荧光检测复习题参考答案

荧光检测在医学实验中的应用–复习题第一章总论荧光的发生及基本检测原理1何谓发光？分子吸收辐射被激发后以光的形式释放，辐射跃迁而衰变回到电子基态→发光2荧光与磷光的区别？荧光：激发后马上发光，第一电子激发单重态辐射跃迁；延迟10-9～10-7秒后。

基态S0→单重态S1、S2跃迁→基态。

磷光：延迟时间长，几毫秒或更长10-3～10秒电子自旋未配对进入受激三重态，三重态→跃迁→基态3完成良好荧光检测的有关条件？1）选择相应的激发波长2）选择足够强度的激发光源，荧光强度与入射光强度成正比If＝φfI0(1-It/I0)；3）选择合适(QE)的发射波长检测器件；4）控制好样品制备与检测环境体系。

4荧光的种类根据激发方式。

1）光化发光2）化学荧光3）生物荧光。

按荧光素的标记过程可分为：1）免疫荧光2）组织荧光3）诱导荧光5有哪几种荧光现象？I次荧光现象：固有或自发荧光；一经辐射就可发出荧光的物质。

II 次荧光现象及荧光色素(标记物)又称继发荧光；样品分子不能或只能发出很弱的荧光，对此类分子需先经荧光色素标记结合或插入到不发光的大分子中去，根据荧光探针的荧光分析大分子。

6影响荧光强度（If）的因素1光化分解：荧光物质吸收光能后，某些键断裂，导致荧光弱。

制片时应避光。

2荧光淬灭：（1）温度淬灭：加快震动弛豫而丧失振动能量；增加分子热运动高温荧光分子与液基环境中分子碰撞。

温度适宜或低温。

（2）浓度淬灭：浓度大时发光分子在样品中分布不均，深部的分子吸收不到光子，量子产额反而小。

生成二聚体或多聚体，改变吸收光谱，If降低。

（3）杂质淬灭：静态淬灭，杂质与荧光分子组成另一种化合物。

环境净化。

碰撞、转入三重态淬灭。

3pH影响：破坏荧光物质环链结构，芳香族化合物的酸、碱功能团对pH敏感。

7半波宽定义：最大透光度Tmax波长1/2处对应的两波长差(λ1 -λ2)也称带宽(Bandwidth),带宽窄则光色纯。

第二章荧光成像检测1光学显微镜分辨率定义及简易计算公式2影响光学显微镜分辨率的主要因素？影响分辨率的因素为衍射效应：圆斑像AIRY斑，阻碍分辨率。

3聚光镜与物镜孔径光阑的对应调节？目的：产生与物镜相应的光束，使镜像的反差和焦深处于最佳状态。

不同倍率物镜有不同的NA值，改换物镜聚光镜NA应做相应调节。

观察：与物镜NA一致(100%)，以得到较好的分辨率；照像：相当于物镜NA的60~80%,以得到较好的反差、焦深。

4光学显微镜的有效放大＝所用物镜NA值的500～1000倍5荧光量子效率（QE）荧光量子效(产)率=放射量子数／吸收量子数6医学实验中荧光检测常用的荧光检测传感器是哪两种？1转换光学信号为电子信号-光学传感器,2彩色CCD7显微镜照相术的定义?将显微镜视场中的微观图像记录为放大图像的技术8影响CCD成像效果的主要因素是什么?温度和灵敏度，CCD工作时，表面会产生热量，使得在芯片形成暗电流，暗流将增加噪音、降低信噪比、导致降低成像质量。

9 CCD成像放大倍率的计算公式显示或照片倍率＝OBJ倍率×光学适配器倍率×显示或照片对角线长度／CCD对角线长度10荧光显微镜CCD成像与激光共焦显微镜成像的比较数字CCD优点：价低，使用简便，成像块，测得FI同LSCM，彩色还原好，图像近于镜下，光化淬灭伤害小。

Ratio测钙、使用TC板，适于标本：薄、层次简单。

缺点：厚标本图像质量差，无光切功能，整合功能配置价格不菲激光共焦扫描显微镜，优点：分辨率高，光切片，3D空间立体结构观测，集成荧光分析功能。

缺点：成本高（专人、耗材），光化淬灭伤害较大11免疫荧光染色的目的将抗体标记上荧光素（如FITC、TRITC），与细胞内相应抗原（目标蛋白）结合后，通过观察、检测具有特征性的荧光，定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白12.免疫荧光染色常用方法直接法、间接法和双标记法13.影响免疫荧光染色结果的主要因素有1）荧光染料标记的抗体的浓度，2）溶液的pH值，3）溶剂14.举例说明自发荧光主要包括哪些动物中一般为黄素类和卟啉类，植物中为叶绿素容易产生自发荧光。

脂褐素的自发荧光，弹力蛋白和胶原UV激发下呈黄绿色荧光，培养死细胞很容易产生自发荧光。

15.免疫荧光染色前对细胞接种密度的要求细胞密度：根据实验目的调整细胞接种密度。

对细胞个体进行形态学观察以及定位荧光信号：细胞密度稍稀疏。

使细胞充分伸展，显示出其应有的形态和结构；但也要注意保证视野内有一定数目的细胞，以便选取有代表性的细胞采图，要求细胞所占面积不低于视野的20%。

定量测定荧光强度（观察某种蛋白的表达量）：细胞密度应稍高。

用于做大量细胞的统计定量，细胞至少要占到视野面积的80%；这时细胞要布满视野但相互之间还有空隙，细胞排列均匀，不聚堆拥挤，防止细胞间挤压变形，影响定量结果。

达到通常所说的亚融合状态。

16荧光显微镜观察免疫荧光染色需要设置的对照及意义正确设置对照组（非常必要）：1.阳性对照：已知抗原阳性的样品与待测样品同时进行免疫荧光染色，对照样品呈阳性结果，用于检验免疫荧光染色全过程是否符合要求，包括孵育温度、时间，一抗、二抗是否有问题，分析可能原因。

