基因工程操作步骤.ppt
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2 原理：DNA复制 原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷 酸；热稳定DNA聚合酶
3 前提： 已知目的基因的一段核苷酸序列
aP、CDRNA技变术性的（操90℃作-过95程℃）：
双链DNA模板在热作用下，
氢___键__断裂，形成_单__链___D_N_A
b、退火（复性55℃-65℃）： 系统温度降低，引物与DNA
1、从基因文库中获取
种 基因组文库：含有一种生物的全部基因 类 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心
1 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可 以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达 和发挥作用。
2 基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子 +终止子+标记基因
二、基因表达载体的构建——核心 1.过程:
（1）用一定的_限__制__酶____切 割质粒，使其出现一个切口 ，露出_____黏__性__末__端_。
（2）用同__一__种__限__制__酶_切断目 的基因，使其产生相__同___ 的_黏__性__末__端_____。
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因 的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的 位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达 产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2.利用PCR技术扩增目的基因
1 概念： PCR全称为_多__聚__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物体__外__复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术。
（3）将切下的目的基因片段插入质粒的__切__口__ 处，再加入适量_D_N_A_连__接__酶___，形成了一个重组
1.2 基因工程的基本操作程序
知识回顾： 基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因，我们才能赋
1、目的基因的获取 予一种生物以另一种生物的 遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2、基因表达载体的构建 定存在，并可进行遗传、表 达和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达，
3、目的基因导入受体细胞 才能实现一种生物的基因在 另一种生物中的转化。
模板结合，形成局部双链
________。
c、延伸（70℃-75℃）：在 Taq酶的作用下，合成与模
板互补的_D_N__A_链___。
d.重复a.b.c步骤：每重复 一次，目的基因增加_一__倍
5/G—G
5/ 引物Ⅱ 3/
3/
G—G C—C
T—C 3/ 3/ A—G 5/
引物Ⅰ
G—A 5/
变性 复性
原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
基 编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断
因
结
①不编码蛋白质。
构 非编码区 ②调控遗传信息表达,上
游有RNA聚合酶结合位点:
真核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游
终止子
与RNA聚合酶 结合位点 外显子
内含子
基
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
因
内含子：不能编码蛋白质的序列
结 非编码区 ：有调控作用,上游有RNA聚合
构
酶结合位点(启动子)。
1. 从基因文库中获取目的基因
1. 基因文库的概念:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受 体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同 基因。
2. 基因文库的种类:
b、复性（55℃-60℃）：系统温度DN降A低，引物 与DNA模板结合，形成局部__双__链____。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 从
引物的D5N′A端→3′端延伸，合成与模板互补 的___链_____。
3. 人工合成法
在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可
以利用DNA合成仪人工合成
才能确定目的基因是否真正
4、目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
2 获取目的基因的常用方法： 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
基因组DNA文库与cDNA文库
某生物体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接导入
受体菌群体
基因组文库
某种生物某个时期的mRNA
反转录 cDNA
与运载体连接导入
受体菌群体
cDNA文库
真核细胞的cDNA的获取
四种脱氧核苷酸、 模板、酶、引物
解旋酶催化解旋
DNA在高温下变性解旋
细胞内的DNA聚合酶、 解旋酶、DNA连接酶等
热稳定的DNA聚合酶
半保留复制、 边解旋变复制
半保留复制、 全解旋再复制
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
随堂闯关 PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 氢断键裂，形成____单__链_
1.目的基因DNA受热变性，解链； 2.引物与单链互补结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。
延伸
③过程：
PCR技术的操作过程
PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增
PCR技术扩增与DNA复制的比较
主要在细胞核内 碱基互补配对原则
体外复制 碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸、模 板、酶、ATP
非编码区 基因 启动子
不含非编码 序列。即不 含非编码区
和内含子
编码区
非编码区
转录 剪接 逆转录 复制
终止子
RNA聚合酶 剪接有关的酶
mRNA前体
mRNA
逆转录酶
单链DNA DNA聚合酶
cDNA
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
源自文库
③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因
蛋白质的氨基酸序列
推测
mRNA的核苷酸序列
推测
基因的核苷酸序列
化学合成
目的基因
思考：化学法合
成的目的基因含内含 子、启动子和终止子 吗？
人工合成法（真核生物）
反转录法 目的基因的信使RNA
