基因工程实验的详细步骤
简述基因工程的基本操作步骤
简述基因工程的基本操作步骤随着科学技术的不断进步，基因工程成为当代科技领域的重要研究方向之一。
基因工程是通过改变生物体内部的基因结构和功能来达到人为干预和控制生物现象的目的。
基本操作步骤可以概括为以下几个方面：第一步，选取目标生物体。
选择一个已知的基因序列，对其进行修改，向其中添加或删除一些基因信息或者改变这些基因的排列顺序，制造出新的DNA序列。
这样做出来的DNA序列也称为重组 DNA。
第二步，将重组 DNA 导入到宿主细胞中。
将准备好的重组 DNA导入到细胞内，可采用注射，体外转化，或用病毒带入等方法。
宿主细胞需要同时具有稳定性和能够快速繁殖的特点，例如大肠杆菌等。
第三步，将重组 DNA 插入到宿主细胞染色体上，使其变为永久性的遗传物质。
此时，需要借助工具酶等将重组 DNA 单链插入到宿主细胞中的DNA 双链片段之间，形成永久性的遗传物质。
第四步，使用酶对重组基因进行切割。
利用限制酶，可以将重组基因从宿主细胞的染色体中切割下来。
第五步，进行测序和分析。
在完成以上操作后，需要对切割得到的基因片段进行测序和分析，以确定重组成果的成功与否以及其质量是否达到实验需求的标准，同时也需要进行针对宿主细胞的表达和鉴定工作。
需要注意的是，在进行基因工程时，要注意实验的安全性等问题。
需要遵循相关的实验操作规范，确保人类及环境的不受到污染和伤害。
综上所述，基因工程由基本的实验操作步骤组成，可以利用这些步骤来改变基因序列，创造新的生物品种，并为医学和工业等领域的发展提供支持。
这些操作可以打造出具有生物多样性和可再生性的材料和产品，并带来人们从未想到的各种应用和发展。
基因工程主要操作流程及图解
连 接 ：
相 同 限 制 酶 切 位 点
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应 Ⅰ
G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割 Ⅰ
G CCTAG G CCTAG
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割 用 载体 Ⅰ
+
GATCC G GATCC G
T4 DNA 15ºC
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
目的基因
体
载体
分 离 导入
同 切
GATCC G CCTAG G GATCC G CCTAG G
连接
筛 选
检测和 表达
1基因工程操作步骤： 基因工程操作步骤： • 获取目的基因 • 构造重组 DNA 分子 （注意：要用同一种限制酶切载体和目的基因） • 转化或转染 • 表达 • 蛋白质等产物的分离纯化
• 2其主要操作流程可以简述为： 其主要操作流程可以简述为： 其主要操作流程可以简述为 分、切、接、转、筛、表
分：目的基因的获取、载体的选择 切：限制性内切酶切取基因片段和载体接口 接：用连接酶将目的基因基因的阳性克隆 表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物
基因工程实验流程
基因工程实验流程1.选择目标基因：首先，确定要研究或改造的目标基因。
这个基因可以是来自任何生物的DNA序列，包括原核生物和真核生物，甚至可以是合成的DNA片段。
2.基因分离：将包含目标基因的DNA从生物体中分离出来。
这可以通过提取目标生物体的基因组DNA，然后使用特定的酶切酶将目标基因从DNA中剪切出来。
3.DNA克隆：将目标基因插入到合适的载体中，形成重组DNA分子。
常用的载体包括质粒、病毒或人工染色体。
重组DNA分子可以通过转化、感染或转染等方法导入到宿主细胞中。
4.转化宿主细胞：将重组的DNA分子导入到适当的宿主细胞中。
这可以通过热冲击、电穿孔、化学方法或用载体病毒感染的方式实现。
在这一步中，多个宿主细胞可能被转化，以增加目标基因的表达量。
5.分子鉴定：通过PCR反应、限制性酶切、DNA测序等方法，对导入宿主细胞的重组DNA分子进行鉴定和验证。
这可以确认目标基因是否被正确克隆和定位在宿主细胞的基因组中。
6.蛋白质表达：通过转录和翻译，使目标基因在宿主细胞中转录成mRNA，然后翻译成蛋白质。
这个过程可以通过合适的启动子和转录因子来调控。
7.蛋白质纯化：通过细胞裂解和各种分离技术，获得纯度较高的目标蛋白质。
这包括离心、超滤、电泳等技术，可以去除其他细胞组分和杂质。
8.蛋白质功能研究：对纯化的目标蛋白质进行功能研究，了解其生物学功能和相互作用。
这可以通过基因敲除、突变、结构分析、生物活性检测等方法进行。
9.结果分析和确认：对实验结果进行数据分析和统计，确保实验结果的可靠性和重复性。
这包括基因表达水平、蛋白质功能、相互作用准确性和可靠性的验证。
10.应用和进一步研究：根据实验结果，根据需要对目标基因进行进一步改造或利用。
这可能涉及到设计新的实验和技术，以满足具体的应用需求。
总结：基因工程实验流程是一个复杂的过程，需要多个步骤和技术的相互协作。
这个过程涉及到基因选择、分离、克隆、转化、鉴定、蛋白质表达和纯化等多个关键步骤。
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作包括以下几个步骤：
1. 取得目标基因：首先需要获得目标基因的DNA序列。
