无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化

无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化1

朱惠娟，史轶蘩，邓洁英，龚凤英

中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院内分泌科（100730）

E-mail：huijuanzhu@

摘 要：采用胶原酶消化法从人皮下脂肪中分离并原代培养人前脂肪细胞，通过对细胞形态学的观察、油红O对细胞内脂质染色，以及脂肪细胞标志性酶G-3-PDH活性的测定对细胞进行鉴定。摸索在无血清条件下培养并诱导人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的条件。在无血清的基础培养基中前脂肪细胞可以维持增殖，增殖期的第3-10天为对数增长期。无血清分化培养基培养4天后细胞形态逐渐变圆，并出现球性脂滴，脂滴的数量逐渐增多至分化培养的第21天到达顶峰。在无血清培养的状态下成功诱导前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，为研究激素或细胞因子对前脂肪细胞的增殖或分化机制的研究打下了的基础。

关键词：无血清培养，原代培养，前脂肪细胞，增殖，分化

1．引言

随着全球经济的迅猛发展和物质的高度丰富，肥胖症正在以惊人的速度取代感染性和营养不良性疾病威胁人类的健康。导致机体肥胖的脂肪组织是由脂肪细胞、前脂肪细胞、微血管内皮细胞和细胞外的基质成分组成的（1），过多热量以甘油三脂的形式存储在脂肪细胞内，脂肪细胞是在不同的转录因子诱导一系列特异基因表达下由前脂肪细胞分化而来的，而前脂肪细胞起源于胚胎中胚层的多能干细胞（2-4）。目前认为在胚胎期就存在分化的脂肪细胞，在胚胎发育的后期和出生后的儿童期脂肪细胞迅速分化，到了成人期，虽然主要以脂肪细胞的体积增加为主，但前脂肪细胞仍然保留了分化能力，在适当的生理条件诱导下能够不断地分化成为脂肪细胞。目前对前脂肪细胞的研究主要是通过体外细胞培养的方法进行的。目前体外用于前脂肪细胞和脂肪细胞研究的细胞系主要有三类：1）来自胚胎的全潜能（totipotent）胚胎干细胞,能生成各种细胞系（ES细胞）(5)。12）以C3H10T1/2、NIH3T3为代表的多潜能（multipotent）干细胞系；3）以3T3-L1、3T3-F442和Ob17为主的前脂肪细胞系是目前应用最广泛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞研究的细胞系。此外2001年， Wabitsch M和他的同事报道了用一例Simpson- Golabi-Behmel syndrome (SGBS)的患者脂肪组织分离出前脂肪细胞首次建立的人前脂肪细胞系（6）。但是非整倍体的前脂肪细胞系在诱导成为永生细胞的过程中细胞的分化能力会受到影响，甚至丧失了其体内的固有生理环境，尤其是前脂肪细胞系不能反映不同年龄、不同部位的脂肪细胞的生物学特点。而原代培养的细胞刚刚离体，

1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助（20020023051）

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生物学特征没有发生很大的变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内细胞生长特性，适合细胞分化的实验研究。无论是前脂肪细胞系还是原代培养的前脂肪细胞在胰岛素、糖皮质激素等激素的诱导下均可分化成为脂肪细胞。目前通过在前脂肪细胞增殖和分化的过程中加入或对抗某些细胞因子或激素以研究这些细胞因子或激素在前脂肪细胞增殖和分化中的作用机制仍是主要的实验研究方法，但是血清中含有多种细胞因子和激素类物质，会干扰对细胞因子和激素调控作用的研究，因此无血清培养是研究激素或细胞因子对前脂肪细胞增殖和分化作用的重要条件。

国内迄今为止未见到在无血清的条件下维持前脂肪细胞增殖和诱导分化的研究报道。我们在本实验室建立了人前脂肪细胞的原代培养方法，通过观察细胞形态的变化，油红O染色和测定细胞内G-3-PDH酶活性的方法对细胞进行了生物学的鉴定。探索了在无血清的状态下维持人前脂肪细胞的增殖和分化的方法。为进一步研究激素或细胞因子对前脂肪细胞增殖和分化提供了有力的实验手段。

