细胞生物学实验- 细胞骨架
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Hoechst 33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大 量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射波长分别为350 nm和461 nm。
• 仪器 荧光显微镜，倒置显微镜
• 材料 原代培养的鸡胚成纤维细胞
载玻片，盖片，滴管，滤纸 • 试剂
PEM缓冲液
0.5% Triton X-100
色荧光
体等酸性细胞器
线粒体
Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光
可进入活细胞,阳离子性, 摄入快,淬灭快,无毒性
荧光显微镜
荧光显微镜
物镜
明场光源
Βιβλιοθήκη Baidu
汞灯光源
细胞骨架
• 狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括：
– 微丝（microfilament，MF，7nm） – 微管（microtubule，MT，25nm） – 中间纤维（intermediated filament，IF，10nm）
30min 37℃预温 PEM避光洗3次（1ml） 避光滴加10 L Ho.33342复染色10min 37℃预温 PEM避光洗3次（1ml）
在封口膜上滴加染液，将细胞爬片细胞面向 下孵育于染色液中。 注意盖玻片的正反面，切勿产生气泡！
在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻片被冲起 后，再轻轻揭下盖玻片。
1. 将原代培养的成纤维细胞 (或者HeLa细胞) 培养于小盖玻 片上，在含10% 胎牛血清的DMEM培养基中于37℃, 5% CO2培养 箱中培养至细胞融合度达70%～80%。 2. 取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用37℃预温 PEM轻轻漂洗3次。 3. 加入37℃预温 4%多聚甲醛固定15min 。 4. 用37℃预温PEM漂洗3次。 5. 加入0.5 % Triton X-100通透处理约10 min 6. 用37℃预温 PEM漂洗3次。
细胞骨架的荧光观察
2018.10.26
实验目的
• 了解荧光探针的基本知识 • 学习荧光显微镜的工作原理及使用方法 • 掌握细胞核和微丝骨架的标记技术
常用荧光探针
细胞参量 荧光探针 吸收/发射 nm
特性
DNA和 RNA
Propidum iodide (PI) 535/617 红色荧光
Ethidium romide (EB) 518/605 红色荧光
7. 取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一 条封口膜，在封口膜上上滴加10 μL 55 nM Alexa-568phalloidin (red)，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵 育于染色液中，于湿盒中室温避光染色30 min。 8. 小心取下盖玻片，将其置于小平皿中（细胞生长的面朝 上），用37℃预温 PEM避光漂洗3次。 9.在载玻片上分别滴加Ho.33342工作液10 μL，将盖玻片 上的细胞倒扣在载玻片上室温暗处孵育10 min。 10. 封片。 11. 荧光显微镜观察微丝（绿色荧光激发，产生红色荧 光）;核（紫外光激发，产生蓝色荧光）。
DAPI 358/461 蓝色荧光
Hoechst33342 350/461 蓝色荧光
嵌入核酸双链间,只能标记死细 胞.用于 染色体,细胞观察,分辨 死活细胞和细胞周期研究
嵌入核酸双链间,只能标记死细 胞.用于电泳分析,染色体观察
半通透细胞,结合于DNA的AT碱 基对.用于细胞周期的研究,染色 体和细胞核的观察
4% 多聚甲醛
Hoechst.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS) 55nM Alex – phalloidin （鬼笔环肽）
细胞微丝骨架和细胞核的染色
细胞培养于盖玻片上（爬片） 37℃预温 PEM洗3次（每次 1mL）) 37℃预温4%多聚甲醛固定15min（1ml） 37℃预温 PEM洗3次（每次 1mL） 0.5% Triton X-100 通透处理约10min（1ml） 37℃预温 PEM洗3次（每次 1mL） 55nM Alex -phalloidin 10L湿盒中避光室温染色
思考题
Triton X-100处理细胞的作用是什么？ 下次课：期中考核-动物细胞培养技术
结合于DNA的AT碱基对,可进入 活细胞,用于细胞周期的研究,染 色体和细胞核的观察
常用荧光探针
细胞参量 荧光探针 吸收/发射 nm
特性
蛋白和抗体 FITC 494/518 绿色荧光 的耦联探针
染死细胞,对PH值变化不 敏感
Texas red 595/615 红色 多参量细胞标记 荧光
溶酶体
Neutral red 541/640 红 探针微偏碱性,可标记溶酶
• 背景
Triton X -100: 当细胞用适当浓度的triton X -100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子去 垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧 密，不容易被去除 ，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。
鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛 素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合 的微丝结合后, 抑制了微丝的解体,会破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
• 仪器 荧光显微镜，倒置显微镜
• 材料 原代培养的鸡胚成纤维细胞
载玻片，盖片，滴管，滤纸 • 试剂
PEM缓冲液
0.5% Triton X-100
色荧光
体等酸性细胞器
线粒体
Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光
可进入活细胞,阳离子性, 摄入快,淬灭快,无毒性
荧光显微镜
荧光显微镜
物镜
明场光源
Βιβλιοθήκη Baidu
汞灯光源
细胞骨架
• 狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括：
– 微丝（microfilament，MF，7nm） – 微管（microtubule，MT，25nm） – 中间纤维（intermediated filament，IF，10nm）
30min 37℃预温 PEM避光洗3次（1ml） 避光滴加10 L Ho.33342复染色10min 37℃预温 PEM避光洗3次（1ml）
在封口膜上滴加染液，将细胞爬片细胞面向 下孵育于染色液中。 注意盖玻片的正反面，切勿产生气泡！
在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻片被冲起 后，再轻轻揭下盖玻片。
1. 将原代培养的成纤维细胞 (或者HeLa细胞) 培养于小盖玻 片上，在含10% 胎牛血清的DMEM培养基中于37℃, 5% CO2培养 箱中培养至细胞融合度达70%～80%。 2. 取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用37℃预温 PEM轻轻漂洗3次。 3. 加入37℃预温 4%多聚甲醛固定15min 。 4. 用37℃预温PEM漂洗3次。 5. 加入0.5 % Triton X-100通透处理约10 min 6. 用37℃预温 PEM漂洗3次。
细胞骨架的荧光观察
2018.10.26
实验目的
• 了解荧光探针的基本知识 • 学习荧光显微镜的工作原理及使用方法 • 掌握细胞核和微丝骨架的标记技术
常用荧光探针
细胞参量 荧光探针 吸收/发射 nm
特性
DNA和 RNA
Propidum iodide (PI) 535/617 红色荧光
Ethidium romide (EB) 518/605 红色荧光
7. 取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一 条封口膜，在封口膜上上滴加10 μL 55 nM Alexa-568phalloidin (red)，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵 育于染色液中，于湿盒中室温避光染色30 min。 8. 小心取下盖玻片，将其置于小平皿中（细胞生长的面朝 上），用37℃预温 PEM避光漂洗3次。 9.在载玻片上分别滴加Ho.33342工作液10 μL，将盖玻片 上的细胞倒扣在载玻片上室温暗处孵育10 min。 10. 封片。 11. 荧光显微镜观察微丝（绿色荧光激发，产生红色荧 光）;核（紫外光激发，产生蓝色荧光）。
DAPI 358/461 蓝色荧光
Hoechst33342 350/461 蓝色荧光
嵌入核酸双链间,只能标记死细 胞.用于 染色体,细胞观察,分辨 死活细胞和细胞周期研究
嵌入核酸双链间,只能标记死细 胞.用于电泳分析,染色体观察
半通透细胞,结合于DNA的AT碱 基对.用于细胞周期的研究,染色 体和细胞核的观察
4% 多聚甲醛
Hoechst.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS) 55nM Alex – phalloidin （鬼笔环肽）
细胞微丝骨架和细胞核的染色
细胞培养于盖玻片上（爬片） 37℃预温 PEM洗3次（每次 1mL）) 37℃预温4%多聚甲醛固定15min（1ml） 37℃预温 PEM洗3次（每次 1mL） 0.5% Triton X-100 通透处理约10min（1ml） 37℃预温 PEM洗3次（每次 1mL） 55nM Alex -phalloidin 10L湿盒中避光室温染色
思考题
Triton X-100处理细胞的作用是什么？ 下次课：期中考核-动物细胞培养技术
结合于DNA的AT碱基对,可进入 活细胞,用于细胞周期的研究,染 色体和细胞核的观察
常用荧光探针
细胞参量 荧光探针 吸收/发射 nm
特性
蛋白和抗体 FITC 494/518 绿色荧光 的耦联探针
染死细胞,对PH值变化不 敏感
Texas red 595/615 红色 多参量细胞标记 荧光
溶酶体
Neutral red 541/640 红 探针微偏碱性,可标记溶酶
• 背景
Triton X -100: 当细胞用适当浓度的triton X -100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子去 垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧 密，不容易被去除 ，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。
鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛 素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合 的微丝结合后, 抑制了微丝的解体,会破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。