这可以通过多种方法实现，如克隆、PCR扩增、合成等。
2. DNA切割：将目标基因从DNA样本中分离出来，通常需要用到一种特殊的酶——限制性内切酶。
这些酶可以在DNA的特定序列处切割，从而得到目标基因的DNA片段。
3. DNA连接：将目标基因的DNA片段与载体DNA连接在一起。
载体DNA是一种能够自复制的DNA分子，可以在细胞中稳定存在。
连接的过程通常需要使用DNA连接酶。
4. 转化：将连接好的DNA载体导入宿主细胞中。
这可以通过多种方法实现，如电穿孔、热激击等。
5. 克隆和筛选：选择合适的宿主细胞，并用培养基培养细胞，使其增殖。
通过筛选方法，如抗生素筛选、荧光检测等，筛选出带有目标基因的克隆。
6. 验证：对获得的克隆进行验证，确认目标基因已经成功导入宿主细胞，并且在细胞中表达。
7. 基因表达和应用：利用已经导入细胞中的目标基因进行进一步的研究。
可以通过控制基因的表达水平，探究基因的功能和
调控机制。
同时，还可以利用基因工程技术将目标基因导入其他生物体，实现特定性状的改良和应用。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。
2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。
3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。
6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。
8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42C保温90s,冰浴2。
3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。
4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。
2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。
3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。
7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。
8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。
基因工程的基本过程
基因工程的基本过程介绍基因工程是一项重要的生物技术领域，它利用DNA重组技术，对生物体的基因信息进行修改和重新组合，实现改变生物体性状的目的。
基因工程的基本过程包括基因定位、基因克隆、基因表达和基因转导等步骤。
本文将详细介绍基因工程的基本过程。
一、基因定位基因定位是基因工程的第一步，通过确定目标基因在染色体上的位置，为后续的基因克隆提供准确的目标。
基因定位可以通过物理方法、遗传方法和分子生物学方法等多种手段来实现。
1. 物理方法物理方法主要包括荧光原位杂交（FISH）和比较基因组杂交（CGH）等。
其中，荧光原位杂交可以通过标记特定探针并与目标基因序列进行杂交，从而在染色体上检测到目标基因的位置。
比较基因组杂交可以通过将目标基因与参考基因组进行杂交，通过比较两者的杂交强度，确定目标基因在染色体上的位置。
2. 遗传方法遗传方法主要包括连锁分析和关联分析等。
连锁分析是利用基因在染色体上的连锁关系，通过研究特定遗传标记和目标基因之间的连锁程度，来确定目标基因在染色体上的位置。
关联分析则是通过研究染色体多态性和目标基因之间的关联程度，来确定目标基因与某个特定区域的关系。
3. 分子生物学方法分子生物学方法主要包括PCR、Southern blotting和DNA测序等。
PCR可以通过目标基因的序列信息，设计特定引物并进行扩增，从而实现对目标基因的定位。
Southern blotting可以通过转移DNA片段到膜上，并进行测序等。
二、基因克隆基因克隆是基因工程的关键步骤，它通过将目标基因从来源生物体中分离出来，并进行扩增，得到足够多的DNA材料用于后续的实验。
1. DNA提取DNA提取是基因克隆的第一步，它可以通过细胞裂解、溶解和沉淀等步骤将DNA从生物体中提取出来。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和商业DNA提取试剂盒等。
2. PCR扩增PCR扩增是基因克隆的关键技术，它可以通过DNA聚合酶的作用，将目标基因序列进行扩增。
基因工程过程
基因工程过程
基因工程是通过对生物体的基因进行操作，使其具有新的性质或功能的一种技术手段。
它被广泛应用于生物学研究、农业生产和医学治疗等领域。
基因工程的过程包括以下几个步骤：
1.选择目标基因
在进行基因工程之前，首先需要确定需要操作的目标基因。
这通常需要对生物的遗传信息进行分析和研究，确定哪些基因具有重要性或潜在价值。
2.克隆目标基因
克隆目标基因是对基因工程来说非常重要的一步。
将目标基因从生物体中提取出来，并进行 PCR 扩增和克隆。
这通常需要将基因插入载体中，如质粒、病毒或细胞。
3.构建表达载体
在进行基因工程的过程中，表达载体是必不可少的。
表达载体可以将目标基因导入到宿主细胞中，并使其表达出目标蛋白质。
