重组碱性成纤维细胞生长因子制作工艺简述

bGFG分布
• 主要分布于垂体、脑和神经组织及视网膜、肾上腺、 胎盘等，尤以垂体含量最高，能纯化大量的bFGF（0.5 mg／kg），其它组织含量很少，约为其1／10～1／50。 bFGF不存在或以极低浓度存在于血清和体液中。
• bFGF 作为细胞分裂原，主要作用在起源于中胚层和神 经外胚层的骨骼肌细胞、成纤维细胞和骨细胞等，其受体 也相应的分布于上述细胞表面。FGF存在两类受体：一类 是亲和力受体，属跨膜性酪氨酸蛋白激酶类受体；另一类 是低亲和力受体，即肝素样受体，为硫酸乙酰肝素蛋白多 糖类物质。它们是一条单链多肽，约 110～150 KD，受体 数目约2×103～8×104／细胞，受体对bFGF的亲和力 KD＝18～80 pm。受体至少有4种形式，由细胞外区、跨 膜区、胞浆区的近膜区和酪氨酸激酶区组成，由于每种 FGF受体均能和FGF家族每个成员结合，而不同FGF受体 的表达存在着组织细胞特异性。bFGF与受体亲和力显著 大于aFGF 。
• 其主要生物学作用有：（1）作为血管生长因子； （2） 促进创伤愈合与组织修复；（3）促进组织再生；（4）参 与神经再生等。
重组牛碱性成纤维细胞生长因子介绍
• 1974年，英国Gospodarowicz教授从脑垂体中纯化出一 种细胞生长因子，因首先发现对BALT/C3T3细胞等成纤维 有明显的促分裂增殖活性，而被命名为碱性成纤维细胞生 长因子（bFGF）。
应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及 其他微生物污染。
• 1.1.3.5 生化反应
应符合大肠杆菌生物学性状。
• 1.1.3.6 牛碱性成纤维细胞生长因子表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
• 1.1.3.7 质粒检查
该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。
• 1.1.3.8目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
以上理论内容主要来自互联网
参考文献:《动物细胞培养基本技术指南》 ------【英】R.I.弗雷谢尼 著;章静波, 徐存拴 译
制作人：何尧 ^-^
1.1工程菌菌种
• 1.1.1名称及来源
重组牛碱性成纤维细胞生长因子工程菌株系由带有牛碱性 成纤维细胞生长因子基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
• 1.1.2 种子批建立
• 1.2.6 原液检定
分别测定其生物活性、蛋白质含量等数据。
1.1.3菌株检定
• 1.1.3.1 划种LB琼脂平板
应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
• 1.1.3.2 染色镜检
应为典型的革兰氏阴性杆菌。
• 1.1.3.3 对抗生素的抗性
应与原始菌种相符。
• 1.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做）
• 1.2.3 种子液接种及发酵培养
在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜温度下进行发酵， 应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温 度、PH值、溶氧、补料、发酵时间等。
• 1.2.4 发酵液处理
用适宜的方法处理菌体。
• 1.2.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 纯化
采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到各项要求，即 为牛碱性成纤维细胞生长因子原液。加入稳定剂，除菌过 滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。
二、相关检定
• 2.1 原液检定
• 2.2 半成品检定
2.2.1 生物活性检验 2.2.2 无菌检验
• 2.3 成品检定
三、 保存、运输
于2～8℃避光处保存和运输。自生产分装之日 起，按批准的有效期执行。
四、 使用说明
应符合“生物制品包装规程”的规定和批准的 内容。
最终产品图
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应符合 “生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
• 1.1.3 菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
1.2原液制备
• 1.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含 适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。
• 1.2.2 发酵用培养基
采用适宜的不含抗生素的培养基。
bFGF的生物学功能
• bFGF 的生物学效应分体内和体外两大部分。体外作用十 分强烈，成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、 肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有 很强的促细胞分裂增殖活性。体外细胞培养中能在低浓度 （1 mg•ml－1）发挥其作用。bFGF是重要的促有丝分裂 因子，也是形态发生和分化的诱导因子。
目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。
1.4 成品处理
• 1.4.1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。
• 1.4.2 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
• 1.4.3 规格 应为经批准的规格。
重组碱性成纤维细胞生长因子
工艺简述
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
• 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor , bFGF）含155个氨基酸残基的单链蛋白质，分子量为 18kD，是一种能促进各类细胞增殖的一种蛋白质分子， 具有相当广泛的生理功能。
• bFGF作用的靶细胞有成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨 细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、神经原、神经胶质细胞、 骨骼肌细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、肾上腺皮 质、髓质细胞等[4]。目前已有研究证实，它在促新生血管 生成、神经细胞及骨组织的再生，损伤愈合方面起着相当 重要的作用[5-10]。由此可见，bFGF在临床上将会有非常 广泛的应用前景。
• 本品系由高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠 杆菌，经发酵、分离和高度纯化后冻干制成。
• 成纤维细胞
• 外用重组牛碱性成纤维细 胞生长因子外包装
重组牛碱性成纤维细胞生长因子制备 及检验测定
一、 制备流程
• 1.1工程菌菌种 • 1.2原液制备 • 1.3半成品制备 • 1.4成品处理
• 30年来，各国学者们研究发现，bFGF通过与细胞膜上 的受体，广泛作用于外胚层、中胚层和内胚层多种来源的 细胞，包括上皮细胞、粘膜细胞、血管内皮细胞、平滑肌 细胞、骨骼肌细胞、卵巢颗粒细胞、成纤维细胞和神经细 胞等，都具有促丝裂原作用和趋化作用，是一种与组织创 伤的愈合过程密切相关的内源性活性因子，因此又被分子 生物学家称之为“人体愈合素”。