基因工程基本操作四个步骤
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基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两段
编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________
2、获取目的基因的常用方法有哪些?
（1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
PCR技术—聚合酶链式反应
概念：
是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术
原理：
DNA双链复制的基本原理
PCR扩增仪
前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列
条件： 模板DNA
(含有目的基因)
四种脱氧核苷酸dNTP 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物 温度控制
指数 方式扩增，即____ ④方式：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数）
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点
鸟枪法
操作简便 广泛使用
专一性强
反转录法
根据已知氨基 专一性最强 酸合成DNA法
缺点 工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因 操作过程麻烦， mRNA很不稳定，要 求的技术条件较高 仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因
思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物 体内提取不行吗?
利用PCR技术扩增目的基因
(二)利用PCR技术扩增目的基因 选修1 P60
多聚酶链式反应 ，是一项 ① 概念：PCR全称为_______________ 体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术 在生物____ ___________ DNA双链复制 ②原理：__________ 已知基因的核苷酸序列 、 ③条件：_______________________ 四种脱氧核苷酸 、___________ 一对引物 (做启动子)、 _______________ DNA聚合酶 前提条件： ___________. 指数 方式扩增，即____ ④方式：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑤结果：
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程： a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 氢键 断裂，形成___________ 单链DNA 在热作用下，_____ b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 双链 。 物与DNA模板结合，形成局部________ c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 DNA链 。 的________
(一)从基因文库中获取目的基因
1.基因文库
将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中， 各个受体菌分别含有这种生物的不同基 因，称为基因文库
基因文库 基因组文库（某物 种全部基因 ） 部分基因文库 （如:cDNA文库）
(一)从基因文库中获取目的基因
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 ①鸟枪法： (直接分离法) 供体细胞中的DNA 限制酶 许多DNA片段
(单链RNA/单链DNA)
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶 双链DNA(目的基因)
（cDNA文库）
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得
源自文库
③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
蛋白质的氨基酸序列 根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测 推测 出相应的信使RNA序列， mRNA的核苷酸序列 然后按照碱基互补配 推测 对原则，推测出它的 结构基因的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法， 化学合成 以单核苷酸为原料合 目的基因 成目的基因。
与载体连接载入
目的基因 分离
运载体 导入 受体细胞
（基因组文库）
外源DNA扩增
产生特定性状
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 目的基因的mRNA
②反转录法：
以目的基因转录成的 信使RNA为模板，反转录 成互补的单链DNA，然后 在酶的作用下合成双链 DNA，从而获得所需的基 因。
反转录酶 杂交双链
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两段
编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________
2、获取目的基因的常用方法有哪些?
（1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
PCR技术—聚合酶链式反应
概念：
是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术
原理：
DNA双链复制的基本原理
PCR扩增仪
前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列
条件： 模板DNA
(含有目的基因)
四种脱氧核苷酸dNTP 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物 温度控制
指数 方式扩增，即____ ④方式：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数）
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点
鸟枪法
操作简便 广泛使用
专一性强
反转录法
根据已知氨基 专一性最强 酸合成DNA法
缺点 工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因 操作过程麻烦， mRNA很不稳定，要 求的技术条件较高 仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因
思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物 体内提取不行吗?
利用PCR技术扩增目的基因
(二)利用PCR技术扩增目的基因 选修1 P60
多聚酶链式反应 ，是一项 ① 概念：PCR全称为_______________ 体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术 在生物____ ___________ DNA双链复制 ②原理：__________ 已知基因的核苷酸序列 、 ③条件：_______________________ 四种脱氧核苷酸 、___________ 一对引物 (做启动子)、 _______________ DNA聚合酶 前提条件： ___________. 指数 方式扩增，即____ ④方式：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑤结果：
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程： a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 氢键 断裂，形成___________ 单链DNA 在热作用下，_____ b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 双链 。 物与DNA模板结合，形成局部________ c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 DNA链 。 的________
(一)从基因文库中获取目的基因
1.基因文库
将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中， 各个受体菌分别含有这种生物的不同基 因，称为基因文库
基因文库 基因组文库（某物 种全部基因 ） 部分基因文库 （如:cDNA文库）
(一)从基因文库中获取目的基因
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 ①鸟枪法： (直接分离法) 供体细胞中的DNA 限制酶 许多DNA片段
(单链RNA/单链DNA)
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶 双链DNA(目的基因)
（cDNA文库）
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得
源自文库
③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
蛋白质的氨基酸序列 根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测 推测 出相应的信使RNA序列， mRNA的核苷酸序列 然后按照碱基互补配 推测 对原则，推测出它的 结构基因的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法， 化学合成 以单核苷酸为原料合 目的基因 成目的基因。
与载体连接载入
目的基因 分离
运载体 导入 受体细胞
（基因组文库）
外源DNA扩增
产生特定性状
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 目的基因的mRNA
②反转录法：
以目的基因转录成的 信使RNA为模板，反转录 成互补的单链DNA，然后 在酶的作用下合成双链 DNA，从而获得所需的基 因。
反转录酶 杂交双链