表达载体可以是质粒、病毒或其他载体。
4.转染宿主细胞
将构建好的表达载体转染到宿主细胞中。
这通常需要利用转染剂或其他工具来实现。
5.筛选目标细胞
在将表达载体转染到宿主细胞中后，需要进行筛选以找到目标细胞。
通常，这可以通过对细胞进行荧光或抗生素抗性选择来实现。
6.表达目标蛋白质
找到目标细胞后，可以开始表达目标蛋白质。
这需要对细胞进行培养和处理，以促进目标蛋白质的表达和分泌。
以上就是基因工程的基本过程。
通过这些步骤，可以制造出具有新功能或性质的生物体或者蛋白质。
基因工程已经得到广泛的应用，为生物学的研究和应用带来了革命性的变化。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备【实验步骤】1 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2 取1mL培养物接种到100mL LB培养基（250mL三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。
3 将菌液转移到50mL离心管（2管）中，冰上放置15min。
4 4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5 用20 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液。
6 用10 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30min。
7 4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液，用2 mL的冷CaCl2溶液悬浮。
8 分装到数个EP管中，每管200 uL，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（T-SOD或T-IL218）和表达载体质粒（PET32或PET30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200 uL 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒DNA 2 uL（PET32a，IL-18），混匀，冰上放置30min。
2、将EP管放到42℃保温90s，冰浴 2min。
3、加入800uL LB液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。
4、将100 uL 的复苏细胞涂布在含有Amp（100mg/mL）的LB培养皿中，正置平皿30min （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1 挑取单菌落接种于100 mL 加入50uL Amp 的LB液体培养基中，振荡培养过夜。
2 过夜培养的菌液加入1.5 mL的小指管（20个每组）中，每次1 mL，4℃，12000 rpm，离心1min，4次，弃上清。
3 加入150uL溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10min。
4 加入350uL溶液Ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5min。
基因工程实验的详细步骤
基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。
121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。
B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。
Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。
D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。
100 o C加热15分钟，冷却后分装。
H.饱和酚：市售酚需重蒸。
重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。
I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。
J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。
K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。
基因工程实验
