成1/1000，然后加入100u1/100ml DMEM/F12。

4）泛酸：制备1000x终于浓度（17 mmol )蒸馏水配的用法液，分装成每0.5m1等分，保存于-20℃，用法时加入至1.Oml/l00m1的DMEM/F12, 5)DMEM/Fl2;1:1; DMEM的混合物和Ham补有F12养分混合物，含15 mmol NaHC03,15mmol HEPES,50U/ml和50ug/ml。

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化
闵敏，张雪静，马红，许辉，李遇梅
（１．江苏大学附属医院皮肤科，江苏镇江２１２００１；２．镇江市第二人民医院皮肤科，江苏镇江２１２００２）
ＭＩＮＭｉｎ，ＺＨＡＮＧＸｕｅ－ｉｆｎｇ，ＭＡＨｏｎｇ，ＸＵＨｕｉ，ＬＩＹｕ．ｍｅｉ
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ＡｉｌｆｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＺｈｅｎｊｉａｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１２００１；２．ＤｅｐａｔｒｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｙ，ｔｇｈｅＳｅｃｏｎｄＰｅｏｐｌｅｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｈｅｎｊｉａｎｇ，ＺｈｅｎｊｉａｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１２００２，Ｃｈｉｎａ）
伴有成脂发生。ＲＴ — ＰＣＲ结果显示，与对照组相比，成脂诱导组ＰＰＡＲｙ一２ｍＲＮＡ有时间依赖性递增表达，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。与对照组相比，成骨诱导组骨桥蛋白，ＰＰＡＲｙ一２ｍＲＮＡ均有时间依赖性递增表达，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．ｏ１）。结论：建立了一种分离培养ｈＡＤＳＣｓ简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

摸索在无血清条件下培养并诱导人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的条件。

在无血清的基础培养基中前脂肪细胞可以维持增殖，增殖期的第3-10天为对数增长期。

无血清分化培养基培养4天后细胞形态逐渐变圆，并出现球性脂滴，脂滴的数量逐渐增多至分化培养的第21天到达顶峰。

在无血清培养的状态下成功诱导前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，为研究激素或细胞因子对前脂肪细胞的增殖或分化机制的研究打下了的基础。

目前对前脂肪细胞的研究主要是通过体外细胞培养的方法进行的。

目前体外用于前脂肪细胞和脂肪细胞研究的细胞系主要有三类：1）来自胚胎的全潜能（totipotent）胚胎干细胞,能生成各种细胞系（ES细胞）(5)。

此外2001年， Wabitsch M和他的同事报道了用一例Simpson- Golabi-Behmel syndrome (SGBS)的患者脂肪组织分离出前脂肪细胞首次建立的人前脂肪细胞系（6）。

但是非整倍体的前脂肪细胞系在诱导成为永生细胞的过程中细胞的分化能力会受到影响，甚至丧失了其体内的固有生理环境，尤其是前脂肪细胞系不能反映不同年龄、不同部位的脂肪细胞的生物学特点。

而原代培养的细胞刚刚离体，1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助（20020023051）- 1 -生物学特征没有发生很大的变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内细胞生长特性，适合细胞分化的实验研究。

无论是前脂肪细胞系还是原代培养的前脂肪细胞在胰岛素、糖皮质激素等激素的诱导下均可分化成为脂肪细胞。

目前通过在前脂肪细胞增殖和分化的过程中加入或对抗某些细胞因子或激素以研究这些细胞因子或激素在前脂肪细胞增殖和分化中的作用机制仍是主要的实验研究方法，但是血清中含有多种细胞因子和激素类物质，会干扰对细胞因子和激素调控作用的研究，因此无血清培养是研究激素或细胞因子对前脂肪细胞增殖和分化作用的重要条件。

