小鼠输精管结扎和简单精子操作
试验六1、小鼠采精方法的研究
实验六、小鼠采精方法中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVEMEDICINE2005年4月第15卷第2期April, 2005 Vol.15 No.2郑新民,李聚学,魏雁,乔宪凤,周荆荣(湖北省农科院生物技术研究所,武汉430072小鼠是世界上研究最为详尽的哺乳类动物[1]。
但是目前人们仍然是通过手术法从小鼠附睾中获取精子,国内外尚无小鼠非手术法采精的报道。
手术法采精为众多的科学研究带来了不便:(1)手术法采精必须将雄鼠处死,分离其附睾和输精管来获取精子,过程繁琐,费时费工,且造成不必要的经济浪费[2]。
另外,从附睾中获取的精子由于缺少副性腺中的诸多有益成分,精子品质难以保证[3];(2)不利于小鼠生殖生理的研究,在医学上,人们都是通过“杀鸡取卵”式地宰杀大量的雄鼠来获取精子进行科研分析[4-6],不但造成了很大的经济浪费,而且增加了实验的误差和难度;(3)不利于某些动物模型的建立,例如,由于小鼠精子获取繁琐,人工授精技术不易建立,精子载体转基因技术尚无理想的动物模型,这极不利于该项研究的开展[7]。
由此可见,建立一种方便快速的小鼠非手术法采精技术对解决小鼠手术法采精中存在的问题、小鼠生殖生理的研究和建立某些小鼠动物模型都是很有意义的。
1 材料和方法1.1 实验动物SPF级昆明小白鼠雄鼠,购自湖北省预防医学科学院。
合格证号为:SYXK(鄂)20035853。
1.2 小鼠假阴道抽吸器的制备小鼠假阴道的制作:取一段长约2 cm,内径8 mm的软质透明塑料管,在其内侧套上一层厚度约0.1 mm的胶膜,胶膜要求透明且有良好的弹性。
在塑料管中部钻一直径为2 mm的小孔,将一外径与小孔相当的硬质插管插入小孔中,深度与塑料管管壁厚度相当,小孔周围用强力胶水密封,向小管中轻轻吹入空气即可将塑料管内侧胶膜充起。
将制好的小鼠假阴道与胶头吸管相连,小鼠假阴道抽吸器即制作完毕。
1.3 电刺激采精仪的制备电刺激采精仪由电刺激发生器和直肠探子两部分组成。
实验一小鼠睾丸附睾及输精管精子采集运动能力检测与结构观察
实验用品
3. 实验动物： 选择60日龄以上，体重达到32-35g的昆明种 公鼠。
实验方法
1. 精子采集：
左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图3-1所 示方法，以颈部脱臼法处死小鼠。使处死的小鼠 仰卧，用75%的酒精棉球消毒腹部开口部位被毛 及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统。无菌分离睾 丸、附睾及输精管。在含培养液的表面皿中，用 眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂 肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨 碍精子观察。
实验方法
采集附睾尾精子时，将其剪成几段。采集输精管 精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗 管腔，将输精管放入含有1ml培养液的表面皿内， 在实体显微镜下，用一只眼科异物针固定输精管， 用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精 子会浮游到培养液中。将大块输精管组织拨开， 用吸管连同精子吸出液体部分，装于乳动物的精子在睾丸内形成，并必须经过 在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的 变化而最终达到成熟，才能获得向前运动的能 力，这种向前运动能力的获得是精子受精能力 的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部两 个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成 头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成，
实验目的
1. 认识雄性小鼠睾丸、附睾、输精管等 生殖器官结构及位置特点；
2.掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采 集方法；
3.掌握血细胞计数板法精子计数和运动 能力检查的方法；
4.通过睾丸、附睾及输精管精子运动能 力检测，认识精子在睾丸产生后，在 附睾内成熟的过程；
实验目的
5. 掌握精子抹片方法； 6. 掌握染色法进行精子结构观察和顶体 结构观察的方法，认识精子的正常结构； 7. 使学生得到小鼠精子操作的基础训练。
实验方法
小鼠的基本实验操作
小鼠皮肤移植试验、卵巢摘除术
近交系小鼠皮肤移植试验
• 一、动物
• KM小鼠2只（1雌1雄）
• 二、方法： • 尾-背植皮法
• 尾-尾植皮法
近交系小鼠皮肤移植试验
• 三、步骤
• 1、异体尾-背植皮法
• （1）麻醉 固定 • （2）受体小鼠，背部剪毛（1.5cm×1.5cm），酒精消毒， 去皮（0.3cm×0.3cm） • （3）供体小鼠，酒精消毒尾部，尾背部剪皮 （0.5cm×0.5cm） • （4）供体皮片覆盖受体背部方洞 • （5）1～3周后观察结果
• 5、解剖
腹腔：肝脏、胃、肠道、胰腺、脾脏、肾脏、肾上腺、 输尿管、膀胱；卵巢、输卵管、子宫；睾丸、附睾、输精 管。 胸腔：肺、心脏。 颈部：甲状腺。 头部：开颅取脑。
兔的一般实验操作