如果阳性对照呈阴性，则说明实验过程有问题，需要对每个条件加以分析改进。

2.阴性对照：已知抗原阴性的样品作对照，对照样品应呈阴性结果。

包括空白对照（PBS代替一抗）和替代对照（非免疫血清代替一抗），用于排除非特异性染色。

如果阴性对照呈阳性表达，同样检测样品的结果也是不可信的。

3.不染色细胞空白组：不经免疫荧光染色，直接上机观察，用于检测由于细胞本身或固定造成的细胞自发荧光。

17共聚焦扫描显微镜（LCSM）光学成像原理检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔--高分辨率的光学切片18共聚焦扫描显微镜(LSCM)与传统荧光显微镜比较的优点1）提高了敏感性及分辨率，2）扩大获取信息范围，3）实现了图像三维重建，4）客观记录荧光信息，5）同时显示多种标记物19.定义：荧光漂白恢复(FRAP)：经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被破坏,荧光强度下降,但此处荧光强度会渐渐恢复,荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速率,或分子运动速度。

20.定义：荧光共振能量转移(FRET)：受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。

能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。

第三章荧光光度检测1荧光分光光度计的构造示意图光源→激发单色器→样品杯→发射单色器→检测器→电子放大及控制→显示2微孔板荧光检测在医学实验的应用1）利用报告基因检测目标基因的表达：将报告基因引入细胞DNA 使之与某一特定分子事件相关，可以为这一分子事件带来可测性。

通常检测的分子事件是基因功能，具有可测性的是发光。

目前，市场上有许多发光报告基因出售。

包括：萤火虫荧光素酶（firefly luciferase），β－半乳糖苷酶（B-galactosidase）等。

2）ATP水平测定：所有活细胞都含有ATP。

ATP可以从细胞中提取出来，用萤火虫荧光素酶检测。

荧光强度与样品中ATP的含量成比例，相应的与提取ATP所用的细胞数成比例。

可以检测样品中的所有微生物，因而被用于检测水中的大肠杆菌含量，用于药品，化妆品，牛奶以及其它食品的微生物控制，测定土壤和沉积物中的全部活生物含量，评价抗生素对微生物生长的影响，了解不同药物对哺乳动物细胞的影响等。

3）离子测定：如细胞内钙离子测定。

3活细胞内钙离子浓度测定的方法即从测量出的荧光信号中定量地计算出钙离子浓度。

对于单波长激发或发射的荧光指示剂，可按下式计算[Ca2+]=Kd(F一Fmin)/(Fmax一F)，Kd：荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数，Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。

对于双波长的荧光指示剂，用率比值信号来计算细胞内游离Ca2+浓度，用下式计算细胞内游离Ca2+浓度，[Ca2+]=Kd(Fd/Fs)(R一Rmin)/(Rmax一R) Kd：荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数.Fd和Fs分别表示荧光剂没有结合Ca2+和被Ca2+饱和时的荧光强度.，R为实验观察到的荧光比值.Rmin为细胞内荧光剂最小量结合Ca2+时的荧光比值.，Rmax为胞内荧光剂被Ca2+饱和时的荧光比值.4 fura2指示剂测钙原理Fura2:由紫外激发的一种率测量指示剂，因有较强的亲水性，难以进入细胞，在其负性基团部位结合上亲脂的乙酰羟甲基酯成为Fura-2/AM后，与细胞温孵时很容易透过细胞膜，胞浆内的酯酶可将Fura-2/AM水解成Fura-2而滞留在胞浆内，后者与胞内游离的钙离子结合形成Fura-2-钙离子复合物。

当Fura-2与Ca2+结合后吸收峰发生改变，在最大和最小Ca2+浓度时,它的最大吸收峰分别在335nm和363nm处，在作率测量时，经常选用的波长是340nm和380nm；结合钙和游离钙形式Fura2的发射峰都是510nm，其发射光的强度与钙离子的浓度呈比例关系第四章荧光细胞激活分选、分析1简述流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理：将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光染色后由气压装置送入流动室,流动室由样品管和鞘液管组成,鞘液管充满流动的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当两者压力差达到一定程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区。

经激光束激发,产生散射光和荧光信号。

通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。

散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。

2简述流式细胞仪的构造1）流动室及液流驱动系统2）激光光源及光束成形系统3）光学系统4）信号检测与存贮、显示、分析系统5）细胞分选系统3前向角散射定义(FSC，Forward Scatter)前向角散射(FSC，Forward Scatter)：0°散射,与被测细胞的大小和面积有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞干扰。

4侧向角散射定义(SSC，Side Scatter)侧向角散射(SSC，Side Scatter)：90°散射,对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。

5试述Annexin V/PI染色应用流式细胞仪检测细胞凋亡的基本原理基本原理：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。