基因工程实验详细步骤一、目的基因LK的扩增——PCR（含电泳）（一）目的基因LK的扩增——NE201（1）实验准备材料：rLK重组质粒（模板）试剂：PCR试剂盒用具：移液枪（2.5μl、10μl、50μl）以及相应枪头（盒）、EP管（100μl）、EP板（大、小）；冰袋两只、手套、废液桶仪器：离心机（14000rpm）、PCR扩增仪（2）反应体系（50μl）试剂（按照加样顺序）用量dH2O23μL重组质粒1μL上游引物F 0.5μL下游引物R 0.5μLTaq酶25μL（3）反应条件预变性95℃，10min变性95℃，30s退火56.6℃，35s延伸72℃，40s最终延伸72℃，10minTIP：*吸取或加入液体时，枪头尽量少伸入，可避免气泡产生；若有气泡，需10000rcf离心1min 再进行下一步实验*勤换枪头，避免污染试剂或产物*任何移液枪用完后及时调回最大量程*仪器用完后及时关闭（二）LK PCR产物的电泳——NE217（1）实验准备材料：LK PCR产物试剂：去离子水、50×TAE缓冲液、电泳用琼脂糖、6×Loading Buffer、DL1000marker（D526A）、Ultrapower DNA Stain染液用具：钥匙、称量纸、橡皮筋、100ml锥形瓶、50ml量筒；制胶槽、制胶卡、制胶梳（18teeth）；移液枪（10μl、1000μl）及相应枪头（盒），100μl EP管，EP板（大、小）；冰袋两只、手套（包括塑料和麻布）、废液桶仪器：电子天平、微波炉、电泳仪（含电泳槽）（2）制胶（3%）1. 称取电泳用琼脂糖0.6g（即总体积20ml 的3%），小心倒入100ml锥形瓶中2. 取TAE缓冲液400μl于50ml量筒中，去离子水定容至20ml（实为电泳缓冲液）3. 将量筒中液体转入锥形瓶中，盖上吸量纸，用橡皮筋封好，再用步骤2中用剩的枪头扎一个小孔4. 将制胶梳（18 teeth）、制胶卡、制胶槽洗净并用吸水纸擦干，组装好5. 至于微波炉中，注意观察，煮沸后立即拿出（戴上麻布手套），轻轻晃匀，重复2-4次，至胶完全澄清均一为止6. 及时将胶转入准备好的制胶槽，凝固30min后，连着横条纹塑料板一起放入电泳槽中（胶孔靠近负极）（3）加样和电泳1. 在EP管内分别加入A. DL1000marker 5μl，染液1μl；B. PCR产物5μl，6×loading buffer1.2μl，染液1μl2. 将样品全部转入胶孔中。
基因工程施工顺序
基因工程是一门通过对生物体的基因进行操作，达到改变其遗传特性的目的的技术。
基因工程的操作顺序一般可以概括为五个步骤：切、接、增、转、检。
首先，我们需要进行的是“切”，也就是找到目的基因，并使用限制性核酸内切酶将其切取出来。
限制性核酸内切酶是一种能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的序列处切割DNA分子的酶。
在这个过程中，我们会得到一个带有接口的基因片段。
这个接口可以是平末端，也可以是黏性末端。
需要注意的是，不同的限制性核酸内切酶只能切取一种基因。
接下来是“接”的步骤，也就是找到一个载体，如常用的质粒，使用相同的限制性核酸内切酶将其切断，并将其与切取出来的基因片段用DNA聚合酶重组起来。
这个过程中，我们需要确保目的基因和载体的切割位点是相同的，以便能够正确地进行连接。
然后是“增”的步骤，也就是扩增目的基因载体。
因为转基因工程需要不止一个载体，一个载体成功率极低，所以我们需要大量复制目的基因载体。
这个过程通常使用PCR技术进行。
接下来是“转”的步骤，也就是将扩增后的目的基因载体导入受体细胞。
不同的受体细胞有不同的导入方法，如植物有基因枪法、花粉管通道法，动物常用显微注射法，微生物则可以使用感受态细胞法。
最后是“检”的步骤，也就是对目的基因进行检测和鉴定。
这个步骤可以分为两个层面：分子水平和个体水平。
分子水平上的检测方法有：DNA分子杂交技术、分子杂交技术和抗原-抗体杂交技术。
个体水平上的鉴定则可以通过抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方式进行。
总的来说，基因工程的操作顺序是一个系统的过程，需要精心设计和严格操作。
只有正确地完成每一个步骤，才能确保基因工程的成功。
基因工程的五个基本流程
基因工程的五个基本流程一、基因工程的概述基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的结构和组成，从而达到改变其性状和功能的技术。
基因工程技术的应用范围广泛，包括农业、医药、工业等领域。
二、基因工程的五个基本流程1.选择目标基因选择目标基因是进行基因工程的第一步。
目标基因可以是已知的具有特定功能的基因，也可以是未知的探索性研究对象。
在选择目标基因时需要考虑多个方面，如所需功能、适用范围、安全性等。
2.克隆目标基因克隆目标基因是进行基因工程的关键步骤之一。
克隆目标基因需要进行以下几个步骤：（1）提取DNA：从生物体中提取DNA。
（2）切割DNA：使用限制性内切酶将DNA切割成特定长度。
（3）连接载体：将目标DNA片段与载体连接起来。
（4）转化宿主细胞：将连接好的载体转化到宿主细胞中。
3.构建重组表达载体构建重组表达载体是进行基因工程的另一个重要步骤。
重组表达载体是将目标基因嵌入到载体中，使其能够在宿主细胞中表达。
构建重组表达载体需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的载体：选择合适的载体，如质粒、病毒等。
（2）插入目标基因：将克隆好的目标基因插入到载体中。
（3）调节表达：调节重组表达载体的启动子和终止子，以控制目标基因在宿主细胞中的表达。
4.转染宿主细胞转染宿主细胞是将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中进行表达。