• 1、抓取和固定
• 2、性别鉴定
兔的一般实验操作
• 3、给药
• （1）灌胃 • （2）耳缘静脉注射•Biblioteka 4、采血• （3）尾静脉注射
小鼠的基本实验操作
• 6、采血
• （1）眼眶后静脉丛采血 （2）眼球摘除采血
• 7、麻醉
• 2%水合氯醛，20ml/kgBW，腹腔注射
8、处死
• • 颈椎脱臼 过量麻醉
小鼠的基本实验操作
• 9、解剖
腹腔：肝脏、胃、肠道、胰腺、脾脏、肾脏、肾上腺、 输尿管、膀胱；卵巢、输卵管、子宫；睾丸、附睾、输精 管。 胸腔：肺、心脏。 颈部：甲状腺。 头部：开颅取脑。 • 要求：辨识各个器官，观察正常大小、形状、色泽、 表面形态。
近交系小鼠皮肤移植试验
• 2、自体尾-尾植皮法
• （1）麻醉 固定 • （2）上一供体小鼠尾背部创面的下方取皮片 （0.5cm×0.5cm） • （3）旋转180〫覆盖在创面上 ， • （4）1～3周后观察
家畜繁殖学实验指导(2014.3.20)
实验一、人工授精器械的认识与假阴道的安装一、目的和要求1．熟悉人工授精所用的采精和输精器械，了解其用途及使用方法。
2．练习安装假阴道。
二、材料和仪器设备〔一〕采精器材牛羊猪马的采精用假阴道，牛羊电刺激采精棒，猪手握法采精用的橡胶手套〔二〕输精器材牛羊猪马输精器，阴道开张器，额灯和手电筒〔三〕辅助器材高压灭菌器，酒精灯，长柄钳，镊子，玻璃棒，棒状温度计〔四〕药品灭菌凡士林，75％和95％酒精棉球，滑石粉，来苏儿，洗衣粉三、方法和步骤先由老师讲解人工授精器材的构造、各部分名称和用途，并作假阴道安装的示范。
然后学生分组观察并作假阴道的安装练习。
〔一〕人工授精器材的认识1．假阴道为长筒状，由外壳、内胎和集精杯〔管〕三个主要部分组成。
其粗细和长短因畜种而异，不同国家不同时期的设计形式也不尽相同。
〔1〕外壳牛、羊和猪的假阴道外壳一般为硬橡胶或塑料制成的圆筒，中部装有可吹气、注水和排水的开关。
猪用假阴道则在此处连接一个可向假阴道内打气的双链球，以调节压力。
马的假阴道的外壳由镀锌铁皮或金属制成，分头、颈和体三部分。
筒体的中部装有把柄，其侧面有吹气和注水、排水孔，并有封闭塞或橡胶带。
〔2〕内胎由优质橡胶制成的胶筒，目前有些国家将其内胎面制成粗糙面，以增强采精时对阴茎的刺激，利于采精。
〔3〕集精杯〔管〕牛、羊用双层的棕色集精杯〔苏式〕或有刻度的离心管〔美式〕。
马用黑色橡皮杯〔苏式〕。
猪用棕色有刻度的广口瓶。
当用手握法对公猪进行采精时，只需备一只乳胶手套和收集精液的容器即可。
集精杯〔管〕可借橡皮圈直接固定于假阴道的一端或借橡胶漏斗与假阴道连接。
2．输精器苏式牛、羊输精器为一长颈玻璃注射器。
目前常用的为金属或塑料制成的输精管，其后连接一个橡皮球。
冷冻细管精液输精则使用金属制成的输精枪。
对牛羊等家畜的输精需借助阴道开张器和额灯或手电筒照明进行。
开张器的种类和大小因畜种而异。
〔二〕假阴道的准备1．假阴道外壳及内胎的检查〔1〕检查假阴道外壳两端是否光滑，外壳有否裂隙或开焊之处〔特别是马用外壳〕。
试验六1、小鼠采精方法的研究
实验六、小鼠采精方法中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVEMEDICINE2005年4月第15卷第2期April, 2005 Vol.15 No。
2郑新民,李聚学，魏雁，乔宪凤,周荆荣（湖北省农科院生物技术研究所，武汉430072小鼠是世界上研究最为详尽的哺乳类动物［1］.但是目前人们仍然是通过手术法从小鼠附睾中获取精子，国内外尚无小鼠非手术法采精的报道.手术法采精为众多的科学研究带来了不便：（1)手术法采精必须将雄鼠处死，分离其附睾和输精管来获取精子,过程繁琐，费时费工,且造成不必要的经济浪费［2]。
另外，从附睾中获取的精子由于缺少副性腺中的诸多有益成分，精子品质难以保证[3];（2）不利于小鼠生殖生理的研究,在医学上,人们都是通过“杀鸡取卵”式地宰杀大量的雄鼠来获取精子进行科研分析[4-6],不但造成了很大的经济浪费，而且增加了实验的误差和难度;(3)不利于某些动物模型的建立,例如，由于小鼠精子获取繁琐，人工授精技术不易建立，精子载体转基因技术尚无理想的动物模型,这极不利于该项研究的开展［7］。
由此可见,建立一种方便快速的小鼠非手术法采精技术对解决小鼠手术法采精中存在的问题、小鼠生殖生理的研究和建立某些小鼠动物模型都是很有意义的。
1 材料和方法1。
1 实验动物SPF级昆明小白鼠雄鼠,购自湖北省预防医学科学院。
合格证号为：SYXK(鄂）20035853。
1.2 小鼠假阴道抽吸器的制备小鼠假阴道的制作：取一段长约2 cm,内径8 mm的软质透明塑料管,在其内侧套上一层厚度约0.1 mm的胶膜,胶膜要求透明且有良好的弹性。
在塑料管中部钻一直径为2 mm的小孔,将一外径与小孔相当的硬质插管插入小孔中，深度与塑料管管壁厚度相当,小孔周围用强力胶水密封,向小管中轻轻吹入空气即可将塑料管内侧胶膜充起。
将制好的小鼠假阴道与胶头吸管相连,小鼠假阴道抽吸器即制作完毕。
1.3 电刺激采精仪的制备电刺激采精仪由电刺激发生器和直肠探子两部分组成。
121140066 许克波 小鼠输精管结扎
小鼠输精管结扎及小鼠各时期精子形态观察
121140066 许克波 253
一、实验目的
1、学习小鼠结扎方法；
2、学习雄性小鼠生殖系统特点；
3、观察小鼠生殖系统各部位的精子形态特点；
二、实验原理
断颈法处死小鼠：
小鼠不能用毁髓法处死，最简单的方法便是断颈法对小鼠进行处死。
先给小鼠一个抓着物，然后左手捏住小鼠颈部毛皮并轻摁在桌面上，右手拉住小鼠尾巴后三分之一处向上30度左右使劲一拉，将小鼠颈椎拉断就可以了。
