博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术基因敲除是一种通过将目标基因删除或改变其序列来研究该基因功能
的方法。
这一技术通常使用胚胎干细胞或转基因动物模型，方法是设计一
种包含两个草图和背靶RNA的末梢引物，然后将引物引导向目标基因的编
码序列，并在细胞合成双链DNA后通过NHEJ或HDR途径来进行切除修复，这会导致目标基因的敲除或替代。
通过比较敲除基因和野生型对照组织的
差异，科学家可以确定该基因在特定生物过程中的功能。
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➢ 选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomyc素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
➢ 同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法 或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中， 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生 同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源 基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射优 点是外源基因转移率高，可直接用外源基因进行 转移；缺点是转移基因表达不稳定，技术难度较 大，效率低。电穿孔命中率比显微注射低，但便 于使用。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
基因敲除技术路线
基因敲除技术路线基因敲除技术是一种常用的基因组编辑方法，通过破坏特定基因的功能，以研究该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用。
本文将介绍基因敲除技术的基本原理、常用的敲除方法和技术路线。
一、基因敲除技术的原理基因敲除是指通过人为手段使特定基因在生物体中失去功能。
在细胞层面上，基因敲除可以通过两种方式实现：直接破坏基因编码区域或间接影响基因表达。
直接破坏基因编码区域的方法包括插入缺失、替换和故障等，而间接影响基因表达的方法则通过RNA干扰或基因废弃等方式实现。
二、常用的基因敲除方法1. 全基因敲除方法：全基因敲除是将整个基因组中的某个特定基因进行敲除，即完全破坏该基因的编码区域。
常用的全基因敲除方法包括基因敲除小鼠模型、转基因植物敲除和CRISPR-Cas9等。
2. 特定基因敲除方法：特定基因敲除是指对某个特定基因进行有针对性的敲除，保留其他基因的功能不受影响。
常用的特定基因敲除方法包括siRNA靶向敲除、基因编辑酶的使用和肌肉纤维母细胞的敲除等。
三、基因敲除技术路线基因敲除技术的路线可以分为以下几个步骤：1. 确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。
通过文献研究和生物信息学分析，可以确定该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用，以及敲除后可能引起的变化。
2. 设计敲除载体：根据目标基因的序列信息，设计敲除载体。
敲除载体通常包括靶向序列、选择性标记基因和背景基因等。
靶向序列用于特异性识别目标基因，选择性标记基因用于筛选敲除细胞，背景基因用于确认敲除效果。
3. 转染敲除载体：将设计好的敲除载体导入到目标细胞中。
常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒载体介导法等。
转染后，目标细胞中将存在敲除载体和非敲除细胞。
4. 筛选敲除细胞：通过添加相应的筛选剂或选择标记基因，筛选出成功敲除目标基因的细胞。
敲除细胞可以通过PCR、Western blot 或克隆等方法进行鉴定。
5. 验证敲除效果：通过对敲除细胞进行功能性实验，验证敲除效果。
分子生物学课件：基因敲除
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
基因敲除方法的原理应用
基因敲除方法的原理应用1. 概述基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过将目标基因从细胞或生物体中删除，以研究基因在生物体中的功能和调控机制。
本文将介绍基因敲除方法的原理和常见应用。
2. 基因敲除方法的原理基因敲除方法主要包括两个步骤：构建敲除基因载体和敲除基因导入目标细胞或生物体。
2.1 构建敲除基因载体1.确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。
可以通过文献资料和数据库查询，分析基因序列和功能等信息，选择合适的目标基因。
2.设计敲除基因：设计针对目标基因的敲除基因，通常采用DNA重组技术构建。
敲除基因通常包括选择标记基因和目标基因序列特异性引物。
3.构建敲除基因载体：将设计好的敲除基因插入适当的载体中，如质粒或病毒载体。
2.2 敲除基因导入目标细胞或生物体1.选择合适的敲除基因导入方法：根据目标细胞或生物体的特性和要求，选择合适的基因导入方法，常见的方法包括细胞转染、病毒载体导入和转基因动物等。
2.导入敲除基因：将构建好的敲除基因载体导入目标细胞或生物体中，通过基因重组等技术使敲除基因与目标基因发生相应的重组事件。
3. 基因敲除方法的应用基因敲除方法被广泛应用于基因功能研究、药物研发、疾病模型构建等领域。
以下列举几个常见的应用案例：3.1 基因功能研究通过基因敲除方法，可以在细胞或生物体中敲除目标基因，观察其对生物体的影响，以揭示目标基因在生物体中的功能和调控机制。
例如，敲除特定的转录因子基因，可以研究其对基因表达和细胞分化的影响。
3.2 药物研发基因敲除方法可以用于筛选药物靶点和评估药物疗效。
通过敲除潜在的靶点基因，观察其对疾病模型动物的影响，以评价该靶点的重要性和药物的效果。
这对于药物研发和治疗策略的选择具有重要意义。
3.3 疾病模型构建利用基因敲除方法，可以构建基因敲除动物模型，模拟特定疾病的发生和发展过程。
通过敲除与疾病相关的基因，可以研究疾病的发病机制、病理过程和药物治疗的有效性。
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靶向基因技术
• 经典方法 ：
– 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
• 饱含希望与失望的技术：
– ZFN，被Sigma公司垄断
• 新的里程碑：
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
（一）ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
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2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
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条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
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TALEN 发展过程
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TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点
切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
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III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
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（一）ZFN技术系统
