基因工程制药课件
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第三章 基因工程制药ppt课件
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46
5、原位杂交检测
根据插入DNA片 段的序列设计并 合成探针，以此 搜寻筛选含有目 的基因的目的重 组子。
DNA同源序列之 间的特异性互补 杂交是该技术的 基本理论依据
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47
6、序列测定 双脱氧测序
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48
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49
双脱氧末端终止测序法的基本反应： GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA
29
PCR的基本原理 PCR反应条5件5℃ Taq PCR过程 PCR的特点 Taq
Taq
Taq
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30
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第2轮结束
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31
模板DNA
第 第12轮 轮P扩扩C增增R的基本原理
第3轮 扩P增CR反应条件
PCR过程 PCR的特点
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24
PCR的基本原理
12
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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25
模板DNA
95℃
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26
PCR的基本原理
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9
• 我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。α1b 型 基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生 物高科技成果，于1997年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药 证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工 程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究 开发中的也有10余种。
基因工程制药多图版ppt课件
第一步：了解基因的本质
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1
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2
四种碱基互补配对原则
生命的信息全部存储在DNA列里。
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3
发现者沃森和克里克获得了 诺贝尔奖。
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真正的背后英雄 不应被遗忘，她 是富兰克林。
4
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感 受 造 化 的 神 奇
5
第二步：了解基因工程制药的基本过程
17
实验室常见的微生物
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18
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6
放大培养
摇瓶培养Βιβλιοθήκη 精选PPT课件7倒入离心管 或离心瓶
放入离心机
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离心效果
8
细胞破碎
超声破碎
高压匀浆破碎
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胀破
9
分离纯化
亲和色谱
盐析
透析
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凝胶色谱
10
分离纯化
电泳槽加样
电泳
电泳结果
凝胶电泳分离
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11
第三步：熟悉部分相关过程实体设备 和操作对象
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12
分离纯化实体设备
色谱分离设备
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13
透析设备
磁力搅拌器
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透析效果示例
14
凝胶电泳设备
基因工程制药培训(共79张PPT)
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
目的基因的获得
常用的方法:
一、反转录法 二、反转录PCR 三、化学合成法
一、反转录法
mRNA
为了克隆编码某种特异蛋白质
反转录酶
多肽的DNA序列，可以从产生该蛋
白质的真核细胞中提取mRNA, 以 其为模板，在反转录酶的作用下， 反转录生成该蛋白质mRNA互补 DNA（cDNA第一链），再以cDNA 第一链为模板，在DNA聚合酶Ⅰ作 用下，最终合成编码该多肽的双链
2004
1997
2005
1998
2006
什么是基因工程技术？
基因工程（genetic engineering）：也称基因操作、遗传工 程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不同生物的
遗传物质——基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传
物质重新组合，然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转 入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要 的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新 的生物类型。
下 游 阶 段
基 因 的 克 隆
工具酶 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
功
能
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 合成Байду номын сангаас链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成， 双链DNA 3末端标记等 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