这样处死小鼠可以让小鼠在痛苦最小的情况下死去，是符合动物福利学的一种实验方法。
三、实验动物及器材
雄性小鼠；
基本解剖器械、注射器、显微镜、生理盐水等；
四、实验操作
1、处死小鼠；（我做的）
2、解剖小鼠并找到小鼠生殖系统；
3、输精管结扎；（每人做一边）
4、取精观察；（合作）
五、实验结果
实验中观察到的生殖系统结构：
睾丸内精子图片：
输精管内精子图片：
六、分析及讨论
我们只在睾丸和输精管内取出了精子，但是由于附睾的头、体、尾、三部分过小，而且不能切开取精，注射器也没能吸出来，所以没能观察到附睾内的精子形态。
输精管结扎的方法
输精管结扎的方法输精管结扎是一种常见的绝育手术，用于男性不再生育的目的。
下面我将详细介绍输精管结扎的方法。
输精管结扎是通过手术将男性的输精管结扎起来，以阻止精子的通路，从而达到不再生育的效果。
传统的输精管结扎手术是通过一种所谓的“直视手术”来进行的。
即医生使用显微镜帮助定位和结扎输精管。
手术通常在局部麻醉下进行，并且需要进行小切口。
然后，医生将输精管暴露出来，并进行结扎。
剪切输精管并结扎管腔的两端，通常使用可降解的线来结扎，以防止再通。
手术进行得当的话，男性液中的精子将无法从输精管里通过。
传统的输精管结扎手术虽然是一种安全有效的方法，但存在一些风险和不便之处。
手术需要一定的恢复期，通常需要几天到一周的时间。
术后可能会出现一些轻度的不适感，如疼痛、肿胀和淤血等。
此外，手术后可能还需要避免过量活动，以免影响愈合和恢复。
然而，在近年来，还出现了一些更为现代化的输精管结扎方法，如微创输精管结扎术和阻塞法。
微创输精管结扎术是利用微创手术技术进行的，采用针刺方式将输精管结扎起来，无需进行割裂和结扎。
这种方法更为简便，术后恢复期短，风险也较传统方法小。
阻塞法是通过入选可降解的植入物到输精管内，使输精管被封闭。
这种方法既方便又安全，不需要进行手术，也无需进行切口和结扎。
无论使用哪种方法，输精管结扎都是一种永久性的绝育手术，因为输精管的结扎通常是不可逆转的。
因此，在决定进行输精管结扎手术之前，男性应该充分考虑自己是否确实不再生育，并在医生的指导下做出决定。
此外，还应该了解手术的风险、恢复时间等因素。
如果男性有意后悔，想要恢复生育能力，那么输精管结扎的逆转手术是存在的，但效果和成功率并不高。
综上所述，输精管结扎是一种常见的绝育手术，用于男性不再生育的目的。
传统的输精管结扎手术是通过直视手术进行的，而现代化的方法如微创输精管结扎术和阻塞法则更为方便和安全。
无论使用哪种方法，男性在做决定之前都应该充分了解手术的细节和风险，并在医生的指导下进行决策。
小鼠胆总管结扎实验报告
小鼠胆总管结扎实验报告一、引言胆总管是将胆汁从肝脏运输到小肠的管道，它在胆汁的合成和排泄中起着重要的作用。
为了研究胆总管的功能以及其在胆汁形成和排泄中的作用，科学家们开展了胆总管结扎实验。
本实验旨在通过结扎小鼠的胆总管，观察胆汁的合成和排泄是否受到影响，进而探究胆总管在胆汁循环中的作用。
二、实验方法1. 实验动物：选取健康的小鼠作为实验对象，确保它们的年龄和体重相似。
2. 麻醉：使用适量的麻醉剂将小鼠麻醉，确保其不会感到疼痛。
3. 手术操作：在麻醉状态下，将小鼠固定在手术台上。
通过腹部切口找到胆总管，使用微创技术将其结扎。
4. 术后护理：术后将小鼠放置在温暖、干燥的环境中，观察其恢复情况，并提供适量的食物和水。
三、实验结果通过实验观察发现，结扎小鼠的胆总管后，其胆汁的排泄量明显减少。
此外，胆汁中的胆固醇和胆盐的含量也出现了明显的下降。
这表明胆总管在胆汁的合成和排泄中起着重要的作用。
四、实验讨论1. 胆总管结扎后胆汁排泄减少的原因：胆总管结扎后，胆汁无法正常流入小肠，导致胆汁排泄量减少。
此外，结扎后可能会影响胆固醇和胆盐的合成和排泄，进一步降低胆汁的排泄量。
2. 胆总管结扎对小鼠的影响：胆总管结扎可能会导致小鼠的食欲下降，消化不良等问题。
此外，胆总管结扎还可能影响小鼠体内营养物质的吸收和代谢。
3. 胆总管在胆汁循环中的作用：胆总管在胆汁循环中起着重要的作用。
它将肝脏合成的胆汁运输到小肠，帮助消化和吸收脂肪。
同时，胆总管还起到排泄废物和代谢产物的作用，维持体内的代谢平衡。
五、实验结论通过胆总管结扎实验，我们观察到胆汁的合成和排泄受到了明显的影响。
胆总管在胆汁循环中起着重要的作用，对于胆汁的合成、排泄以及脂肪消化和吸收具有重要的调节作用。
该实验结果对于深入理解胆总管的功能和胆汁循环的机制具有重要的意义。
六、实验的局限性本实验使用小鼠作为实验对象，其生理特征与人类并不完全相同，因此实验结果可能存在一定的局限性。
输精管结扎术
输精管结扎术输精管结扎术是一种男性的永久性节育措施，通过输精管切断、结扎，或采用电凝、栓堵、化学药物等闭塞输精管的内脏，从而阻断了精子的输出而达到避孕的目的。
适应于已婚男性要求作绝育者；因某些遗传病不宜生育者；有绝育要求。
于鞘膜积液、腹股沟疝或精索静脉曲张手术时，可同时做输精管结扎术。
概述输精管结扎术是输精管绝育术的一种。
输精管比较表浅，通过皮肤可将其固定。
然后在阴囊两侧，血管稀疏的部位作浸润麻醉；切开皮肤，提出并游离输精管，在稍远离附睾处剪断，切除约0.8厘米，分别结扎两断端，并包埋；检查无出血，再缝合皮肤。
该手术简便、安全，只要严格遵照无菌操作技术及手术规程，仔细认真地进行，并发症极少发生；一旦发生，若能及时发现，给予适当处理也能得到妥善解决。
并发症及预防手术前后对照图常见的并发症有出血、感染、痛性结节及附睾郁积症等。
这些并发症的发生有其共性的因素，若能作好以下几方面的工作，在很大程度上可以预防其发生。
