血友病

1血液病的分子生物学检查及其应用血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术、DNA测序技术、限制性片段长度多态性（RFLP）、转基因技术及基因芯片（DNA-chip）技术等分子生物学技术。

目前，这些技术在血液学检验领域已得到广泛应用，如应用于血液病基因分析、基因诊断、白血病分型、指导治疗、判断预后和微小留病检测等方面。

随着分子生物学技术的进一步发展，血液病的基因表达和治疗、细胞之间和细胞内的信号传导、特异的血液病基因或融合基因的检测及应用将成为当代血液分子生物学检验的主要内容和方向。

本节将介绍几种常用的血液分子生物学技术。

一、核酸分子杂交技术（—）Southern印迹杂交Southern印迹杂交（Southern blot hybridition）是一种常用的分析DNA结构的核酸分子杂交技术。

其原理是将待测的基因组DNA经限制性核酸内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，凝胶经碱处理使DNA变性，再将其从凝胶中印迹到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持体上的DNA杂交，根据探针的标记特性用相应方法显示杂交条带，对待测DNA进行分析。

（二）Northern印迹杂交Northerm印迹杂交（Northern blot hybridition）和Southern印迹杂交的过程基本相同，区别在于靶核酸是RNA而不是DNA。

待测RNA经变性及琼脂糖电泳分离后，按大小不同而相互分开，随后将其转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后用DNA或RNA探针杂交，按探针的标记特性对杂交信号进行检测，对待测RNA进行分析。

（三）核酸原位杂交以放射性或非放射性标记的DNA或RNA探针在组织、细胞及染色体上与其相关的核酸序列杂交，简称原位杂交（in situ hybridition）。

原位杂交的原理是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法，在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。

此项技术是在保持细胞，甚至单个染色体形态的情况下完成的，因此通常用于检测染色体的异常改变、肿瘤致病基因和肿瘤微小留病的检测等。

二、聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术于1985年由美国Mullis等建立。

PCR技术使体外扩增核酸片段成为可能，使人们能够在几小时内从试管中获得大量特异核酸片段。

由于核酸是生物体储存和传递遗传信息的载体，因此能够迅速获得大量特异核酸片段的PCR技术给生科学各个领域的研究手段带来了革性的变化。

该技术已经与DNA克隆、DNA 重组和DNA测序等技术一样成为血液分子生物学一项不可缺少的工具。

PCR技术的重要性在于能在体外快速、高效地从复杂DNA中特异地扩增目标DNA。

其主要优点是：①快速简便，设备要求低，一般扩增几小时即可完成。

②高度敏感，样本量极小，甚至能用单个细胞进行基因分析，大大提高了基因诊断的灵敏度和准确性。

③样品适应范围广。

④PCR产物的分析主要采用凝胶电泳的方法，大大推动了非放射性基因诊断技术的发展，便于推广。

（一）PCR技术的原理和反应过程PCR是一种在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA的复制相似。

是一种模拟天然DNA合成过程的选择性体外扩增方法。

每一次复制反应分三个步骤即：①变性（denat oration）：在加热条件下，DNA变性，螺旋解开。

②退火（annealling）：在退火条件下，引物与模板DNA结合。

③延伸（extension）：在耐热DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）4种脱氧核糖核苷三磷酸底物（dNTP）、镁离子及合适PH值的缓冲液条件下，聚合酶催化以引物为起始点的5’→3’DNA链延伸反应，把基因拷贝数由2个增至4个。

在反应的初期原来的DNA担负着起始模扳的作用，随着循环数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。

重复上述过程25~30个循环，就可把基因拷贝数以指数形式增加至上百万倍，从而达到体外扩增核酸序列的目的。

（二）PCR反应的基本条件及循环参数1．PCR反应的基本条件（1）模板模板就是将要被复制的核酸片段，包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DN A等。

传统方法提取制备的DNA样本均可直接用于PCR，如基因组DNA、cDNA，若起始材料是RNA，先通过逆转录得到第一条cDNA，再进行扩增，即所谓的逆转录PCR（RT-PCR）。

