基于tale靶向基因修饰技术 方金辉生物学自然科学专业资料
TALENs的靶向基因修饰技术
对应关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。 3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况少。 4. 克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序
列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更 好的活性。
TALENs的靶向基因修饰技术 TALENs--transcription activator-like effectors nucleases
简介
基因组靶向修饰
诱变技术
转基因技 术
转录激活子样效应因子 生物应用模型构
核酸酶技术（TALENs）
建
RNAi技术
锌指核酸酶 技术
反义吗啡 林技术
RNAi技术
RNAi: 与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录 后基因沉默的现象
其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降 解，产生干扰小的RNA（siRNA),这些siRNA与 同源的靶RNA互补结合，特异性降解靶RNA从而 抑制或者下调基因的表达。
转基因技术：将人工分离和修饰过的基因导入到生 物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体 的性状的可遗传修饰。
反义吗啡林技术：反义寡核苷酸抑制特定的信使 RNA对蛋白质的翻译来控制基因的表达。
简介
TALEN（ Transcription Activator-Like Effector Nucleases ） 转录激活子பைடு நூலகம்效应因子核酸酶
TALENs 的靶向基因修饰技术是一种崭新的分子生物学方法，现已应用 于植物、哺乳动物细胞、人类细胞、线虫、酵母、斑马鱼及大鼠等各类 研究对象。
TALENs的作用机制
基于生物信息分析皮肤黑色素瘤治疗的关键靶点
现代肿瘤医学2221年07月第29卷第11期MODERN ONCOLOGY,Jun.2221,VOL.29,No.11•1648•基于生物信息分析皮肤黑色素瘤治疗的关键靶点刘芳君，蓝吴涛，朱芷葳AndlysO of key targeta for the0eXmedt of skin cetaneous melanoma based on bioinformaticsLIE FanUumLAN-WU Tax,ZHU ZhiwaiCollepp rf Life Scienca,Shanxt Adricultarai UugerpPo；Shanxi Taina032821,China.【Abstract i Objective:The Hub genes involved in the occurrence and develodmen-of cutaneous me/noma werescreened bp bminforma/cs method,and their prognosis was analyzed to explore the poSphal molecular marhers forearly diagnosis of skin cutaneous me/noma.Methodc:Two SKCM re/ted data profilos were obtained from Gene Expression Omnibus dataUase.The/Re/Ptiahy expressed genes between me/noma cells and melanocytes were screenedbp GEO2R analysis,and the diRerenhai genes were analyzed systema/ca/g bp bioinformahcs.：Ove/appiny575/Re/ntiah y expressed genes were ikenti/ed from two mRNA data profiles.3Hub genes were seXcted bp Cyto-scape,of which6genes were siynificangy corre/ted with the overall survival rate of SKCM pa/ents(P<2.25).PMEL,TYR,DCT,GPR143and MLANA were highly expressed in SKCM,while CDH1was Xw.GPR148and target-bodxd hw-miR-342-3p were re/ted to the metastasis of SKCM.Concliision：P MEL,TYR,DCT,GPR143,MLANAnddCDH1eeonhedhoSKCM neepeednchedbsbnondeoemnhncsmeheod2ChnsspecuonhedhenhGPR143nddesn-mnR-322-3p are re/ted to SKCM metastasis,which p/vides a new target for targesd thempp of SKCM.