转染宿主细胞需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的宿主细胞：选择合适的宿主细胞，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等。
（2）转染重组表达载体：将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中。
（3）筛选阳性克隆：通过筛选阳性克隆来确定成功转移和表达目标基因的细胞。
5.分离和纯化目标蛋白分离和纯化目标蛋白是将表达出的目标基因转化为蛋白质，并对其进行分离和纯化的过程。
分离和纯化目标蛋白需要进行以下几个步骤：（1）破碎宿主细胞：将表达目标基因的宿主细胞破碎，释放出目标蛋白。
（2）分离目标蛋白：使用不同的技术对混合物进行分离，如层析、电泳等。
基因工程设计实验方案
基因工程设计实验方案摘要：基因工程是一种能够改变生物体遗传信息的技术，利用基因工程技术可以对生物体进行基因改造，以期望获取新的性质或功能。
本实验旨在利用基因工程技术对细菌进行基因改造，使其产生一种特定的推动力物质，以期望将其应用于工业生产或环境修复等领域。
实验过程分为以下步骤：1）设计目标基因序列；2）构建表达载体；3）转染目标细菌；4）检测目标基因的表达情况；5）鉴定生产的推动力物质。
通过以上实验步骤，可以实现基因工程技术在实际应用中的有效性和可行性，为生物技术领域的发展提供实践基础。
一、实验目的1. 利用基因工程技术对细菌进行基因改造，使其具有产生一种特定的推动力物质的能力；2. 验证基因改造后细菌是否能够表达目标基因，并产生需要的推动力物质；3. 探讨基因工程技术在工业生产或环境修复等领域的应用前景。
二、实验材料1. E. coli DH5α细菌2. LB培养基3. PCR试剂盒4. DNA琼脂糖凝胶5. DNA酶6. 质粒抽提试剂盒7. DNA连接试剂盒8. 基因组DNA提取试剂盒9. 干冰10. 离心管11. 热平台12. 琼脂糖凝胶电泳仪三、实验步骤1. 设计目标基因序列目标基因序列为一种推动力物质合成酶基因，可以通过生物数据库或文献检索获取。
根据目标基因序列，设计引物进行PCR扩增。
2. 构建表达载体将目标基因的PCR产物与表达载体连接，构建重组质粒。
通过琼脂糖凝胶电泳和DNA连接试剂盒进行质粒构建的验证。
3. 转染目标细菌将构建好的表达载体导入E. coli DH5α细菌中，利用热激转化技术进行转染。
4. 检测目标基因的表达情况通过PCR和实时荧光定量PCR技术，检测转染细菌中目标基因的表达情况。
5. 鉴定生产的推动力物质利用生化方法，检测生长在含有目标基因的E. coli DH5α细菌培养基中是否产生了需要的推动力物质。
四、实验步骤详解1. 设计目标基因序列目标基因是一种合成推动力物质的酶基因，可以通过生物数据库或文献检索获取。
简述基因工程的操作流程
简述基因工程的操作流程一、目的基因的获取目的基因的获取是基因工程的第一步，可以通过以下几种方法获取：1.从基因组文库中获取目的基因：通过基因组测序和文库构建，获得包含目的基因的文库，然后通过筛选和克隆化得到目的基因。
2.从cDNA文库中获取目的基因：cDNA文库是通过对特定组织或细胞的mRNA进行逆转录得到的，通过筛选和克隆化得到目的基因。
3.通过PCR技术获取目的基因：根据已知的目的基因序列，设计特异性引物，通过PCR技术扩增目的基因。
4.从生物体内直接分离目的基因：通过基因组挖掘和PCR等技术，可以直接从生物体内分离出目的基因。
二、载体的选择与构建载体是承载外源DNA片段并使其在宿主细胞内稳定遗传的元件，常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
根据目的基因的特点和宿主细胞类型选择合适的载体，同时也可以对载体进行改造和优化，以适应不同的需求。
三、重组DNA的构建重组DNA是将目的基因与载体连接的过程，常用的方法有化学连接法、酶促连接法等。
根据目的基因和载体的类型，选择合适的连接方法，构建重组DNA分子。
四、重组DNA的转化转化是将重组DNA分子导入宿主细胞的过程，常用的方法有电穿孔法、脂质体法、化学转化法等。
将重组DNA分子导入宿主细胞后，通过筛选和鉴定，确定阳性克隆。
五、重组细胞的筛选与鉴定通过筛选和鉴定阳性克隆，确定目的基因是否成功导入宿主细胞并稳定遗传。
常用的筛选方法有PCR扩增、DNA测序、表型特征分析等。
同时也可以对目的基因的表达产物进行检测和分析，以确定目的基因的功能和表达水平。
六、基因表达与调控基因表达是指目的基因在宿主细胞内的转录和翻译过程，通过调控基因表达可以实现目的基因的高效表达或者特定组织器官中的表达。
常用的调控方法有启动子调控、转录因子调控、RNA干扰等。
七、基因工程菌或细胞的应用与优化根据目的基因的功能和应用领域，将基因工程菌或细胞应用于生产实践或医学研究中。
同时也可以对基因工程菌或细胞进行优化和改良，以提高其生产效率或降低成本。
基因工程实验流程
基因工程实验流程基因工程是一种通过改变生物体的遗传物质（DNA）来改变其性状的技术。
基因工程实验通常包括以下步骤：1.确定研究目标：在进行任何基因工程实验之前，首先确定研究目标。
这可能涉及到改变特定基因的表达水平、插入新的基因、修改现有基因等。
2.选择宿主生物体：选择适合进行基因工程实验的宿主生物体。
常用的宿主包括细菌、酵母、植物和动物细胞。
3.分离目标基因：从源生物中分离出含有目标基因的DNA。