（1）严格掌握手术的适应证与禁忌证；①凡有凝血障碍或出血倾向者不应施行手术，以免发生出血或血肿。
②有生殖道慢性炎症者应先治愈后再手术，以减少术后感染的发生。
（2）作好术前清洁工作及手术野皮肤消毒；术中严格无菌操作，可有效地降低感染率及因感染引起的组织粘连等后果。
（3）熟悉阴囊、睾丸局部解剖。
如在阴囊、精索等处有丰富的静脉丛，且局部组织疏松，术中损伤血管或止血不彻底均可引起出血、血肿，且易继发感染。
手术操作要仔细、轻柔，减少过多组织损伤或出血。
输精管剥离及切除的长度要适当，结扎时勿带入其它组织，结扎线的松紧、粗细要适度，少留线头，以利于减少局部组织的反应及发生粘连。
在结扎近附睾端的输精管时要留出一段距离，以容贮辇网液及附星液。
（4）术后至少卧床休息2小时，2周内应避免重体力劳动、剧烈运动或性生活。
术前准备受术者的准备固定输精管1、手术前应由专业人员向受术者及其家属详细介绍输精管绝育术的原理，各种绝育方法的特点，同时也应介绍手术可能发生的并发症及防治办法，以及受术者应注意的事项。
小鼠的非手术法采精
动物学报 50(4):657-661,2004A cta Zoologica S i nica 2003210223收稿,2004203218接受 3国家“863”计划项目(No.2001AA216071)[The research was funded by a grant from “863”in HAAS (No.2001AA216071)]33通讯作者(Corresponding author ). E 2mail :zhengmail @mail 1china 1com ,lijuxue1118@sina 1com ν2003动物学报Acta Zoologica Si nica小鼠的非手术法采精3李聚学1 郑新民233 乔宪凤2 周荆荣2 魏庆信2 曹斌云111西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌71210021湖北省农业科学院生物技术研究所,武汉430064摘 要 用徒手法、假阴道抽吸法和电刺激法进行小鼠非手术法采精探索,结果表明:假阴道抽吸法和电刺激法可采出精子,两者采精成功率、平均精子量和精子活率均差异不显著;小鼠不同射精阶段的精子含量不同,其中精子主要集中在射精的第二阶段和第三阶段;假阴道抽吸法和电刺激法对小鼠首次采精后,用同样的方法对相应的小鼠重复采精,成功率、平均精子量和精子活率与首次采精相比差异均不显著[动物学报50(4):657-661,2004]。
关键词 小鼠 非手术法采精 总精子数 精子活率A method of mouse artif icial spermiation 3L I J u 2Xue 1,ZHEN G Xin 2Min 233,Q IAO Xian 2Feng 2,ZHOU Jing 2Rong 2,WEI Qing 2Xin 2,CAO Bin 2Yun 111College of Animal Science and Technology ,Northweastern Agriculture University ,Y angling ,Shanxi 712100,China ;21Biotechnology Institute ,Hubei Academy of Agriculture Sciences ,Wuhan 430064,ChinaAbstract Mouse artificial spermiation was studied by hand massage with artificial vagina and electrostimulation.The re 2sults show that artificial vagina and electro 2stimulation are achievable.The s permiation rate ,average spermatozoa quantity and motility did not differ significantly between artificial vagina and electrostimulation.The s permatozoa quantity was dif 2ferent in each s permiation stage.The greatest quantity was in the second and third stage [Acta Zoologica S inica 50(4):657-661,2004].K ey w ords Mouse ,Artificial s permiation ,Electros permiation 小鼠在分类学上属于哺乳纲、啮齿目、鼠科、小鼠属,来源于野生小家鼠。
小鼠胆管结扎手术操作PPT课件
10. 3%碘酒棉球
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手术操作
1. 使用10%水合氯醛将小鼠麻醉后，腹部备皮。 2. 将小鼠固定于操作板上，使用75%酒精棉球消毒术部。
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3. 沿腹中线开口，暴露肝脏下缘及十二指肠部位。
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4. 使用湿棉签将肝叶上翻至隔区，将十二指肠推至下腹 部，充分暴露肝门。找到胆总管。