【Key wonts】bAimorma/cs,syin cutaneous meXnoma,/Re/Ptiahg expressed genes,Hub genes,survival analysisModern Oncology2221,29(11)：1648-1949【摘要】目的:采用生物信息学方法筛选岀参与皮肤黑色素瘤(Win cutaneous me/noma,SKCM)发生发展的核心基因,并将其进行预后分析，挖掘SKCM早期诊断的潜在分子标志物。
TIE2配体寡肽的设计、筛选及其在基因治疗中的靶向导入作用
ＴｌＥ２配体寡肽的设计、筛选及其在基因治疗中的靶向导入作用博十研究生：导师：复旦人学医学院吴向华顾健人教授上海市肿痛研究所中文摘要肿瘤基因治疗将成为除手术、放疗和化疗等方法外又‘新的抗癌策略。
尤其在抗肿瘤转移和复发方面将起重要作用。
目前还缺乏将基因导入人体细胞的高效靶向性载体系统，这是基冈治疗至今尚未成为临床常规治疗措施的关键因素之。
因此研发～种高效靶盼陛基冈导入系统成为当务之急。
本研究旨在建立一种靶向Ｔｉｅ２受体的非病毒摹因导入系统并检验其何效性，为今后肿瘤的基因治疗提供可靠的理沦依据与实践指导。
第一部分Ｔｉｅ２配体寡肽的设计与筛选【目的】掌握特定受体的配体寡肽的设计与筛选方法；获得Ｔｉｅ２受体的候选配体寡敝；【方法】（１）应用基于Ｔｉｅ２受体天然配体Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ一２的同源序列比较／二级结构分析及疏水性分析方法没计Ｔｉｅ２受体的配体寡肽并化学合成；（２）ＲＴ－ＰＣＲ和ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔｉｎｇ筛选Ｔｉｅ２阴性表达细胞株；构建ｐＣＤＮＡ３．０一ＥｘＴｉｅ２质粒并转染Ｔｉｅ２表达阴性细胞，Ｇ４１８筛选ｍＴｉｅ２稳定表达细胞系；分别以重组人Ｔｉｅ２融合蛋白（ｒｈ—Ｔｉｅ２／Ｆｃ）与稳定表达Ｔｉｅ２受体的细胞为筛选靶，用噬菌体展示随机１２肽库避行筛选。
经过５轮筛选的噬菌体，经测序、ＥＬＩＳＡ、免疫组化及噬菌体回收试验鉴定出高度富集的阳性噬葡体克隆；然后化学合成高亲和力阳性噬菌体克隆展示肽。
【结果】基于Ｔｉｅ２受体的配体ＡｎＤｏｐｏｉｅｔｉｎ一２设计的２２肽命名为ＧＡ３（ＷＴＩＩＱＲＲＥＤＧＳＶＤＦＱＲＴＷＫＥＹＫ）；筛选到Ｔｉｅ２阴性表达细胞株ＳＭＭＣ７７２１；建立了Ｔｉｅ２｛急定表达细胞系ＳＭＭＣ７７２１一ＥｘＴｉｅ２；以ｒｈ—Ｔｉｅ２／Ｆｃ与ＳＭＭＣ７７２１－ＥｘＴｉｅ２为筛选靶获得的高亲和力富集噬菌体展示肽序列羧基端各加一个酪氨酸后分别命名为ＧＡ４（ＨＡＴＧＴＨＧＬｓＬｓＨＹ），｝ＦＩＧＡ５（ＮｓＬｓＮＡｓＥＦＲＡＰＹ）。
葛根素靶向线粒体抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭的机制
网络出版时间：２０２４－０４－１１２１：５４：４４ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０６５．Ｒ．２０２４０４１０．１０１０．０１１葛根素靶向线粒体抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭的机制余才翰１，２，李 岱１，谢 敏１２０２４－０２－２０接收基金项目：国家自然科学基金（编号：８１９０１１４９）；湖北省自然科学基金（编号：２０２２ＣＦＢ３５６）作者单位：１湖北科技学院医学部药学院，咸宁 ４３７１００２咸宁市中心医院（湖北科技学院第一附属医院）眼科，咸宁 ４３７１００作者简介：余才翰，男，硕士研究生；谢 敏，女，副教授，硕士生导师，责任作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｘｉｅｍｉｎ２０２０ａ＠１６３．ｃｏｍ李 岱，男，教授，硕士生导师，责任作者，Ｅ ｍａｉｌ：２４９８５８５６５＠ｑｑ．ｃｏｍ摘要 目的 利用网络药理学、分子对接及体外实验验证探讨葛根素对人乳腺癌细胞ＨＣＣ１８０６增殖、侵袭和凋亡的作用及机制。