2．材料和方法：

2．1主要试剂和仪器

CO2培养箱（Heraeus ，德国），超净工作台（北京半导体设备一厂）台式离心机（北京医用离心机厂），恒温水浴槽 （北京半导体设备一厂），恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机厂），倒置相差显微镜及摄像系统（ Olympus，日本），全自动酶标仪（Anthos，澳大利亚），超声破碎仪（AHSECO公司）。DMEM/F12培养基（Hyclone公司，美国），胎牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所），Ⅰ型胶原酶（Gibco-BRL公司，美国），胰蛋白酶（GiBco-BRL公司，美国），噻唑兰、胰岛素、甲状腺素、地塞米松、IMBX、泛酸、转铁蛋白（Sigma公司，美国），生物素（上海生物制品厂），油红O（Ameresco公司，美国）。原代培养基础培养基的配制：DMEM培养基添加10%灭活后的胎牛血清、青霉素100IU/ml，链霉素100µg/ml、生物素(33µM)、泛酸(17µM)、转铁蛋白(10µg/ml)（括号内为添加试剂的终浓度）。无血清原代培养分化培养基的配制：在DMEM/F12无血清培养基中添加胰岛素（0.5µM）、地塞米松(0.25µM)、甲状腺素(0.2nM)、IMBX(0.5nM)。

2．2试验方法：

2．2．1原代培养人前脂肪细胞的分离培养：

取无菌条件下新鲜切除的人腹部皮下脂肪组织约5-10g，放入培养皿。用1X PBS冲洗后尽量剔除结缔组织和可见的血管。充分剪碎脂肪组织加入含5毫升胶原酶的离心管，37℃水浴震荡消化40分钟。将含有组织的消化液通过孔径25µm（200目）的筛网过滤，分别收集滤液和未过滤的组织块。将滤液以600g离心5分钟弃上清，加入原代培养的基础培养

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基制成细胞悬液。将未滤过的组织按上述的过程再消化处理一次，将两次获得的细胞悬液混匀计数，并按104个/cm2的密度接种在培养瓶中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。接种12-16小时后细胞基本全部贴壁，可以使用1XPBS冲洗细胞2-3次后换为无血清培养基继续培养。4-6天后细胞铺满培养瓶的70%以上就可以换为分化培养基诱导细胞分化。在增殖状态下的前脂肪细胞可以使用胰蛋白酶消化的方法进行传代，并可以冻存和复苏。

2．2．2前脂肪细胞形态学观察：

使用倒置相差显微镜直接观察到细胞形态的变化以及分化过程中细胞内逐渐增多的脂肪滴。油红O可以特异性的使脂质着色，，前脂肪细胞在分化培养基中逐渐分化成为成熟的脂肪细胞，细胞质内有脂质滴聚集因此油红O染色可以用于脂肪细胞的鉴定，并进行分化状态的观察和分化程度的间接定量分析。

2．2．3前脂肪细胞生物学测定：

用MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）法观察人前脂肪细胞生长状态：前脂肪细胞在96孔培养板分别生长至2，4，6，8，10及12天时用MTT法检测细胞的生长状态。酶标仪492nm波长处测OD值，无细胞的孔做空白对照。前脂肪细胞分化为脂肪细胞，具有一些特征性的标志，其中催化甘油三脂合成的甘油-3-磷酸脱氢酶（G-3-PDH）是脂肪细胞特异性表达的一种酶类。从诱导分化第2天前脂肪细胞内的G-3-PDH活性从分化前无活性显著增加，并随着分化而逐渐增加，至分化末期达到峰值。超声破碎的方法处理脂肪细胞后将磷酸二羟丙酮作为反应底物，测定单位重量的G-3-PDH蛋白的酶活性。 3．结果

3.1原代人前脂肪细胞的增殖过程：

3．1．1形态学观察：新消化分离的人前脂肪细胞接种12小时后可以基本完全贴壁，细胞呈梭形、多角形或扇形；细胞核呈卵圆形，位于细胞质的中央，显微镜下观察形态类似成纤维细胞，细胞在第3天开始增殖，聚集性生长，细胞排列成螺旋形、放射状；细胞在培养的4-10天增殖迅速，当细胞逐渐融合后生长速度开始逐渐减慢。在增殖过程中的前脂肪细胞使用油红O染色完全不能着色。

原代人前脂肪细胞增殖第8天

（光镜，×200）

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