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5. 使用弯镊轻捏胆总管，手腕着力，将胆总管分离。
① 方法简单 ② 形成周期短 ③ 肝纤维化稳定可靠 ④ 没有对动物和人有毒物的物质接触
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术部解剖
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图片源于JOVE
术部解剖
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术部解剖
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图片源于丁香园
模型建立方法
物品准备 手术操作
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物品准备
1. 眼科剪
2. 眼科镊
3. 持针器 4. 4-0缝合线（带针） 5. 5-0缝合线（不带针） 6. 10%水合氯醛 7. 一次性注射器 8. 棉签 9. 75%酒精棉球
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6. 将5-0缝合线穿过胆总管并打结。
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7. 为保证操作，一般在胆总管上打两个结。
.ห้องสมุดไป่ตู้
8. 缝合伤口，并使用3%碘酒棉球与75%酒精棉球消毒术部 。
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9. 将动物放至保温毯上保温待动物苏醒后放入饲养盒内 ，给予水料。
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成模可见
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成模可见
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意义
肝纤维化发生在人类身上是一个世界性的临床问题。
22模型建立的优点模型建立的优点方法简单方法简单形成周期短形成周期短肝纤维化稳定可靠肝纤维化稳定可靠没有对动物和人有毒物的物质接触没有对动物和人有毒物的物质接触33术部解剖术部解剖图片源于jove44术部解剖术部解剖55术部解剖术部解剖图片源于丁香园66模型建立方法模型建立方法物品准备物品准备手术操作手术操作77物品准备物品准备眼科剪眼科剪眼科镊眼科镊4400缝合线带针缝合线带针5500缝合线不带针缝合线不带针1010水合氯醛水合氯醛一次性注射器一次性注射器棉签棉签7575酒精棉球酒精棉球10
转基因小鼠的制备
转基因小鼠的制备显微注射法这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。
处理后与可育雄鼠交配。
次日从输卵管内收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。
也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠内脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。
表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。
亦可取胚胎进行分析。
显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。
我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。
基因打靶与基因剔除技术ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的内胚团（inner cell mass）中分离出来的。
它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。
这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。
因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。
正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。
家畜繁殖学实验指导(2014.3.20)
实验一、人工授精器械的认识与假阴道的安装一、目的和要求1．熟悉人工授精所用的采精和输精器械，了解其用途及使用方法。
2．练习安装假阴道。
二、材料和仪器设备（一）采精器材牛羊猪马的采精用假阴道，牛羊电刺激采精棒，猪手握法采精用的橡胶手套（二）输精器材牛羊猪马输精器，阴道开张器，额灯和手电筒（三）辅助器材高压灭菌器，酒精灯，长柄钳，镊子，玻璃棒，棒状温度计（四）药品灭菌凡士林，75％和95％酒精棉球，滑石粉，来苏儿，洗衣粉三、方法和步骤先由老师讲解人工授精器材的构造、各部分名称和用途，并作假阴道安装的示范。
然后学生分组观察并作假阴道的安装练习。
（一）人工授精器材的认识1．假阴道为长筒状，由外壳、内胎和集精杯（管）三个主要部分组成。
其粗细和长短因畜种而异，不同国家不同时期的设计形式也不尽相同。
（1）外壳牛、羊和猪的假阴道外壳一般为硬橡胶或塑料制成的圆筒，中部装有可吹气、注水和排水的开关。