方法 ＧＥＯ数据库收集乳腺癌和线粒体疾病数据，ＧＥＯ２Ｒ分析差异性表达基因；韦恩图分析乳腺癌与线粒体数据集的重叠基因；ＧＯ和ＫＥＧＧ功能富集分析重叠基因；ＳＴＲＩＮＧ和Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ分析重叠基因相互作用网络并筛选核心基因；Ａｕｔｏｄｏｃｋ对接葛根素和核心基因；通过ＣＣＫ ８、ＥｄＵ、ＴＵＮＥＬ和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞增殖、凋亡和侵袭能力，采用Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ实验检测线粒体膜电位，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白质表达水平。
体内实验通过乳腺癌皮下异种移植和免疫组化分析葛根素的抗肿瘤药效。
结果 乳腺癌和线粒体疾病共有１３２个重叠基因，筛选出１０个核心差异性表达基因，其中双丝氨酸／苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶（ＤＳＴ）在乳腺癌组织中呈低表达。
葛根素可结合并上调ＤＳＴ表达，抑制人乳腺癌细胞ＨＣＣ１８０６增殖和侵袭，促进细胞凋亡，增加凋亡相关蛋白Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ３和Ｂａｘ表达，下调抗凋亡蛋白Ｂｃｌ ２的表达，降低线粒体膜电位。
基于TALE的靶向基因修饰技术 -方金辉
通过 PCR 扩增 TALE 重复单元，用 IIS 型内切酶产生多种一一对应、特异匹 配的粘性末端对。一次可以连接 4~6 个 TALE 重复单元。
（2）传统的基于质粒载体的GG法（GG-Vector）
基于质粒载体，用 IIS 型内切酶产生多种一一对应、特异匹配的粘性末端对。 一次可以连接8~10 个 TALE 重复单元。
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TALE蛋白新功能
清华大学生命学院施一公教授研究组（Cell Reports,2012）报道转 录激活因子样效应蛋白（TALE）能够特异识别DNA-RNA杂合链，并且 能够保护DNA-RNA杂合链不被核酸酶降解。 他们针对HIV病毒逆转录过程中的一段DNA-RNA杂合序列设计了特 异的含有23个重复单元的TALE蛋白TALEHIV，该蛋白可以有效地阻止 RNase H 对这段DNA-RNA杂合链中RNA链降解。如果HIV在逆转录过程 中，不能有效降解RNA，则不能完成其基因组的扩增。因此，这一发现 为抑制HIV病毒提供了新思路。
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一步连接
只要4-5小时，这些片段就全部连接 N’ Promoter
TALEN backbone vectors
CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6
1/2
FokI
C’
Promoter
3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌； • Off-target 严重。
美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target”
龟板活性成分调控ShhWnt3a信号通路诱导骨髓间充质干细胞成骨分化－挑战杯
龟板活性成分调控ShhWnt3a信号通路诱导骨髓间充质干细胞成骨分化－挑战杯龟板活性成分调控Shh/Wnt3a信号通路诱导骨髓间充质干细胞成骨分化来源：第十一届“挑战杯”国赛作品小类：生命科学大类：自然科学类学术论文简介：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有向成骨分化的潜能，在骨缺损修复领域具有广阔的应用前景。
以中医学“肾主发育，主骨生髓”为理论依据，前期的研究表明，益肾中药龟板通过调控视黄酸受体α（RARα）与维生素D受体（VDR）两条信号通路而影响MSCs的增值和分化。
本研究立足前期建立的龟板甾类成分的分离分析、质控及MSCs的成骨分化技术，免疫组化、Western blot、原位杂交、RT-PCR等方法检测成骨分化标志物ALP、OPN及VDR的表达，证实维生素D受体是龟板提取物诱导MSCs成骨分化的可能药理靶点；进一步结合计算机辅助药物设计，用分子对接的方法模拟龟板提取物中三个甾类成分（4-甾酮、十四酸甾醇酯、甾醇）与核受体VDR的相互亲和力，同时采用活性导向的标准组分模式来验证龟板中何种甾类成分是诱导MSCs成骨分化的物质基础，并用Shh信号通路的特异性抑制剂环杷(Cyclopamine)阻断Shh信号通路，探讨了引发这一生物学效应的信号通路机制。
计算机模拟结果表明，4-甾酮对核受体VDR的亲和力较十四酸甾醇酯大，而后者又比甾醇大。