国内迄今为止未见到在无血清的条件下维持前脂肪细胞增殖和诱导分化的研究报道。

我们在本实验室建立了人前脂肪细胞的原代培养方法，通过观察细胞形态的变化，油红O染色和测定细胞内G-3-PDH酶活性的方法对细胞进行了生物学的鉴定。

探索了在无血清的状态下维持人前脂肪细胞的增殖和分化的方法。

为进一步研究激素或细胞因子对前脂肪细胞增殖和分化提供了有力的实验手段。

2．材料和方法：2．1主要试剂和仪器CO2培养箱（Heraeus ，德国），超净工作台（北京半导体设备一厂）台式离心机（北京医用离心机厂），恒温水浴槽（北京半导体设备一厂），恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机厂），倒置相差显微镜及摄像系统（ Olympus，日本），全自动酶标仪（Anthos，澳大利亚），超声破碎仪（AHSECO公司）。

DMEM/F12培养基（Hyclone公司，美国），胎牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所），Ⅰ型胶原酶（Gibco-BRL公司，美国），胰蛋白酶（GiBco-BRL公司，美国），噻唑兰、胰岛素、甲状腺素、地塞米松、IMBX、泛酸、转铁蛋白（Sigma公司，美国），生物素（上海生物制品厂），油红O（Ameresco公司，美国）。

原代培养基础培养基的配制：DMEM培养基添加10%灭活后的胎牛血清、青霉素100IU/ml，链霉素100µg/ml、生物素(33µM)、泛酸(17µM)、转铁蛋白(10µg/ml)（括号内为添加试剂的终浓度）。

无血清原代培养分化培养基的配制：在DMEM/F12无血清培养基中添加胰岛素（0.5µM）、地塞米松(0.25µM)、甲状腺素(0.2nM)、IMBX(0.5nM)。

2．2试验方法：2．2．1原代培养人前脂肪细胞的分离培养：取无菌条件下新鲜切除的人腹部皮下脂肪组织约5-10g，放入培养皿。

用1X PBS冲洗后尽量剔除结缔组织和可见的血管。

充分剪碎脂肪组织加入含5毫升胶原酶的离心管，37℃水浴震荡消化40分钟。

将含有组织的消化液通过孔径25µm（200目）的筛网过滤，分别收集滤液和未过滤的组织块。

将滤液以600g离心5分钟弃上清，加入原代培养的基础培养- 2 -基制成细胞悬液。

将未滤过的组织按上述的过程再消化处理一次，将两次获得的细胞悬液混匀计数，并按104个/cm2的密度接种在培养瓶中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。

接种12-16小时后细胞基本全部贴壁，可以使用1XPBS冲洗细胞2-3次后换为无血清培养基继续培养。

4-6天后细胞铺满培养瓶的70%以上就可以换为分化培养基诱导细胞分化。

在增殖状态下的前脂肪细胞可以使用胰蛋白酶消化的方法进行传代，并可以冻存和复苏。

2．2．2前脂肪细胞形态学观察：使用倒置相差显微镜直接观察到细胞形态的变化以及分化过程中细胞内逐渐增多的脂肪滴。

油红O可以特异性的使脂质着色，，前脂肪细胞在分化培养基中逐渐分化成为成熟的脂肪细胞，细胞质内有脂质滴聚集因此油红O染色可以用于脂肪细胞的鉴定，并进行分化状态的观察和分化程度的间接定量分析。

2．2．3前脂肪细胞生物学测定：用MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）法观察人前脂肪细胞生长状态：前脂肪细胞在96孔培养板分别生长至2，4，6，8，10及12天时用MTT法检测细胞的生长状态。

酶标仪492nm波长处测OD值，无细胞的孔做空白对照。

前脂肪细胞分化为脂肪细胞，具有一些特征性的标志，其中催化甘油三脂合成的甘油-3-磷酸脱氢酶（G-3-PDH）是脂肪细胞特异性表达的一种酶类。

从诱导分化第2天前脂肪细胞内的G-3-PDH活性从分化前无活性显著增加，并随着分化而逐渐增加，至分化末期达到峰值。

超声破碎的方法处理脂肪细胞后将磷酸二羟丙酮作为反应底物，测定单位重量的G-3-PDH蛋白的酶活性。

3．结果3.1原代人前脂肪细胞的增殖过程：3．1．1形态学观察：新消化分离的人前脂肪细胞接种12小时后可以基本完全贴壁，细胞呈梭形、多角形或扇形；细胞核呈卵圆形，位于细胞质的中央，显微镜下观察形态类似成纤维细胞，细胞在第3天开始增殖，聚集性生长，细胞排列成螺旋形、放射状；细胞在培养的4-10天增殖迅速，当细胞逐渐融合后生长速度开始逐渐减慢。