猪用假阴道则在此处连接一个可向假阴道内打气的双链球，以调节压力。
马的假阴道的外壳由镀锌铁皮或金属制成，分头、颈和体三部分。
筒体的中部装有把柄，其侧面有吹气和注水、排水孔，并有封闭塞或橡胶带。
（2）内胎由优质橡胶制成的胶筒，目前有些国家将其内胎面制成粗糙面，以增强采精时对阴茎的刺激，利于采精。
（3）集精杯（管）牛、羊用双层的棕色集精杯（苏式）或有刻度的离心管（美式）。
马用黑色橡皮杯（苏式）。
猪用棕色有刻度的广口瓶。
当用手握法对公猪进行采精时，只需备一只乳胶手套和收集精液的容器即可。
集精杯（管）可借橡皮圈直接固定于假阴道的一端或借橡胶漏斗与假阴道连接。
2．输精器苏式牛、羊输精器为一长颈玻璃注射器。
目前常用的为金属或塑料制成的输精管，其后连接一个橡皮球。
冷冻细管精液输精则使用金属制成的输精枪。
对牛羊等家畜的输精需借助阴道开张器和额灯或手电筒照明进行。
开张器的种类和大小因畜种而异。
（二）假阴道的准备1．假阴道外壳及内胎的检查（1）检查假阴道外壳两端是否光滑，外壳有否裂隙或开焊之处（特别是马用外壳）。
输精管结扎术
输精管结扎术：通过结扎阻断精子的输送通道，使精子淤积于坠睾尾部，以后液化吸收。
女性输卵管结扎术：用手术把输卵管切断并结扎，结扎以后，精子和卵子不能相遇，达到永久避孕的目的。
所谓的结扎就是将男人的输精管扎死断开，女人将输卵管扎死断开，使得男人的精子不能排出体外，女人的卵子不能进入子宫，这样就可以不让精子和卵子相遇，女人也就不能怀孕了，一对夫妻之需要其中一个人采取结扎措施，即男人结扎输精管或者女人结扎输卵管就可以实现绝育目的了。
理论上说，被结扎的输精管或是输卵管还可以修复接通。
男性绝育手术现象男性输精管结扎是将输送精子的输精管切断结扎，使睾丸产生的精子无法通过输精管排出，从而达到绝育的目的。
但并没有损伤睾丸，睾丸的曲细精管和间质细胞仍然能继续产生精子和分泌性激素，以维持男子正常的性功能，并保持男子的第二性征。
所以，男性不用担心输精管结扎后会丧失性能力。
相反的，有些男子在绝育手术前因担心女方会怀孕，同房时提心吊胆，性能力发挥木好。
而施行绝育术后，思想负担没有了，性欲望反而比过去更强烈，部分男性体质变弱，无法承担大的体力活动。
男性输精管结扎后创伤有不可修复性。
女性手术避孕主要是输卵管绝育术，它通过切断、结扎、电凝、钳夹、环套输卵管或用药物粘堵、栓堵输卵管管腔，使精子与卵子不能相遇而达到绝育目的。
这是一种安全、永久性节育措施，可逆性高，要求复孕妇女行输卵管吻合术的成功率达80%上。
女性结扎是一种以永久绝育为目的的手术。
一般来讲，如果操作没有失误，是很安全有效的，不会对身体有什么大的危害的。
结扎前，医生会对你的生殖系统做必要的检查，如果没有病变，医生是不会切除你的子宫的。
女性做结扎其实是很简单的小手术，无非就是在小肚子上划开一个3厘米的切口，逐层切开腹壁，分别提出左、右输卵管，结扎后放回腹腔，最后缝合切口。
手术15-20分钟就可搞定，出血很少，恢复很快的。
以后肚子上会有一道很短的疤而已。
发生后遗症的比例是很低的。
输精管绝育术(计划生育技术服务操作规范和诊疗指南培训班讲稿)
男性绝育在发达地区和国家被广泛选择， 北美和大洋洲及北欧的现用率分别为12%和 11%，在加拿大的应用最为广泛，22%的育 龄妇女依赖男性绝育，占所有现代避孕方 法的31%。英国、新西兰、韩国男性绝育的 现用率在17%～21%，占现代避孕方法的 24%～27%。输精管绝育在澳大利亚、比利 时、不丹、丹麦、西班牙、瑞士和美国也 是一种重要的选择，现用率为8%～12%
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2. 钳穿法输精管结扎术 局麻下用三指法固定输精管，用闭合的分离钳 由局麻针孔刺入直至靠近输精管，用分离钳平 行分离并扩大裂口至0.5 cm左右，输精管皮内 固定钳由此裂口伸入，夹持并提出输精管，纵 形切开输精管被膜直达管腔，用输精管提钩提 出输精管结扎，分离钳提起精索筋膜，使附睾 端输精管退缩到筋膜内，精囊端输精管残端固 定于精索筋膜外
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㈣ 器械准备 1. 与手术方法相应的专用器械 2. 阴囊切开止血器械作备用 3. 手术孔巾应为双层棉布（长80cm，宽 60cm，孔径6 cm） 4. 各种器械、布类、敷料、结扎线以及手 套等的消毒应严格按照操作规程完成
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㈠ 输精管结扎术
输精管结扎术是应用最为普遍的输精管绝 育技术。在过去50年中，为了提高手术成 功率，减少并发症和简化手术过程，国内 外，尤其是我国作了许多创造性的改进， 并根据手术器械、入路部位及方式、输精 管提取及残端处理技术等的不同而启用了 相应的手术名称。在我国常用的输精管结 扎术有5种
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㈢ 受术者准备 1. 阴部备皮。受术者坚持不同意剃去阴毛 时，可保留阴茎背侧下腹部阴毛，但阴囊 部应予以剃净 2. 用肥皂、流动温水清洗阴囊、阴茎、下 腹部及会阴，穿着清洁内裤。为了减轻消 毒剂对皮肤的刺激，尤其是冬天，可提前 一天剃去阴毛 3. 术前排尿 4. 对采用普鲁卡因麻醉者，术前应作皮试
小鼠输精管结扎和简单精子操作
输精管结扎
术后处理
• 术后小鼠放回鼠笼 • 用50 W白炽灯加热，以维持体温。 • 小鼠苏醒后放回饲养间