实验结果表明，龟板活性成分4-甾酮能显著增加其钙化结节的数目，提高成骨分化标志物ALP、OPN的表达水平，并且以剂量依赖的方式促进Shh 及Wnt3a的表达，表明4-甾酮是龟板提取物诱导MSCs成骨分化的物质基础，其成骨分化的机制可能与上调信号分子Shh 及Wnt3a的表达有关。
计算机模拟结果和实验结果相一致，具有可重复性。
在此基础上，用Cyclopamine阻断Shh信号通路后检测发现Gli1不表达，Wnt3a略见表达，而VDR的表达组间未见明显改变，推测其成骨分化的可能机制与龟板活性小分子直接进入细胞膜作用核受体VDR，进而上调Shh的表达,激活其下游转录因子Gli1及Wnt3a信号，最终启动成骨分化有关。
γ-ifn诱导nb细胞分化及trka表达实验的研究
中文摘要目的神经母细胞瘤（ＮｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａＮＢ）是儿童常见的一种交感神经系统的恶性胚源性肿瘤，部分ＮＢ细胞具有自行分化逆转的特性。
大多数学者认为诱导ＮＢ细胞逆转的主要机制是诱导剂对癌基因的调控。
目前所研究的众多癌基因中，Ｔｒｋ家族的表达是最引人注目的研究热点。
（编码酪氨酸激酶受体的Ｔｒｋ癌基因家族在神经元分化，靶器官生长发育及神经分布方面起着重要作用。
Ｔｒｋ癌基因家族最初被认为是致癌基因，其基因产物最近被证实是神经营养素（ＮＴ）的高亲和受体，Ｔｒｋ癌基因家族在结构与功能相关方面至少包括３个成员：ＴｒｋＡ，ＴｒｋＢ，ＴｒｋＣ。
ＴｒｋＡ主要由抻经生长因子（ＮＧＦ）激活。
有证据表明ＴｒｋＡ的表达与临床预后密切相关，早期ＮＢ（Ｉ、Ⅱ、Ⅳ一Ｓ期）常有ＴｒｋＡ的高度表达，导致应答基因激活，轴突延伸，而晚期ＮＢ（Ⅲ、Ⅳ期）和有Ｎ—ｍｙｅ扩增者，ＴｒｋＡ的表达则降低。
在多数细胞系中，ＴｒｋＡ持续低水平表达，而在分化逆转的ＮＢ细胞中，ＴｒｋＡ表达明显增强。
因此，ＴｒｋＡ的表达增强被人们认为参与诱导ＮＢ逆转的分子机制之一。
ｊ本研究使用７．干扰素（７－ＩＦＮ）作为分化诱导剂．其本身具有抗病毒、抗肿瘤效果。
Ｓｈｉｋａｔａ在１９９４年首次应用７－ＩＦＮ诱导ＮＢ细胞系：ＫＰ—Ｎ—ＲＴ和ＫＰ—Ｎ—Ｓ１分化及其ＴｒｋＡ表达明显增加，且细胞分化及ＴｒｋＡ表达增加量与７－ＩＦＮ作用时间，使用剂量成正相关；而后Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ等利用７一ＩＦＮ诱导ＮＢ细胞系ＳＭＳ—ＫＣＮＲ分化且ＴｒｋＡ表达亦明显增加。
本题旨在继续探索Ｉ）＇－ＩＦＮ诱导ＳＭＳ—ＫＣＮＲ细胞分化后，其分化率，ＴｒｋＡｍＲＮＡ的表达，７一ＩＦＮ。
本课题由国家自然科学资金资助·ｌ·三者之间的关系。
这～研究目的在于揭示ＮＢ细胞分化的分子生物学机理；且探索７－ＩＦＮ诱导ＫＣＮＲ细胞系分化的最佳作用时间及应用剂量。
这一课题研究的成功可为ＮＢ细胞的诱导分化及临床治疗提供理论依据。
TALEN靶向基因修饰新技术研究进展_靳玉珠
chilling injury in banana fruit[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2012,92:2624-2629.[11]Wan C Y,Wilkin T A.A modified hot borate methodsignificantly enhances the yield of high quality RNA from cotton(Gossypium hirsutum L.)[J].Anal Biochem,1994,223:7-12.[12]Puhakainen T,Pihakaski-Maunsbach K,Widell S,et al.Coldacclimation enhances the activity of plasma membrane Ca2+-ATPase in winter rye leaves[J].Plant Physiology and Biochemistry, 1999,37:231-239.[13]郑姗姗,李丹,蒋欣梅,等.渐降低温胁迫对黄瓜幼苗叶绿体膜相关指标的影响[J].浙江大学学报(理学版),2012,39(5):582-586. [14]刘悦萍.高温锻炼和水杨酸诱导葡萄幼苗耐热性的细胞学机制研究[D].北京:中国农业大学,2003:18-32.ＴＡＬＥＮ靶向基因修饰新技术研究进展靳玉珠1,2，王世山1，向华2，王晓虎2（1．焦作市畜产品质量安全检测中心，河南焦作454002；2．广东省农科院动物卫生研究所，广东广州510640）摘要：靶向基因敲除基因修饰TALEN(Transcription Activator-Like(TAL)Effector Nucleases)，是一种崭新的分子生物学工具，被《Science》选为2012年年度十大科学突破的新技术。
