基因工程实验的详细步骤

基因工程实验

实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化

试剂

A.LB液体培养基（L）: 1000ml

蛋白胨（tryptone）10g,

酵母提取物（yeast extract）5g,

NaCl 10g,

加去离子水至1000ml

用5MNaOH调至pH7.2-7.5。121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。

B.LB固体培养基（L）：

每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。

C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。

Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。

D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/L

EDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。

E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.

F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.

G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/L

NaCl, 终浓度为10mg/ml。100 o C加热15分钟，冷却后分装。

H.饱和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的

0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，

使pH达到7.6以上。

I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。

J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。

K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。

三、操作步骤

1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37 o C培养约12小时至

对数生长后期。

2．质粒DNA的少量快速提取---碱裂解法

A.取1.5ml培养液倒入1.5ml ependorf 管中，4o C下12000g离心3min。

B.弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。

C.菌体沉淀重悬浮于100μl预冷的溶液I中（激烈震荡，充分混匀）。

D.加入新配制的溶液II 200μl，快速盖紧管口，并倒置离心管，温和颠

倒ependorf管6-8次，以混匀内容物（千万不要震荡）,放置5分钟。

E.加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒

ependorf管数次，以混匀内容物，放置5分钟。4o C下12000g离心5-10

分钟。

F.将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1：1）(吸

取酚/氯仿试剂瓶中的下层溶液)，震荡混匀，4o C下12000g离心5分

钟。

G.将上清液（水相）移入干净ependorf管中，加入等体积的氯仿/异戊

醇(吸取氯仿/异戊醇剂试瓶中的下层溶液)，震荡混匀，4o C下12000g

离心5分钟。

H.将上清液（水相）移入干净ependorf管中，加入2倍体积的无水乙

醇，震荡混匀后置于-20o C冰箱中20分钟。然后在 4o C下12000g离心

10分钟。

I.弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使液体流尽。加入0.3ml 70%

乙醇洗涤沉淀。4o C下12000g离心5-10分钟。

J.吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流尽，室温干燥或真空干燥10分钟

K.将沉淀溶于20μl TE缓冲液（pH8.0, 含20μg/ml Rnase A）中，储于-20o C冰箱。

实验二、基因组DNA的提取

1.1 材料

1.1.1植物材料

银杏等木本植物。

1.1.2 主要试剂

CTAB抽提液：1g CTAB，5ml 1M Tris，2ml 500mM EDTA，4.1g Nacl至50ml。

(2% CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0)

CTAB/NaCl：10g CTAB，4.1g NaCl，溶解后定容至100ml。(10% CTAB，0.7M NaCl) TE/NaCl：0.5ml 1M Tris，10μl 500mM EDTA，2.9g NaCl，至50ml。(10mM Tris，

0.1mM EDTA，1M NaCl，pH8.0)。

RNase: 溶于10mM Tris.Cl(pH7.5)，15mM NaCl溶液中，配成10mg/ml浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，添加等体积甘油后贮

于-20度。

3 mol/L NaAc(pH 5.2)，氯仿:异戊醇（24:1）。β-巯基乙醇，氯仿，异丙醇，异戊醇，饱和酚，无水乙醇，不溶性PVP等。

上述药品及Lambda DNA/Hin dIII均购自上海生物工程公司。

1.2改进的CTAB法

根据文献（Frederick M. et al.，1998）CTAB法，稍做改进。

具体步骤：

① 吸取8ml CTAB抽提液，加入320μl β-巯基乙醇，混匀，预热至65℃；

② 称取0.5克叶片，置于事先用液氮预冷的研钵中，快速加入适量不溶性PVP，加入液氮研磨成粉未；

③ 迅速将粉未倒入至CTAB抽提液中，摇匀，65℃保温1h，期间每隔5min 摇匀一次；