这可以通过多种方法实现，如PCR（聚合酶链式反应）或基因文库筛选。
4.构建基因载体：将目标基因插入到一个适当的载体中，如质粒或病毒。
载体在宿主生物体中用于传递目标基因。
5.转化宿主生物体：将经过构建的基因载体导入宿主生物体中。
这可以通过多种方法实现，如细胞转化、植物转化或动物胚胎注射。
6.筛选和鉴定转化体：经过一定时间培养后，使用合适的筛选方法选择和鉴定转化体。
筛选方法可能包括在选择培养基中添加抗生素来筛选携带特定基因的细胞。
7. 验证目标基因的表达：使用分子生物学技术，如PCR、南方杂交、Northern杂交、Western印迹等方法来验证目标基因的表达。
8.分析和评估改变：对转化体进行进一步的分析和评估，以确定目标基因的功能和影响。
这可以通过表型分析、蛋白质组学、代谢组学等方法实现。
9.优化和改进：根据实验结果，进一步优化和改进基因工程实验的步骤和条件。
10.伦理和安全考虑：在进行基因工程实验之前，必须遵守伦理和安全准则，确保实验过程和产生的转化体对人类和环境没有负面影响。
基因工程基本步骤
基因工程基本步骤一、引言基因工程是一种应用生物学的技术，通过改变生物体内的基因序列来达到预期目的。
它在医学、农业、环境保护等领域都有广泛的应用。
本文将介绍基因工程的基本步骤。
二、选择目标基因在进行基因工程之前，需要选择目标基因。
这个过程需要考虑以下几点：1. 目标基因是否与所需特性相关；2. 目标基因是否易于克隆和操纵；3. 目标基因是否存在于所需生物体中。
三、克隆目标基因克隆是指将目标基因从其天然来源中分离出来并复制成多个拷贝。
这个过程包括以下步骤：1. 选择合适的DNA序列：根据已知的DNA序列信息，设计合适的引物或探针；2. 分离DNA：从所需生物体中提取DNA，并使用限制性内切酶切割；3. 连接DNA：将所需DNA片段与载体连接起来，形成重组DNA；4. 转化宿主细胞：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其转化为转化菌株。
四、表达目标蛋白表达是指将目标基因转录成RNA，再翻译成蛋白质的过程。
这个过程包括以下步骤：1. 选择合适的表达载体：根据所需蛋白质的特性选择合适的表达载体；2. 克隆目标基因：将目标基因克隆到表达载体中；3. 转染宿主细胞：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其转化为转染细胞；4. 诱导表达：通过添加适当的诱导剂，促使宿主细胞表达目标蛋白。
五、纯化目标蛋白纯化是指从混合物中分离出目标蛋白质并去除杂质的过程。
这个过程包括以下步骤：1. 收集细胞培养物或组织样本：从培养物或组织样本中收集所需蛋白质；2. 打破细胞壁：使用超声波或高压机等方法打破宿主细胞壁，释放所需蛋白质；3. 分离与纯化：使用各种生物化学方法，如离子交换、凝胶过滤、亲和层析等，分离出目标蛋白质并去除杂质；4. 鉴定纯度：通过电泳等方法检测纯度。
六、应用目标蛋白应用是指将目标蛋白质用于所需领域的过程。
这个过程包括以下步骤：1. 设计实验方案：根据所需领域的要求，设计合适的实验方案；2. 进行实验：使用所需蛋白质进行实验；3. 分析结果：根据实验结果进行数据分析；4. 优化应用：根据实验结果和数据分析，对应用进行优化。
基因工程的操作步骤
质粒载体的扩 增：通过PCR 技术对质粒载 体进行扩增得 到足够数量的
质粒载体
质粒载体的纯 化：通过电泳、 离心等方法对 质粒载体进行 纯化得到纯化
的质粒载体
选择合适的病毒载体：如腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等 设计目的基因：根据实验需求设计目的基因序列 构建重组质粒：将目的基因插入到病毒载体中形成重组质粒 包装病毒：将重组质粒转染到包装细胞中包装成病毒颗粒 纯化病毒：通过离心、过滤等方法纯化病毒颗粒 鉴定病毒：通过PCR、Western blot等方法鉴定病毒颗粒中的
基因工程的操作步骤
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基因工程简介
目的基因的获取
基因克隆载体构建
目的基因与载体连 接
将目的基因导入受 体细胞
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基因工程简介
基因工程是一种通过改变生物体的遗传物质以实现特定目的的技术。 基因工程包括基因克隆、基因表达、基因沉默等操作。 基因工程可以应用于医学、农业、环境等领域。 基因工程可以改变生物体的性状提高生物体的抗病性、抗虫性等。
转化：细菌、酵母、真、动物细胞 等真核细胞
转化：将目的基因直接导入受 体细胞使其表达
转导：将目的基因通过载体导 入受体细胞使其表达
转化方法：电穿孔法、化学转 化法、生物转化法等
转导方法：病毒转导、细菌转 导、植物转导等
转化效率：取决于目的基因的性质、受体细胞的类型和培养条件
转化：将连接好的目的基因 和载体导入受体细胞
筛选：通过抗性基因筛选出 含有目的基因的受体细胞
限制性内切酶：切割目的基 因和载体形成粘性末端
鉴定：通过PCR、测序等方法 鉴定目的基因是否成功插入到
载体中
检测目的基因是否成功插入载体 鉴定目的基因是否正确表达 检测目的基因是否具有功能 鉴定目的基因是否稳定遗传
（整理）基因工程试验.