精子操作
取精
• 断颈处死小鼠
• 开腹，取出睾丸、附睾和输卵管，放在载 玻片上 • 在解剖镜下观察结构 • 用注射器吸取0.1 ml生理盐水
• 用注射器针尖挑开附睾尾，用解剖针或镊 子轻压附睾尾 • 用注射器吸取精液，注入凹玻片
精子操作
挑单精子
• 用10倍镜观察精子活力 注意镜头不要沾水，用40倍镜时应加盖片 或取一滴在载片上，盖上盖片观察 • 组装口吸管
• 用口吸管吸取单个精子，放入另一个凹处 （先加一点生理盐水） 能否连续取出10个精子？分别放入凹片？
整理器材
• 手术器材和凹片洗净，放在来苏儿水盆中 消毒，放回原处 • 清理杂物，收拾台面
输精管结扎
麻醉
麻醉方法1： 拇指和食指捏住小鼠头部皮肤，小鼠背靠手掌，将尾 巴固定在小指和无名指缝中，此时小鼠牢固被固定 在左手中。使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部，右手 持注射器将针头在下腹部沿髂骨上缘水平、靠近腹 白线的两恻进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3mm左 右，接着使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿 过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后 抵抗感消失。固定针头，保持针尖不动，回抽针栓， 如无回血、肠液和尿液后即 可缓缓注射药液。注射 量为0.1-0.2ml/10g体重。
作业
• • • • 雄性小鼠外观特点 你选用的结扎方法、效果 附睾和输精管的形态 口吸管使用效果 注意写明你在小组实验中亲手操作了那些 步骤
输精管结扎
麻醉方法2： • 用浸润乙醚的棉球或纱布放在密闭的容器内， 再将动物放入，并注意动物的行为。开始时动 物出现兴奋，进 而出现抑制，自行倒下，当 动物角膜反射迟钝、肌紧张降低，即可取出动 物。若动物逐渐开始恢复肌紧张（重新挣扎） 则重复麻醉一次，待平静后即可进行实验。若 实验时间长，可先保定动物在实验台上，将乙 醚棉球或纱布靠近其鼻部，即可开始实验。实 验过程中，应注意动物的反应，适时追加乙醚 吸入量，维持其麻醉深度和 时间。
小鼠体外受精标准化程序
小鼠体外受精标准化程序雌鼠（8－10周龄）体外促排卵:1.4点左右腹腔注射尿促性素针剂(10U/只),；2.48hr后腹腔注射绒促性素针剂(10U/只);培养液预平衡: 雌鼠注射绒促的当天，准备如下液体1.Quinn’s 1023（HEPES-HTF培养基）：使用时添加10％SPS，共5ml；2.Quinn’s 1020：使用时添加10％SPS，共5ml；3.Quinn’s 1026：使用时添加10％SPS，共2ml；以上液体配置后，HEPES-HTF培养基需要拧紧离心管口，Quinn’s 1020与Quinn’s 1026则半旋口，均放置于CO2培养箱内，孵育过夜。
卵子的获得：1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1020做四个微滴的三个培养皿，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用；2. 于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中；3. 用颈椎脱臼法处死促排卵雌鼠，取其卵巢及输卵管于上述平皿中；4. 在解剖显微镜下，用1ml空针剖开小鼠输卵管的壶腹部，即见粘附有大量颗粒细胞的卵子粘液团流出，用拉过的巴斯德吸管吸取置于预先孵育的10％SPS Quinn’s 1020微滴中；5. 反复冲洗2-3次后，将卵子转入新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微滴中孵育。
精子的获得：1.于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中；2.用颈椎脱臼法处死雄鼠，取其附睾上体尾部，除去脂肪与血迹后，置于上述平皿中；3.在解剖显微镜下，用1ml空针剖开附睾上体尾部，稍加震荡后即见成团精子游出；4.用拉过的巴斯德吸管吸取后轻轻加入到含2ml 10％SPS Quinn’s1020液的离心管底部，放入CO2培养箱内使精子上游15-25min；5.吸取上游液于另一离心管中，室温3000rpm离心15min；6.小心吸取沉淀，加入到另一含1ml 10％SPS Quinn’s 1020液的圆底管中，混匀，置于CO2培养箱内备用。
小鼠输精管结扎和简单精子操作
输精管结扎
麻醉方法2： • 用浸润乙醚的棉球或纱布放在密闭的容器内， 再将动物放入，并注意动物的行为。开始时动 物出现兴奋，进 而出现抑制，自行倒下，当 动物角膜反射迟钝、肌紧张降低，即可取出动 物。若动物逐渐开始恢复肌紧张（重新挣扎） 则重复麻醉一次，待平静后即可进行实验。若 实验时间长，可先保定动物在实验台上，将乙 醚棉球或纱布靠近其鼻部，即可开始实验。实 验过程中，应注意动物的反应，适时追加乙醚 吸入量，维持其麻醉深度和 时间。
输精管结扎
消毒
• • • • •
将小鼠腹面向上放在手术蜡盘上 用细绳将小鼠四肢固定在蜡盘上 用70%酒精擦拭小鼠腹部 用棉花擦干 剪去腹部被毛（可不做）
输精管结扎
腹部横切法
• 在下肢上端水平线正中用剪刀横向剪开1.5 cm，同样剪开腹壁。用缝皮针缝住腹壁切 口边缘 • 用眼科镊斜向下 方夹住一侧的脂 肪垫将睾丸、附 睾和输精管拉出 切口
输精管结扎
腹部横切法