在增殖过程中的前脂肪细胞使用油红O染色完全不能着色。

原代人前脂肪细胞增殖第8天（光镜，×200）- 3 -3．1．2 MTT法对3例不同体重指数患者的前脂肪细胞的无血清培养基中的增殖状况进行了观察。

患者情况如下：标本序号年龄性别 BMI（Kg/m2）患病情况1 23 F 22.1 阑尾炎2 36 M 26.5 胆结石3 58 F 31.1 结肠良性占位人前脂肪细胞在无血清的培养基中增殖状况：接种后12-16小时细胞基本贴壁，1XPBS 冲洗后立即换为无血清培养基，接种后的第4天开始进入对数增长期，细胞数显著增加到接种后的第10天进入增殖的平台期。

细胞数目的倍增时间为60-72小时。

图：原代人前脂肪细胞无血清基础培养基中生长曲线(n=8，N=3)3.2原代培养的人前脂肪细胞分化过程：3.2.1人前脂肪细胞分化过程的形态学观察：新消化分离的人前脂肪细胞接种后的4-10天增殖迅速，当细胞逐渐融合后生长速度开始逐渐减慢。

换成分化培养基诱导前脂肪细胞分化第2天开始镜下观察细胞体积变大，细胞质变浅考虑是细胞贴壁更加紧密，围绕细胞核出现细胞器呈环状聚集（necklace），在分化的第4天开始细胞内可以观察到反光的脂质小滴，并随着分化的进展越来越多的细胞出现脂质小滴，而且单个细胞内的脂质小滴的数目逐渐增加，并使细胞的形状由多角形逐渐变为椭圆形或圆形，到了分化的12-14天一些分化的脂肪细胞内的脂肪小滴会相互融合为较大的脂肪滴，并将细胞核推向细胞的一侧。

到分化的21天，约有92%（88%——94%）的细胞可以- 4 -- 5 -分化为成熟的脂肪细胞。

原代人前脂肪细胞分化第14天（光镜，×200）3.2.2油红O 染色的方法观察前脂肪细胞分化过程：随着前脂肪细胞的分化，细胞内能被油红O 着红色，而洗脱后未分化的细胞和细胞内非脂质聚集的部分未着色的脂质逐渐增多增多，间接反应脂肪细胞逐渐分化成熟。

分化第8天（油红O 染色，×200）3.2.3分化的人前脂肪细胞内G-3-PDH 酶活性测定：在未分化的前脂肪细胞内未测到G-3-PDH 的活性。

从诱导分化的第2天可以测到前脂肪细胞内G-3-PDH 的活性，并逐渐增高，从分化的第4到16天为线形增加，到分化的第16天G-3-PDH 的活性到达峰值，并维持到分化的末期21天。

人原代前脂肪细胞分化过程G-3-PDH活性曲线(N=3,n=3)4.讨论：在本实验室建立了人前脂肪细胞原代培养的方法，诱导前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，并实现了在无血清培养的条件下维持前脂肪细胞的增殖和分化，为研究各种细胞因子或激素对前脂肪细胞的增殖或分化的作用提供了实验细胞模型。

国际上对脂肪细胞的形态及功能的研究可以追溯到1950s年代，Trowell等将大鼠的脂肪组织碎片进行培养和观察（7）。

此后随着对脂肪组织研究的深入，发现脂肪细胞是由形态类似成纤维细胞的脂肪细胞前体细胞（adipocyte precursor cell ）在适当的条件诱导下分化而来的，直到1971年W.J.Poznanski 等首次发现用胶原酶消化并离心的方法可以将漂浮在上层的脂肪细胞和沉淀在下层的基质血管细胞（stromal-vescular cell，SV细胞）分离开来，而后者在有血清的培养基中可以分化成为成熟的脂肪细胞，被命名为脂肪前体细胞或前脂肪细胞（8、9）。