也可用细胞变性提取液直接进行扩增以及用陈旧血斑提取DNA用于扩增。

但不管标本来源如何，模板都需纯化，使其不含蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白质等。

（2）引物引物是决定PCR结果的关键，其决定PCR扩增产物的特异性和长度。

引物的合成一般是在已知序列的DNA某个区的上、下合成两个与其两股链3’端互补的寡核苷酸，一般长度为15~30bp，G＋C含量约50％。

应尽量避免数个嘌岭或嘧啶的连续排列，避免引物内部形成二级结构。

两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，避免形成“引物二聚体”。

引物浓度不宜过高，否则易形成引物二聚体，或者是容易产生非特异性产物。

目前引物大多已商品化。

（3）dNTP 即dATP、dCTP、dGTP和dTI"P。

高浓度dNTP易产生错误掺入，而浓度过低又会降低反应的产量。

通常用20~200μmol/LdNTP，不能低于10~15μmol/L。

4种三磷酸脱氧核苷的浓度必须一致，四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率。

D NTP的PH值也很重要，一般应调至8.3~8.6。

（4）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在70~75℃时具有最高的生物学活性。

在92.5℃、9 5℃、97.5℃下，酶的生物半衰期分别为130min、40min和5~6min。

在PCR反应中，变性度一般为94℃，30s，最长不超过60s，以循环30次计算，Taq DNA聚合酶可保证PCR反应的需要。

Taq DNA聚合酶是Mg2＋依赖性酶，酶的活性对Mg2＋浓度非常敏感，合适的KCl浓度和dNTP用量，有利于酶活性的发挥。

酶的用量根据扩增片段的长短及其复杂程度（G＋C 含量）不同而有所区别。

（5）扩增缓冲液标准缓冲液中，KCl用量为50mmol/L、Tris-HCl用量为10 mmol/L，在缓冲液中加入Taq DNA聚合酶稳定剂如小牛血清白蛋白、明胶、Tween20等，有助于稳定聚合酶。

（6）Mg2＋ Mg2＋浓度对反应产物的特异性及产量有显著影响。

浓度过高使反应特异性降低；使反应产物减少。

在各种单核苷酸浓度为200μmol/L时，Mg2＋浓度为1.5 mmol/L较合适。

2．PCR循环参数（1）变性度和变性时间解链不完全是导致PCR失败的一个主要原因。

一般来说，94℃ 1min可使起始模板完全变性。

（2）退火度与退火时间退火度与时间应随所用引物的Tm值及扩增片段的长短而调整。

一般说来，退火度比引物的Tm低5℃，退火时间不能少于30s，但也不能太长，否则会引起非特异性退火。

Tm=4（G＋C）＋2（A＋T），此公式仅适用于14~20个碱基的人工合成引物。

（3）延伸度与时间引物延伸度一般在72℃左右，延伸时间应根据扩增片段的长短来调节。

正常情况下，每分钟可延伸1kb的长度。

（4）循环数在其他参数已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。

事实上扩增产物的指数累积并不是无限制的。

随着循环数的增加，引物和dNTP大量消耗，酶的活性也下降，退火时模扳互补链之间的复性也逐渐增加，扩增效益下降，扩增产物从指数形式增长逐渐恢复为线性形式增长。

一般取20~30个循环数。

（三）PCR产物分析PCR产物检测方式有多种，常用的有凝胶电泳法、斑点杂交法、Southern印迹杂交法、原位杂交法、颜色互补分析法及PCR-ELISA法等。

1．琼脂糖凝胶电泳是一种简便易行的分离DNA片段的方法。

在PH值8.0时，DNA分子带负电荷，在电场中向阳极移动，其移动速率同分子大小成反比，分子越大，在凝胶孔中受到的阻力越大，相反分子越小，在凝胶中移动越快。

待分离的PCR产物中要加入溴化乙锭，在紫外灯下观察电泳条带时，溴化乙锭与DNA结合，发出棕红色的荧光。

2．Southern印迹杂交是基因诊断常用技术之一。

将琼脂糖凝胶电泳分离的PCR产物在原位变性，并将变性产物转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后用生物素等标记的探针检测该产物。

3．斑点杂交法当扩增产物是多条带纹时，可用斑点杂交法分析PCR产物。

首先将扩增的片段固定在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用生物素等标记的探针杂交。

或将不同的探针固定在同一尼龙膜上，用标记的PCR产物作探针杂交，根据杂交点的位置即可判断产物序列变异的种类。

斑点杂交有助于检测突变DNA的突变类型，有助于遗传病的基因诊断，还可用于基因多态性分析，如HLA基因多态性分析。

4．PCR-ELISA法待测PCR产物需携带有生物素等固定集团和地高辛等检测集团。

PCR反应产物中带生物素标记的引物延伸链与带地高辛标记引物延伸链形成双链，生物素等固定集团可与微孔板上包被的亲和素结合，向微孔板中加入酶标记地高辛抗体和生色底物，即可对PCR产物进行ELISA检测。

5．原位杂交法 PCR产物也可用原位杂交法检测，所用探针可用生物素、地高辛或荧光标记。

三、以PCR为基础的其它相关技术近年来PCR技术在应用的过程中得到了进一步的发展。

目前已出现多种以PCR为基础的PCR 相关技术，形成了适用于不同目的的PCR技术系列，以下是几种在血液学及检验领域应用较多的PCR相关技术。

（一）逆转录PCR逆转录PCR（reverse tranion PCR，RT-PCR）是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行的体外扩增技术。

由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板，因此必须先将总RNA或mR NA作逆转录，生成与之互补的cDNA，然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增，得到所需要的目的基因片段。

RT-PCR常用于克隆cDNA、合成cDNA探针以及分析基因表达等。

（二）定量PCR最初的PCR技术只是用于定性检测DNA或RNA，对PCR产物的数量并不重视。

随着科学研究的逐步深入，人们开始考虑用PCR技术来进行DNA或RNA的定量检测，随之出现了定量PCR （quantitative PCR，Q-PCR）技术这一新名词。

目前常用的Q-PCR技术可分为终点法和实时法。

1．终点法Q-PCR 所谓终点法Q-PCR是指在PCR结束以后根据最终的PCR产物量来决定模板中目的基因的数量。

而根据所用内对照的区别，终点法Q-PCR又可以分为两种。