• 钝性分离输精管约1 cm • 用眼科剪在两侧剪断 • 夹住脂肪垫将睾丸放回 腹腔 • 同上处理另一侧 • 缝合腹壁 • 缝合皮肤
输精管结扎
阴囊纵切法
• 轻压腹腔，将睾丸 推回阴囊 • 沿阴囊正中线开口 1 cm • 确定白色的阴囊壁 中线
输精管结扎
阴囊纵切法
• 在中线左侧的阴囊包膜上 切开5 mm • 向左推睾丸，找到输 精管，夹出切口 • 剪断1 cm • 处理右侧睾丸 • 缝合切口
输精管结扎
麻醉
麻醉方法1： 拇指和食指捏住小鼠头皮肤，小鼠背靠手掌，将尾 巴固定在小指和无名指缝中，此时小鼠牢固被固定 在左手中。使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部，右手 持注射器将针头在下腹部沿髂骨上缘水平、靠近腹 白线的两恻进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3mm左 右，接着使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿 过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后 抵抗感消失。固定针头，保持针尖不动，回抽针栓， 如无回血、肠液和尿液后即 可缓缓注射药液。注射 量为0.1-0.2ml/10g体重。
实验一 精子的制片、活力及密度测定
实验一精子的制片、活力及密度测定一目的1. 掌握小鼠精子的制片方法。
2.了解评定精液品质的方法。
3. 掌握精子活力的估测方法及血球计数器进行精子密度测定的方法。
二小鼠精子制片及观察1.仪器和试剂眼科手术剪、镊子、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管、载玻片、盖玻片、生理盐水、甲醇（分析纯）、2%伊红溶液2.动物选择成熟的大鼠、小鼠均可使用。
一般采用雄性小鼠，年龄6-8周。
3.制片用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml 的生理盐水平皿中，以眼科剪将附睾剪成小块，用吸管将悬液轻轻吹打5-6次，静置3-5分钟，用四层擦镜纸滤除组织碎片，制得精子悬液。
左手食指和拇指向上捏住载玻片两端，使载玻片处于水平状态，取此精子悬液滴至载玻片右侧。
右手拿一载玻片或盖玻片，使其与左手拿的载玻片呈向右的45度角，并使其接触面在精液滴的左侧。
将载玻片向右拉至精液刚好进入两载玻片形成的角缝中，然后平稳地推至左边（不得再向回拉），做成精液抹片。
必须注意精液抹片不要太厚，同时要防止用力过大而造成人为的畸形精子数增多。
抹片后，使其自然风干。
晾干后用甲醇固定5分钟，干燥后即可镜检。
也可用2%的伊红溶液染色1-2小时后再做镜检。
三精液品质检查(一) 直观检查1. 精液量：将采得的精液倒在有刻度的试管或杯中，测其容量。
各种常用实验动物的射精量平均为：大鼠0.05～0.2毫升，豚鼠0.4～0.8毫升，兔0.4～6.0毫升，犬2.0～15.0毫升。
2. 观察精液的色泽并嗅闻气味。
色泽：正常精液一般为乳白色或白色，密度越高，乳白色程度越浓，其透明度也越低。
其它颜色均为不正常颜色。
气味：一般为无味或略带腥味。
3.精液的云雾状翻腾滚动。
云雾状显著者以“＋＋＋”表示，有云雾状以“＋＋”表示，云雾状不明显者以“＋”表示。
(二)精子活力检查精子的活动有三种类型：前进运动、旋转运动和振摆运动，评价精子活力是根据精液中呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分率。
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小鼠输精管结扎和简单精子操作
121140052 王哲迪 174
一、实验目的
1、掌握小鼠手术的基本技巧
2、学习雄性小鼠生殖系统特点
3、练习显微操作技术
二、实验结果及分析
1、以腹部横切法剪开小鼠腹壁后，用镊子夹住脂肪垫将睾丸、附
睾和输精管拉出切口。
实验时我们将下面图片中镊子夹着的地方剪掉了1cm。
但是
在仔细观察过右边这个图后发现，我们错把附睾体当做了输精管。
我们剪掉的是附睾体，而不是输精管。
2、下面这张图片是小鼠腹壁缝合后的照片。
我们采取了方洁的打结方式。
在将睾丸放回腹腔的过程中，发现不管怎么推，都不能把睾丸推回阴囊，这给缝合带来了一定的难度。
缝合腹壁时一定要小心，因为缝合针很容易扎到皮肤和腹腔内的脏器。
3、下图为皮肤缝合后的照片，同样采用的是方结的打结方式。
皮肤相对于腹壁而言较容易缝合。
4、下图为在解剖镜下观察得到的照片。
可能由于角度问题，这张图片上只能分辨出脂肪体和睾丸，并不能看到附睾体和输精管。
取出睾丸时的操作也存在问题，并没有注意到输精管在哪里。
上面剪切输精管时也没有找对输精管，所以实验失败在没有观察到输精管。
脂肪体
睾丸
4、下图为在显微镜下观察精子得到的照片。
正如细线所指的，图中有着尖尖的头部和一条细长的尾巴的就是精子。
由于载玻片上有一些脂肪体残留的脂肪，所以在显微镜下会看到很多油花，影响精子的观察。
但是仔细看还是可以看到许多在快速无规则运动的精子。
精子
三、备注
1、本人在实验中操作的部分：
对小鼠进行断颈处理
切开腹壁
夹出睾丸、附睾和脂肪体
剪掉1cm输精管（其实剪掉的是附睾）
部分缝合操作
2、实验要求用乙醚麻醉小鼠，但是实验过程中发现用乙醚麻醉的方法并不好，小鼠经常会醒过来，而且用乙醚操作时间长了，实验人员出现头疼恶心等不适症状。
由于并不需要对小鼠进行回收，所以为了方便操作我们直接采取了断颈处理的方法。