SDS-PAGE电泳操作流程—含考染 银染 碘染

SDS-PAGE操作流程——考染

1、准备溶液

30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide

【配制方法】

将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】

4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存

【注意事项】

丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)

【配制方法】

称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

【保存条件】

4℃保存。

【注意事项】

对人体有刺激性，请注意适当防护。

1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)

称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。）

【保存条件】

4℃保存

【注意事项】

应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS

称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保存

【保存条件】

室温保存

【注意事项】

对人体有害，请注意防护。

10%过硫酸铵溶液-----10%(w/v)AP

称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管，加1mL去离子水吹打溶解，4℃保存

【保存条件】

4℃保存

【注意事项】

10%过硫酸铵溶液在4℃保存时，可使用1周左右，超过期限会失去催化作用

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液----- 5×Tris-Glycine buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液）

称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000ml，室温保存。得0.125mol/L Tris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。

【保存条件】

室温保存

【注意事项】

配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。

电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。

5×SDS-PAGE加样缓冲液----- 5×SDS-PAGE Loading Buffer

【组分浓度】0.25MTris-HCL(pH6.8)；

10%(W/V)SDS；

0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝)；

50%(V/V) 甘油；

量取1.25mL 1MTris-HCL（pH6.8），0.5g SDS，25mg BPB，2.5mL甘油，置于10mL 塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5mL，小份（0.5mL/份）分装，于室温保存。使用前将25μL的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。【保存条件】

-20℃保存，至少一年有效。

【注意事项】

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。

摘自Takara 商品目录--实验室常规试剂配制方法

TEMED原液直接使用

考马斯亮蓝R-250染色液

考马斯亮蓝染色脱色液

2、实验步骤

2.1. 制胶

2.1.1组装胶架

将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并

确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。

2.1.2 分离胶的配置

混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板

梳齿下缘约1cm)。

2.1.2.3 液封

在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水（或者75%乙醇）以隔绝空气，使胶面平整。静置

约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝

固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。

2.1.3 浓缩胶的配置

混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模

板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。

2.2 电泳

2.2.1 安装电泳槽

将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹

形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，

其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1×tris-gly电泳缓冲液。

2.2.2 样品处理

对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5×buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。

对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2×buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分

钟。

2.2.3 加样

用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

2.2.4 电泳

将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

2.2.5 剥离胶

把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，取下。

2.3 染色

放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。

2.4 .脱色

取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

2.5 拍照

将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到胶片观察灯上，拍照。

SDS-PAGE操作流程——银染

1、固定：25mL醋酸，100mL甲醇，加入125mL超纯水，对凝胶中蛋白质进行固定60min

（固定时间可延长，加一步水洗）。

2、浸泡：75mL甲醇，0.5g无水硫代硫酸钠（强还原性），17g醋酸钠（28.18g三水合醋酸

钠），加入165mL超纯水，（每10mL溶液中加入100uL稀释十倍的甲醛），30min。3、水洗：用超纯水洗三次，每次10min。