（整理）基因⼯程试验.基因⼯程实验流程实验⼀丹参总DNA的提取实验⽬的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的⽅法。
实验材料：丹参叶⽚实验器材：台式离⼼机，恒温⽔浴锅，电泳仪，研钵和杵，离⼼管，微量移液器，枪头实验步骤：第⼀次使⽤前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加⼊指定量的⽆⽔⼄醇，充分混匀，加⼊后请及时在⽅框打钩标记已加⼊⼄醇，以免多次加⼊!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使⽤前加⼊β-巯基⼄醇到终浓度2%。
1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或⼲重组织30 mg）在研钵中加⼊液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到⼀个1.5ml离⼼管，不要解冻，加600µl 65℃预热的裂解液PL (确认已加⼊β-巯基⼄醇⾄2%)，剧烈涡旋振荡混匀，⽤⼤⼝径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加⼀个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65℃⽔浴20-60分钟，在⽔浴过程中颠倒离⼼管以混合样品数次。
可选如果组织⼲燥或者产量低，可以适当延长⽔浴时间。
如RNA残留多，可在⽔浴前加⼊6µlRNA酶（20mg/ml）。
4.加⼊700µl氯仿/异戊醇（体积⽐24：1混合），颠倒充分混匀⼏分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离⼼5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前⽤等体积酚/氯仿（1：1）抽提⼀遍。
5.⼩⼼吸取上清到⼀个新的1.5ml离⼼管，注意不要吸到界⾯物质。
如上清⽐较浑浊，则需要重复步骤4⼀遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加⼊1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加⼊⽆⽔⼄醇!）后⽴刻涡旋，充分混匀。
此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上⼀步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加⼊⼀个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - ⼊收集管中）13,000rpm离⼼30秒，倒掉收集管中的废液（先加700µl离⼼，弃废液，再加⼊剩余的溶液，再次离⼼）。
基因工程流程
基因工程流程
基因工程流程
基因工程是指经过精心设计和精确控制，将一种特定的DNA序列插入宿主生物体内，使宿主预定的特定基因表达从而获得特定的功能的一种技术。
这种技术可以让我们通过改变基因组中的基因，精确控制生物体对环境的反应，以修改任何生物的特定性能。
一般来说，基因工程是一个复杂的多阶段流程，主要包括以下步骤：
1）发现和选择：根据实验室技术，将有用的基因和其他DNA序列与常规的基因测序相结合，以满足某些特定应用。
2）合成：发现和选择的基因将被合成成一条长的DNA片段（叫做基因组），其中含有所需的基因，以及用以分离这些基因的辅助性DNA序列。
3）转染：基因组片段将被细胞转染，以使其被宿主细胞吞噬，存在于宿主细胞的染色体内，并由宿主细胞负责表达该基因。
4）表达：宿主细胞将预定的基因表达出来，从而获得预期的功能和特性。
5）评估和调整：实验室技术将被用来判断宿主细胞表达的基因是否获得满足要求的功能和特性，如果不能，将根据情况进行调整，以满足需求。
基因工程是一个繁琐的过程，需要许多实验室技术和技术素养，但是随着科技的发展，该过程变得更加简单便捷。
基因工程的发展，
使我们可以催生出更多的新型植物和动物，使生物资源更便捷地达到更高的效能水平和质量，推动着人类健康和社会发展。
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基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。
121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。
B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。
Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。
D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。
100 o C加热15分钟，冷却后分装。
H.饱和酚：市售酚需重蒸。
重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。
I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。
J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。
K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。
用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37 o C培养约12小时至对数生长后期。
2．质粒DNA的少量快速提取---碱裂解法A.取1.5ml培养液倒入1.5ml ependorf 管中，4o C下12000g离心3min。
B.弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。
C.菌体沉淀重悬浮于100μl预冷的溶液I中（激烈震荡，充分混匀）。
D.加入新配制的溶液II 200μl，快速盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒ependorf管6-8次，以混匀内容物（千万不要震荡）,放置5分钟。
E.加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒ependorf管数次，以混匀内容物，放置5分钟。
4o C下12000g离心5-10分钟。
F.将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1：1）(吸取酚/氯仿试剂瓶中的下层溶液)，震荡混匀，4o C下12000g离心5分钟。
G.将上清液（水相）移入干净ependorf管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(吸取氯仿/异戊醇剂试瓶中的下层溶液)，震荡混匀，4o C下12000g离心5分钟。
H.将上清液（水相）移入干净ependorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，震荡混匀后置于-20o C冰箱中20分钟。
然后在 4o C下12000g离心10分钟。
I.弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使液体流尽。
加入0.3ml 70%乙醇洗涤沉淀。
4o C下12000g离心5-10分钟。
J.吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流尽，室温干燥或真空干燥10分钟K.将沉淀溶于20μl TE缓冲液（pH8.0, 含20μg/ml Rnase A）中，储于-20o C冰箱。