基因工程制药-4纯化.质控PPT课件
离心技术
利用离心力将不同密度的组分 进行分离，如沉降和离心过滤 等。
沉淀法
利用溶解度差异或化学反应使 目标分子沉淀下来，与其他组 分分离。
其他技术
如超临界流体萃取、逆渗透、 电泳等。
纯化技术的优缺点比较
离心技术
优点是操作简便、成本低；缺点是对 大型分子分离效果有限。
过滤与膜分离
优点是高效、连续操作；缺点是需要 定期更换膜材料，且对某些小分子物 质的截留效果不佳。
随着技术的不断进步和应用领域的拓 展，基因工程制药产业将逐步升级， 形成完整的产业链和产业集群，推动 行业的可持续发展。
加强基础研究
未来将继续加强基因工程制药的基础 研究，深入探索基因功能和疾病发生 发展的机制，为药物研发提供更多理 论支持。
THANKS
感谢观看
基因工程制药的特点包括：能够大规模、高效地生产药物， 提高药物的产量和纯度；能够生产传统方法难以获得的药物 ，如蛋白质、多糖等大分子药物；能够降低生产成本，提高 药物的品质和安全性。
基因工程制药的历史与发展
基因工程制药的历史可以追溯到 20世纪70年代，当时科学家开 始尝试利用重组DNA技术生产
药物。
无副作用。
有效性标准
确保基因工程制药产品 具有明确的治疗效果， 能够达到预期的治疗目
标。
均一性标准
确保基因工程制药产品 的质量和性能稳定，批
次间差异小。
稳定性标准
确保基因工程制药产品 在储存和运输过程中性
能稳定，不易变质。
质量控制的方法与流程
原料控制
对原料进行质量检查，确保符合质量标准。
成品检验
对最终产品进行全面的质量检验，包括理化 指标、生物学指标等。
《基因工程制药技术》课件
02
该系统可用于生产具有治疗价值 的蛋白质药物，如疫苗、抗体等
。
转基因植物表达系统的优点是生 产成本低，且易于大规模生产。
03
缺点是可能存在食品安全和环境 问题，需要加强监管和控制。
04
04 基因工程制药的挑战与前 景
安全性问题
基因工程制药产品的安全性是首要考 虑的问题，需要经过严格的临床试验 和审批程序，确保产品的安全性和有 效性。
02 基因工程制药技术的基本 原理
基因克隆与表达
基因克隆
01
通过特定的方法将目的基因从生物体中分离出来，并在体外进
行复制和扩增的过程。
基因表达
02
在细胞内，基因通过转录和翻译过程，将遗传信息转化为蛋白
质的过程。
基因克隆与表达在制药工业中的应用
03
利用基因克隆技术获取药物靶点基因，通过基因表达技术生产
未来发展前景与展望包括开发更加高效和精准的基因工程制药技术、拓展新的治 疗领域和应用范围、降低生产成本和提高可及性等，需要加强研发和创新投入， 推动基因工程制药技术的可持续发展。
பைடு நூலகம்
05 基因工程制药的案例分析
胰岛素的基因工程生产
总结词
通过基因工程技术，将胰岛素基因转入到大肠杆菌或 酵母菌中，实现大规模生产。
感谢您的观看
THANKS
具有生物活性的蛋白质药物。
重组DNA技术
01
重组DNA技术
通过人工方法将不同来源的DNA片段进行剪切、拼接和重组，形成新
的DNA分子。
02
重组DNA技术在制药工业中的应用
利用重组DNA技术构建基因表达载体，将目的基因导入受体细胞，实
现目的基因的高效表达。
第三章基因工程制药1节ppt课件
目前TNF经鉴定有3种
1)主要由激活巨噬细胞产生的TNF-α；
(2)主要由激活淋巴细胞产生的INF-β，又名淋 巴细胞毒素(LT)；
(3)由NK细胞产生的细胞毒因子TNF-γ。
(NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞，具有广泛的 生物学功能，位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防 线。NK细胞作为天然免疫的主要效应细胞，在感染性疾 病的防治、肿瘤的生物治疗以及骨髓移植中发挥了不可 替代的作用。皮肤黏膜组织是机体的重要免疫器官之一， 是阻挡病原微生物入侵的天然屏障，而NK细胞是这一屏 障的主要效应细胞之突变 体主要有：
(1)将原型TNF分子中第80、90和92位的Ile、
Lys和Asn分别被Ser、His和Val置换，经E. coli表达产生rhTNFαD3a产物，毒性比原型
TNF低11倍左右；
(2)将TNF—αN末端的第2位Arg换成Lys，
在及E. coli中表达TNF—K2产物，对某些人
国际上已进入临床试验的抗肿瘤重组导向 毒素
基因工程抗肿瘤药物 目前进入临床试验的基因组重组抗血管生
成药物 转基因养殖动物的乳汁产生的人生物医药 转基因植物生产的药物蛋白
部分基因工程药物简介：
1、人胰岛素(InsuIin)
胰岛素是多肽激素的一种，具有多种生理功能，在 维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋 白质的合成、调节与控制细胞内多种代谢途径等方 面都有重要作用。胰岛素用于临床糖尿病的医治已 有近70年的历史，长期以来，其来源仅仅是从动物 的胰脏中提取，而动物胰岛素与人胰岛素在氨基酸 组成上存有一定的差异，长期注射人体时会产生自 身免疫反应，影响治疗效果。自80年代初开始，人 们已开始用基因工程技术大量生产人胰岛素。
④内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不 足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改 造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸 是游离的，有可能引起—S—S—键的错配而导致 活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸， 白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高。 ⑤利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药 物筛选来源。
《基因工程制药》课件
、改变细胞特性等。
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
5.1基因工程制药PPT课件
• 2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化， 它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立， 新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的 开发，分离纯化的优第化14页控/共制71页，高纯度纯品的制备 技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制 造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、 （5）、（6）、（7）、（8）等属于下游阶段。
第30页/共7表1页达用的酵母宿主菌应具备： ①菌体生长力强。 ②菌体内蛋白酶要较弱。 ③菌株性能稳定。 ④ 分泌能力强。
（四）动物细胞中的基因表达
哺乳动物细胞表达外源基因的主要优点 ——能识别和剪切外源基因中的内含子 并加工为成熟的mRNA。
❖中国仓鼠卵巢细胞（CHO） ❖猴肾细胞（COS）