单链DNA
合成
目的基因
化学合成法
肽链氨基酸序列
推测
信使RNA序列
推测
基因的核苷酸序列
合成
目的基因
课堂小结
目的基因的获取
3 前提： 已知目的基因的一段核苷酸序列
aP、CDRNA技变术性的（操90℃作-过95程℃）：
双链DNA模板在热作用下，
氢___键__断裂，形成_单__链___D_N_A
b、退火（复性55℃-65℃）： 系统温度降低，引物与DNA
1、从基因文库中获取
种 基因组文库：含有一种生物的全部基因 类 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心
1 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可 以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达 和发挥作用。
2 基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子 +终止子+标记基因
二、基因表达载体的构建——核心 1.过程:
（1）用一定的_限__制__酶____切 割质粒，使其出现一个切口 ，露出_____黏__性__末__端_。
（2）用同__一__种__限__制__酶_切断目 的基因，使其产生相__同___ 的_黏__性__末__端_____。
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因 的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的 位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达 产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2.利用PCR技术扩增目的基因
1 概念： PCR全称为_多__聚__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物体__外__复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术。
（3）将切下的目的基因片段插入质粒的__切__口__ 处，再加入适量_D_N_A_连__接__酶___，形成了一个重组
1.2 基因工程的基本操作程序
知识回顾： 基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因，我们才能赋
1、目的基因的获取 予一种生物以另一种生物的 遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2、基因表达载体的构建 定存在，并可进行遗传、表 达和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达，
3、目的基因导入受体细胞 才能实现一种生物的基因在 另一种生物中的转化。
模板结合，形成局部双链
________。
c、延伸（70℃-75℃）：在 Taq酶的作用下，合成与模
板互补的_D_N__A_链___。
d.重复a.b.c步骤：每重复 一次，目的基因增加_一__倍
5/G—G
5/ 引物Ⅱ 3/
3/
G—G C—C
T—C 3/ 3/ A—G 5/
引物Ⅰ
G—A 5/
变性 复性
原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
基 编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断
因
结
①不编码蛋白质。
构 非编码区 ②调控遗传信息表达,上
游有RNA聚合酶结合位点:
真核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游
终止子
与RNA聚合酶 结合位点 外显子
内含子
基
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
因
内含子：不能编码蛋白质的序列
结 非编码区 ：有调控作用,上游有RNA聚合
构
酶结合位点(启动子)。
1. 从基因文库中获取目的基因
1. 基因文库的概念:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受 体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同 基因。
2. 基因文库的种类:
b、复性（55℃-60℃）：系统温度DN降A低，引物 与DNA模板结合，形成局部__双__链____。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 从
引物的D5N′A端→3′端延伸，合成与模板互补 的___链_____。
3. 人工合成法
在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可
以利用DNA合成仪人工合成
才能确定目的基因是否真正
4、目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
2 获取目的基因的常用方法： 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
基因组DNA文库与cDNA文库
某生物体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接导入
受体菌群体
基因组文库
某种生物某个时期的mRNA
反转录 cDNA
与运载体连接导入
受体菌群体
cDNA文库
真核细胞的cDNA的获取
四种脱氧核苷酸、 模板、酶、引物
解旋酶催化解旋
DNA在高温下变性解旋
细胞内的DNA聚合酶、 解旋酶、DNA连接酶等
热稳定的DNA聚合酶
半保留复制、 边解旋变复制
半保留复制、 全解旋再复制
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
随堂闯关 PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 氢断键裂，形成____单__链_
1.目的基因DNA受热变性，解链； 2.引物与单链互补结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。
延伸
③过程：
PCR技术的操作过程
PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增
PCR技术扩增与DNA复制的比较
主要在细胞核内 碱基互补配对原则
体外复制 碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸、模 板、酶、ATP
非编码区 基因 启动子
不含非编码 序列。即不 含非编码区
和内含子
编码区
非编码区
转录 剪接 逆转录 复制
终止子
RNA聚合酶 剪接有关的酶
mRNA前体
mRNA
逆转录酶
单链DNA DNA聚合酶
cDNA
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
源自文库
③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因
蛋白质的氨基酸序列
推测
mRNA的核苷酸序列
推测
基因的核苷酸序列
化学合成
目的基因
思考：化学法合
成的目的基因含内含 子、启动子和终止子 吗？
人工合成法（真核生物）
反转录法 目的基因的信使RNA
单链DNA
合成
目的基因
化学合成法
肽链氨基酸序列
推测
信使RNA序列
推测
基因的核苷酸序列
合成
目的基因
课堂小结
目的基因的获取