实验二、基因组DNA的提取1.1 材料1.1.1植物材料银杏等木本植物。
1.1.2 主要试剂CTAB抽提液：1g CTAB，5ml 1M Tris，2ml 500mM EDTA，4.1g Nacl至50ml。
(2% CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0)CTAB/NaCl：10g CTAB，4.1g NaCl，溶解后定容至100ml。
(10% CTAB，0.7M NaCl) TE/NaCl：0.5ml 1M Tris，10μl 500mM EDTA，2.9g NaCl，至50ml。
(10mM Tris，0.1mM EDTA，1M NaCl，pH8.0)。
RNase: 溶于10mM Tris.Cl(pH7.5)，15mM NaCl溶液中，配成10mg/ml浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，添加等体积甘油后贮于-20度。
3 mol/L NaAc(pH 5.2)，氯仿:异戊醇（24:1）。
β-巯基乙醇，氯仿，异丙醇，异戊醇，饱和酚，无水乙醇，不溶性PVP等。
上述药品及Lambda DNA/Hin dIII均购自上海生物工程公司。
1.2改进的CTAB法根据文献（Frederick M. et al.，1998）CTAB法，稍做改进。
具体步骤：① 吸取8ml CTAB抽提液，加入320μl β-巯基乙醇，混匀，预热至65℃；② 称取0.5克叶片，置于事先用液氮预冷的研钵中，快速加入适量不溶性PVP，加入液氮研磨成粉未；③ 迅速将粉未倒入至CTAB抽提液中，摇匀，65℃保温1h，期间每隔5min 摇匀一次；④ 加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次，10000rpm离心5min；⑤ 将上清液转入另一无菌离心管中，加入1/10体积CTAB/NaCl、等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀，10000rpm离心10min；⑥ 将上清液转入一无菌离心管中，加入2/3体积异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃冰箱中一小时，然后10000rpm 离心10min；⑦ 弃掉上清液，加入TE/NaCl缓冲液溶解沉淀，10000rpm离心；⑧ 上清液转入一个1.5ml无菌离心管中，加入1/10体积NaAc及2/3体积异丙醇，颠倒混匀，此时会出现絮状沉淀，钩出此沉淀，在70%乙醇中漂洗数次，用无菌滤纸上吸干，溶于含Rnase浓度为10 μg/ml的0.5mlTE缓冲液中，37︒C 处理半小时，加入等体积的酚/氯仿（体积比为1:1），轻轻混匀，室温下静置10min，12000rpm 离心10 min，上清液转入新离心管中，加入1/10体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2)和二倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，此时已出现DNA絮状物，－20︒C 放置30min以上，用玻璃棒钩出DNA絮团，在70％乙醇中漂洗，无菌滤纸上吸干，溶解于0.5mlTE缓冲液中，－20 ︒C保存。
电泳分析取 2μl DNA样品在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯上观察和拍照。
实验三、DNA凝胶电泳与PCR2008-05-24 22:07试剂：1．5⨯TBE缓冲液：Tris. 54g, 硼酸27.5g, 加入20ml 的0.5mol/L EDTA(pH8.0), 定溶至1000ml.2．50×TAE: 24.2克Tris, 3.72克EDTANa2·2H2O, 加适量水, 搅拌并稍加热溶解后加5.71ml冰乙酸,加水至100ml.3．6⨯上样缓冲液：0.25% 溴酚兰, 40%(w/v)蔗糖水溶液。
4．溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。
5．DNA分子量标准：λDNA/EcoR I/Hind III:λDNA/EcoR I: 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9,和2.5kbλDNA/ Hind III: 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb.一、实验步骤1．电泳缓冲液可选用0.5×TBE或1×TAE，前者缓冲能力较后者强，但不适用于从胶中回收DNA，建议只采用1×TAE用于琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖用电泳缓冲液配制。
2．胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml 三角烧瓶中，进入50ml 的1×TAE稀释缓冲液，放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化，取出混匀。
3．胶板的制备：将二端封闭的电泳槽置于水平支持物上，插上样品梳子。
在冷却至50~600C的琼脂糖胶液中加入EB溶液至终浓度为0.5μg/ml, 即10mg/ml 的母液加2.5ul，混匀。
小心地倒入电泳槽中至一定高度。
待胶液完全凝固后拔出梳子。
然后向槽内加1×TAE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板表面。
1．胶的浓度因DNA长度而异：基因组DNA，λDNA 0.4-0.5%质粒(3-5kb) 0.7%3-1kb 0.7-1.0%1-0.5kb 1.0-1.5%4． <0.5kb 2.0%5．加样：取2-5μl样品加1μl 的6⨯上样缓冲液，用移液枪混匀（在Parafilm膜上操作），小心加到样品槽中。
同时加DNA分子量标准对照。
6．电泳：从负极到正极，60-80V, (电泳电压以5V/cm为宜, 即电泳槽的长度×5)电流40mA以上。
当溴酚兰条带移动至距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
7．观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下，观察DNA电泳带并估计其分子量大小。
同时可用加红色滤光片和近摄镜片的相机拍照（光圈5.6下暴光10-120秒）。
实验四、聚合酶链式反应(PCR)扩增PCR反应：1体系：取0.5ml 的eppendorf 管中依次加入效率试剂（共40.5μl）:35μl H25μl 10XPCR反应缓冲液4μl 25mmol/L MgCl24μl 4种 dNTP0.5μl 上游引物（引物1）0.5μl 下游引物（引物2）0.5μl 模板DNA(约1ng)0.5ul TaqDNA聚合酶（约2.5单位）混匀后离心5秒钟2程序：混合物在94℃下加热5min94 ℃变性30秒种，62℃退火一分钟，72℃延伸2分钟，循环35轮，进行PCR。
最后一轮循环结束后，于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
电泳：取10ul扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
实验五、DNA片段的回收DNA凝胶回收试剂盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0操作方法操作流程见图1，全套操作约需30分钟，详细说明如下。
1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。