CHO细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还原 酶（DHFR），经转染第3可1页将/共7D1页HFR重组至细胞中， 含有DHFR表达载体的重组CHO细胞，经氨甲喋呤 （MTX）培养筛选后可选择出克隆表达异源基因的 重组细胞。
• 逆转录－（聚三合）酶反R应T-法P。C该R方法是mRNA经逆转录合成cDNA
第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用 PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。
第21页/共71页
二、基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、 翻译以及所有加工过程。
基因表达研究是指外源基因在某种细胞中 的表达活动，即剪切下一个外源基因片断， 拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得 既有原生物活性又可高产的表达产物。
常用的表达载体： （1）pBV220系统 （2）pET系统
第26页/共71页
2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 （①3）启表动达子产的物强的弱稳定性 （②4）核细糖胞体的结代合谢位负点荷 （③5）SD工序程列菌和的起培始养密条码件子ATG的间距
第30页/共7表1页达用的酵母宿主菌应具备： ①菌体生长力强。 ②菌体内蛋白酶要较弱。 ③菌株性能稳定。 ④ 分泌能力强。
（四）动物细胞中的基因表达
哺乳动物细胞表达外源基因的主要优点 ——能识别和剪切外源基因中的内含子 并加工为成熟的mRNA。
❖中国仓鼠卵巢细胞（CHO） ❖猴肾细胞（COS）
CHO细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还原 酶（DHFR），经转染第3可1页将/共7D1页HFR重组至细胞中， 含有DHFR表达载体的重组CHO细胞，经氨甲喋呤 （MTX）培养筛选后可选择出克隆表达异源基因的 重组细胞。
• 逆转录－（聚三合）酶反R应T-法P。C该R方法是mRNA经逆转录合成cDNA
第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用 PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。
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二、基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、 翻译以及所有加工过程。
基因表达研究是指外源基因在某种细胞中 的表达活动，即剪切下一个外源基因片断， 拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得 既有原生物活性又可高产的表达产物。
常用的表达载体： （1）pBV220系统 （2）pET系统
第26页/共71页
2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 （①3）启表动达子产的物强的弱稳定性 （②4）核细糖胞体的结代合谢位负点荷 （③5）SD工序程列菌和的起培始养密条码件子ATG的间距
生物制药--基因工程制药--ppt课件可编辑全文
组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 （oligo-dT 亲和层析法）
• 借助于逆转录酶，以 mRNA 为模板，以 oligo-dT 为引物， 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链； • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增，即“逆转录
－PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法：将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段，然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增， 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性，酶切位点丰富。含 T7lac 启动子；含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签，便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC（平末端）
Haemophilus parainfluenzae
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概述
• 20世纪70年代，DNA重组技术诞生，医药领域 • 1982年，人胰岛素问世 • 国内，1989年，干扰素批准上市；1992年，乙肝疫苗 大量生产，应用临床，深入研究， 扩大应用，改造不足
基因工程技术：目的基因插入载体，转入新的
宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传 物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行 复制和表达的技术
2.2 生长与遗传特征
• 孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍 体细胞结合形成二倍体结合子或营养细胞，进行 芽殖。 • 生长繁殖迅速，倍增期约2小时。 • 酿酒酵母有17条染色体。 • 1996年完成其基因组测序，遗传背景已相当清楚 。 • 基因组：120.68Mb，5887个ORF,编码约6000个基 因
质粒载体
复制起始点 多克隆位点 选择标记
1.2 质粒类型 • 严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少 数几个拷贝的质粒，pSC101。 • 松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至 几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。 • 克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。 • 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整 合。 • 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。 • 表达质粒：能表达基因产物。
• G-，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜 ，裂殖。 • 菌落：白色至黄白色，光滑，直径2-3mm • 生化与遗传特性 能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机 盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。 • 基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质 • 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒
1.5 应用 • 多肽类（甲状旁腺激素（1-34）、利尿钠肽）。 • 激素：胰岛素及2种突变体、抗生素 • 细胞因子类：干扰素α、β、γ，，白介素-2、-11 、-1拮抗剂 • 溶栓酶类：rPA • 白喉毒素-IL2、融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗） 等。
2、酵母表达系统
2.1 形态特征 • 单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。 • 繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生 子囊孢子。 • 菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。
• (2) DNA连接酶
5’ 3’ G-OH CCTAG-P
＋
P-GATCC OH-G
3’ 5’
DNA连接酶，Mg2+
5’
3’ GGATCC CCTAGG 3’ 5’
• (3) 聚合酶 DNA聚合酶，RNA聚合酶， 反转录酶
• 2.2表达载体的设计 表达载体：在质粒载体的基础上，在多克 隆位点插入外源基因表达盒所构成的载体 。 • 外源基因表达盒（调控元件）
二、基因工程制药基本环节
• • • • 1、基因工程技术基本流程 2、工具酶及表达载体构建 3、工程菌的建立 4、重组蛋白的分离纯化与分析鉴定
• 1、基因工程技酶切，连接
遗传转化与筛选
外源基因导入与 培养
工程菌
2、工具酶及表达载体构建 • 2.1工具酶 • (1)限制性核酸内切酶 回文序列 EcoRⅠ 粘性末端：G AATTC CTTAA G 平末端 : GCC GGC CGG CCG
1.3 产物表达形式
• 不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体 • 可溶性蛋白质：存在于细胞质
• 周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质， 可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解， 避免N端附加蛋氨酸。 • 胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到 胞外的培养液中。
1.4 优点和不足 • 发展最早、应用最广泛的经典的表达系统 。 • 具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高 （高达70%），培养周期短，抗污染能力强 。 • 不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化） 蛋白表达。 • 细胞死亡后，细胞壁多糖游离出来，形成 内毒素，具有抗原性，产生热源。 • N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。
PCR反应原理与过程
95℃,变性
56℃,退火
完成一个循环
72℃,延伸
PCR扩增产物
• 电泳： பைடு நூலகம் 目标基因片段大小， • 特异性
（2）酶切反应
• 在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产 生相应的限制性片段。 • 酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切 酶。 • 反应条件：适宜温度（37℃）,1小时以上 • 终止反应：加热；加入EDTA,螯合镁离子。 • 电泳检查，酶切完全性
基因工程菌
• 定义：以微生物为操作对象，通过基因工 程技术获得的表达外源基因或过量或抑制 表达自身基因的工程生物体 • 种类：原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆 菌、链霉菌） 真核细胞（酵母、丝状菌、哺乳动 物细胞）
一、基因工程制药微生物表达系统
1、大肠杆菌表达系统
1.1 大肠杆菌（Eschericlia coli ）
启动子
核糖体结合位点 终止子
2.3目标基因PCR定位克隆 • (1)PCR技术 • PCR (Polymerase chain reaction)： • 由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA序列进 行的复制反应。 • 本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基 因
PCR扩增的反应体系
• • • • • 模板DNA：目标序列，100-10 000 bp 引物：两条寡核苷酸，21-27 bp 脱氧核苷酸：4和dNTP, 即dATP，dCTP，dGTP,dTTP DNA聚合酶：Taq聚合酶，耐高温 缓冲液：KCl、Tris-HCl，MgCl2
2.4 应用
• 1981年，Hitzman等：酵母表达人干扰素
• 激素类：人胰岛素及突变体，尿酸水解酶 和水蛭素 • 细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子 • 多肽类：高血糖素 • 乙肝疫苗等
小结
• 表达系统：宿主菌+表达质粒 • 大肠杆菌系统 • 酵母系统
思考题
• （1）分析比较基因工程大肠杆菌和酵母表 达系统制药的优缺点，如何选择应用？ • （2）这两个系统生产了哪些重组蛋白质药 物？
2.3 优点与不足
• 五种类型------安全、无毒。 • 营养缺陷选择外来质粒。 • 培养条件简单、大规模培养技术成熟。 • 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和 加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。 • 酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。 • 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。
• 20世纪70年代，DNA重组技术诞生，医药领域 • 1982年，人胰岛素问世 • 国内，1989年，干扰素批准上市；1992年，乙肝疫苗 大量生产，应用临床，深入研究， 扩大应用，改造不足
基因工程技术：目的基因插入载体，转入新的
宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传 物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行 复制和表达的技术
2.2 生长与遗传特征
• 孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍 体细胞结合形成二倍体结合子或营养细胞，进行 芽殖。 • 生长繁殖迅速，倍增期约2小时。 • 酿酒酵母有17条染色体。 • 1996年完成其基因组测序，遗传背景已相当清楚 。 • 基因组：120.68Mb，5887个ORF,编码约6000个基 因
质粒载体
复制起始点 多克隆位点 选择标记