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基因编辑技术和原理讲述
1. ZFN 基因组编辑技术
ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能旳实现是基于具有独特旳DNA序列辨认旳锌指蛋白发展 起来旳。1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族旳 DNA 结合区域发觉了Cys2- His2锌指模块， 到1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2023年，Urnov等发觉一对由4个锌指连 接而成旳ZFN可辨认24 bp旳特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中旳应用。
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转 录旳 sgRNA 折叠成特定旳三维构造后与 Cas9 蛋白形 成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶辨认特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并 开启 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离旳 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建旳sgRNA) 靶向序列旳长度不同, PAM 序列也可能不同。
• 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度旳修
复过程，断裂旳DNA 修复重连旳过程中会发生碱基随
机旳插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目旳
基因敲除。假如一种外源性供体基因序列存在，NHEJ
机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点旳
基因敲入。
（ 移码突变：在正常DNA分子中，碱 基缺失或增长3旳倍数，造成这位置之后
3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
• 目前， TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植
物旳位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有 较大旳应用优势， 但依然有些问题需要处理，例如:脱 靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置 及邻近序列有关等。
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿101页PPT
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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博士专题：基因功能研究技术之基因敲 除及基因编辑技术讲课讲稿
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
简述基因敲除技术
基因敲除技术是一种基因工程技术，通过破坏或抑制特定基因的表达，从而研究和理解基因在生物体中的功能和作用。
基因敲除技术通常包括以下几个步骤：
1.选择目标基因：确定需要敲除的目标基因，可以根据已有的知识或实验数据来选择。
2.构建敲除载体：利用分子生物学技术，构建一种特殊的DNA载体，其中包含了与目标基因相对应的序列。
3.导入敲除载体：将构建好的敲除载体导入到目标生物体细胞中。
可以利用多种方法，如转染、电穿孔或病毒转导等方式将敲除载体引入目标细胞。
4.敲除效率评估：通过分子生物学技术，如PCR、Southern blot、Western blot等，对转染细胞进行分析，检测和评估敲除效果。
一般来说，敲除效应可以通过检测目标基因的表达水平、蛋白质产量等来确定。
5.功能分析：对敲除细胞或敲除动物进行功能分析，研究目标基因的功能和作用。
可以通过细胞培养实验、动物模型研究等方式来进行。
基因敲除技术在基因功能研究中具有重要意义。
通过敲除特定基因，可以探究该基因在生物体中的重要性、作用机制、相关致病性等。
此外，基因敲除技术还可以应用于药物研发、生物工程、农业改良等领域，为相关领域的研究和应用提供重要工具。
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（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
《基因敲除技术》PPT课件
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
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2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
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2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
基因敲除技术基本原理
基因敲除技术基本原理基因敲除技术是一种基因工程技术，用于无害地删除或失活目标生物体中的特定基因，以研究该基因在生物体发育、功能、代谢等方面的作用。
基因敲除技术的基本原理包括选择适当的靶标基因、构建相应的敲除载体、导入宿主细胞、通过重组事件敲除目标基因、筛选和鉴定敲除细胞系等。
首先，选择适当的靶标基因是进行基因敲除实验的第一步。
研究人员通常会选择一些在发育或生理过程中具有重要作用的基因作为靶标基因，或者一些与疾病相关的基因。
通过对该基因进行敲除，可以揭示该基因在生物体中的功能和作用机制。
其次，构建相应的敲除载体。
敲除载体是进行基因敲除实验所必需的工具，它通常包括两个关键部分：敲除引物和选择标记物。
敲除引物是用于诱导目标基因发生重组事件的DNA序列，它的序列与目标基因的某个特定区域相匹配。
选择标记物是一种能够通过对敲除细胞系进行筛选和鉴定的标记物，例如抗生素抗性基因。
将这两个部分合并到一起构建敲除载体。
然后，导入敲除载体到宿主细胞中。
常用的方法包括转染、电穿孔和病毒载体介导等。
转染是将敲除载体转移到宿主细胞内的常用方法之一，可以使用化学物质、离子聚合物、病毒载体或电穿孔来增加细胞膜的通透性。
通过重组事件敲除目标基因。
一旦敲除载体成功导入宿主细胞，敲除引物上的序列与目标基因的特定区域发生配对，启动重组事件。
在细胞的DNA修复机制的作用下，目标基因的部分或全部序列被删除或失活。
在敲除过程中，必须通过适当的实验条件和方法，如适当选择敲除载体的浓度和作用时间，以增强敲除效率。
最后，筛选和鉴定敲除细胞系。
筛选敲除细胞系的方法通常基于选择标记物的作用。
例如，如果选择标记物是一个抗生素抗性基因，那么在培养基中添加相应的抗生素，只有携带了敲除载体的细胞才能存活下来。
通过比较被敲除的细胞系与野生型细胞系的生物学特性和表型差异，可以初步鉴定敲除的目标基因在生物体发育、功能、代谢等方面的作用。
总结起来，基因敲除技术通过选择适当的靶标基因，构建敲除载体，导入宿主细胞，通过重组事件敲除目标基因，筛选和鉴定敲除细胞系等步骤，实现了对特定基因的敲除。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
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（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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Cre/loxP系统作. 用原理示意图
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FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