该技术通过构建与核酸内切酶的融合蛋白，在特异位点打断目标基因DNA序列，从而可在该位点进行DNA编辑修饰操作，如knock-out、knock-in、碱基替换、点突变或基因修饰等。
基于生物信息学和分子对接技术对皮肤黑色素瘤中癌基因AURKA综合分析及靶向药物筛选
基于生物信息学和分子对接技术对皮肤黑色素瘤中癌基因AURKA综合分析及靶向药物筛选基于生物信息学和分子对接技术对皮肤黑色素瘤中癌基因AURKA综合分析及靶向药物筛选摘要：皮肤黑色素瘤是一种高度侵袭性的皮肤恶性肿瘤，近年来发病率逐渐升高。
基因AURKA在皮肤黑色素瘤发生发展过程中起着关键作用，因此了解AURKA的功能和调控机制对于综合分析黑色素瘤的发病机制和寻找靶向治疗药物具有重要意义。
本研究利用生物信息学和分子对接技术对AURKA进行了综合分析，并筛选了潜在的靶向药物。
引言：皮肤黑色素瘤是由黑色素细胞恶性肿瘤引起的皮肤疾病，是最具侵袭性和致命性的皮肤肿瘤之一。
基因AURKA （Aurora kinase A）是调控细胞有丝分裂的重要蛋白激酶，被广泛认为在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。
材料和方法：本研究通过生物信息学分析获取了AURKA在皮肤黑色素瘤中的表达水平，并进一步探究了其功能和调控机制。
通过对已有数据库的分析，我们了解了AURKA在皮肤黑色素瘤患者中的基因表达异常情况。
同时，通过分子对接技术筛选了与AURKA结合特异性较强的潜在靶向药物。
结果：生物信息学分析结果显示，AURKA在皮肤黑色素瘤组织中明显上调表达。
进一步功能分析发现，AURKA能够促进皮肤黑色素瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。
调控机制分析发现，AURKA通过多种信号通路（如PI3K/Akt、MAPK、Wnt等）参与黑色素瘤的发生和发展。
结论：本研究通过生物信息学和分子对接技术对AURKA进行了综合分析，发现其在皮肤黑色素瘤中起着重要作用。
AURKA的过表达促进了黑色素瘤细胞的增殖和侵袭，可能成为黑色素瘤的治疗靶点。
通过分子对接技术，我们筛选出了与AURKA结合特异性较强的潜在靶向药物，为黑色素瘤的靶向治疗提供了候选药物。
关键词：皮肤黑色素瘤；AURKA；生物信息学；分子对接技术；靶向药物引言：皮肤黑色素瘤是一种高度侵袭性的皮肤恶性肿瘤，其发病率急剧上升，并且在晚期常常导致患者的死亡。
Cell丨精确制导，安全提升，基于靶向表观遗传治疗的新一代CRISPRCas9技术—附专家点评
Cell⼁精确制导，安全提升，基于靶向表观遗传治疗的新⼀代CRISPRCas9技术—附专家点评基因编辑技术——尤其是CRISPR/Cas9技术——的迷⼈之处在于，能够⾼效地在特定位点插⼊或移除基因，或修复致病基因突变。
然⽽基于CRISPR/Cas9的常规基因编辑技术在应⽤到疾病治疗上时，⼈们会有多种顾虑。
这些顾虑主要包括DNA链在被切开然后修复的过程中引⼊未知的突变、脱靶和基因表达量的不可控等。
12⽉7⽇，Cell在线发表了来⾃美国Salk⽣物研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte课题组题为“In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation”的研究论⽂，报道了⼀种经过改良的CRISPR-Cas9技术，能够特异性改变疾病相关基因的活性，⽽⾮其对应的序列。
研究⼈员还展⽰了这项技术可以⽤于治疗包括肾脏、肌⾁和胰岛素产⽣功能损伤等在内的⼩⿏疾病模型，为将来更好的⽤于治疗⼈类疾病奠定了良好的基础。
鉴于该⼯作在未来可观的临床应⽤前景，BioArt特别邀请到了中科院神经科学研究所杨辉研究员进⾏了精彩点评，以飨读者！该论⽂的通讯作者Juan Carlos Izpisua Belmonte表⽰，“DNA剪切可能会造成新的突变，⽆论是CRISPR还是任何其他DNA剪切技术，都存在这个隐患。
这是遗传学领域⾯临的主要瓶颈：细胞在DNA剪切后可能引⼊新的危害”。
针对上述问题，Belmonte实验室对CRISPR-Cas9系统进⾏了改造，其⽬的不再是切割DNA⽽是可以通过表观编辑技术（epigenetic editing technology）在保证DNA完整性的基础上特定激活基因的表达，并且能够在⼩⿏体内产⽣表型。
事实上，过去早在2013年就有⼀些报道利⽤dCas9-VP64 系统激活特定基因的表达【1,2】，当初更多的只是利⽤单个sgRNA，然⽽对于基因激活来说更多的是需要多个sgRNA来完成，后续也有相关的技术改进（例如：tripartite activator system [dCas9-VPR], synergistic activationmediator [SAM], or dCas9-Suntag），甚⾄还有第⼆代【3】。