1.2 质粒类型 • 严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少 数几个拷贝的质粒，pSC101。 • 松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至 几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。 • 克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。 • 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整 合。 • 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。 • 表达质粒：能表达基因产物。
• G-，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜 ，裂殖。 • 菌落：白色至黄白色，光滑，直径2-3mm • 生化与遗传特性 能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机 盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。 • 基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质 • 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒
1.5 应用 • 多肽类（甲状旁腺激素（1-34）、利尿钠肽）。 • 激素：胰岛素及2种突变体、抗生素 • 细胞因子类：干扰素α、β、γ，，白介素-2、-11 、-1拮抗剂 • 溶栓酶类：rPA • 白喉毒素-IL2、融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗） 等。
2、酵母表达系统
2.1 形态特征 • 单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。 • 繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生 子囊孢子。 • 菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。
• (2) DNA连接酶
5’ 3’ G-OH CCTAG-P
＋
P-GATCC OH-G
3’ 5’
DNA连接酶，Mg2+
5’
3’ GGATCC CCTAGG 3’ 5’
• (3) 聚合酶 DNA聚合酶，RNA聚合酶， 反转录酶
• 2.2表达载体的设计 表达载体：在质粒载体的基础上，在多克 隆位点插入外源基因表达盒所构成的载体 。 • 外源基因表达盒（调控元件）
二、基因工程制药基本环节
• • • • 1、基因工程技术基本流程 2、工具酶及表达载体构建 3、工程菌的建立 4、重组蛋白的分离纯化与分析鉴定
• 1、基因工程技酶切，连接
遗传转化与筛选
外源基因导入与 培养
工程菌
2、工具酶及表达载体构建 • 2.1工具酶 • (1)限制性核酸内切酶 回文序列 EcoRⅠ 粘性末端：G AATTC CTTAA G 平末端 : GCC GGC CGG CCG
1.3 产物表达形式
• 不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体 • 可溶性蛋白质：存在于细胞质
• 周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质， 可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解， 避免N端附加蛋氨酸。 • 胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到 胞外的培养液中。
1.4 优点和不足 • 发展最早、应用最广泛的经典的表达系统 。 • 具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高 （高达70%），培养周期短，抗污染能力强 。 • 不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化） 蛋白表达。 • 细胞死亡后，细胞壁多糖游离出来，形成 内毒素，具有抗原性，产生热源。 • N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。
PCR反应原理与过程
95℃,变性
56℃,退火
完成一个循环
72℃,延伸
PCR扩增产物
• 电泳： பைடு நூலகம் 目标基因片段大小， • 特异性
（2）酶切反应
• 在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产 生相应的限制性片段。 • 酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切 酶。 • 反应条件：适宜温度（37℃）,1小时以上 • 终止反应：加热；加入EDTA,螯合镁离子。 • 电泳检查，酶切完全性
基因工程菌
• 定义：以微生物为操作对象，通过基因工 程技术获得的表达外源基因或过量或抑制 表达自身基因的工程生物体 • 种类：原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆 菌、链霉菌） 真核细胞（酵母、丝状菌、哺乳动 物细胞）
一、基因工程制药微生物表达系统
1、大肠杆菌表达系统
1.1 大肠杆菌（Eschericlia coli ）
启动子
核糖体结合位点 终止子
2.3目标基因PCR定位克隆 • (1)PCR技术 • PCR (Polymerase chain reaction)： • 由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA序列进 行的复制反应。 • 本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基 因
PCR扩增的反应体系
• • • • • 模板DNA：目标序列，100-10 000 bp 引物：两条寡核苷酸，21-27 bp 脱氧核苷酸：4和dNTP, 即dATP，dCTP，dGTP,dTTP DNA聚合酶：Taq聚合酶，耐高温 缓冲液：KCl、Tris-HCl，MgCl2
2.4 应用
• 1981年，Hitzman等：酵母表达人干扰素
• 激素类：人胰岛素及突变体，尿酸水解酶 和水蛭素 • 细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子 • 多肽类：高血糖素 • 乙肝疫苗等
小结
• 表达系统：宿主菌+表达质粒 • 大肠杆菌系统 • 酵母系统
思考题
• （1）分析比较基因工程大肠杆菌和酵母表 达系统制药的优缺点，如何选择应用？ • （2）这两个系统生产了哪些重组蛋白质药 物？
2.3 优点与不足
• 五种类型------安全、无毒。 • 营养缺陷选择外来质粒。 • 培养条件简单、大规模培养技术成熟。 • 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和 加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。 • 酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。 • 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。