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II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
第12章转基因、基因敲除和RNA干涉课件
• SiRNA的双链解开变成单链，和已知蛋白形成复合物 （Argonaute2）结合，复合物同与siRNA互补的mRNA结 合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，
• 以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合 成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它 在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。
二、随机插入突变进行基因敲除
• 细胞基因组中进行随机插入突变，建立一 个携带随机插入突变的细胞库，然后通过 相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除 细胞
• 逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对 于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化 和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基 因敲除
基因捕获法的优缺点
• 建立一个携带随机插入突变的ES 细胞库费用 • 更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功
能分析
• 概念 • 原理
第二节 RNA干涉
RNAi阻断基因表达的机理
• 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂解成 siRNA
• 双链RNA还能在RdRP 的作用下自身扩增后，再被Dicer 酶裂解成siRNA
• 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚 合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，
• 长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA
步骤
• 设计反向DNA序列 • 重组载体 • 转染细胞 • 检测目的基因表达 • 观察表型
第三节．基因敲除技术的应用及前 景
• 建立生物模型 • 疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗 • 提供廉价的异种移植器官 （α１－３半乳糖
摘自《中华医学信息》 2007年第22卷第21期
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• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp 转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因 组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因 动Байду номын сангаас。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所 表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动 物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出 现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
• 传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随 机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于 10-6），增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。
1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠 模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技 术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛 应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时 空特异性基因打靶策略的技术核心。
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超 基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp （EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。 Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。它 不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被 删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何 辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环 状甚至超螺旋 DNA。
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
Cre-LoxP重组酶系统
• LoxP（locus ofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是 有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成， 8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化 DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序 列是Cre酶的结合域。其序列如下 ：
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
• Cre-LoxP系统的特性
条件性基因敲除法可定义 为将某个基因的修饰限制 于小鼠某些特定类型的细 胞或发育的某一特定阶段 的一种特殊的基因敲除方 法。它实际上是在常规的 基因敲除的基础上，利用 重组酶Cre介导的位点特异 性重组技术，在对小鼠基 因修饰的时空范围上设置 一个可调控的“按钮”， 从而使对小鼠基因组的修 饰的范围和时间处于一种 可控状态。
• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导 型基因敲除。
• 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个 体中的靶基因活性。
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空 间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动物 的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲 除的技术。
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
（三）诱导型基因敲除
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
刘惠荣 内蒙古农业大学生命科学学院
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示