石蜡切片技术

石蜡切片制备技术

活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。

石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。石蜡切片法是将组织经过一系列药品处理，使石蜡渗入组织，包埋成蜡块，再把组织蜡块切成极薄的片子，根据不同的需要用不同的染色方法以显示不同细胞和组织的形态，以及细胞和组织中某些化学或特殊（如抗原）成份含量的变化。一、所需器材及试剂

1，器材

切片刀，切片机，恒温箱，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，铺片台，冷冻台，解剖刀，镊子，台木，毛笔，染色缸，盖玻片，载玻片，中性树胶，显微镜。

2，试剂

各种浓度的酒精（70%、80%、90%、95%、100%）、二甲苯、石蜡、苏木精染液，0.5%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液等。

二、石蜡切片制备过程

1，取材

采集病料要及时，以防组织变质发生自溶。病理组织材料要采取病变典型突出的部分，最好选病变与健康组织的交界处，以识别和探讨病变的发生和发展。

2，固定

采集样品在滤纸上吸干后迅速放入4％甲醛溶液中固定七天以上，使组织细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞原来的形态结构。

3，洗涤

切取约1cm×1cm×0.3mm固定好的组织，放入带盖的网槽中用自来水冲洗过夜，调节流量使水从底部缓慢流出。

4，脱水透明

组织经固定和水洗后含多量水分，水与透明剂、石蜡不能溶合，因此，在透明、浸蜡前必须进行脱水，把组织中的水份彻底驱除。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行。

为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。常用透明剂：二甲苯。

具体流程如下：

70％酒精（1h）--→80％酒精（55min）--→90％酒精（50min）--→95％酒精（45min）--→100％酒精（35min）--→1/2酒精+1/2二甲苯（15min）--→二甲苯1和二甲苯2（数秒）（此时组织光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。）

5，浸蜡

组织经过透明剂的完全透明后，移放于65℃左右熔化的石蜡中，于65℃的电热恒温箱中浸渍4h。

6，包埋

将熔化好的石蜡倒入包埋框约4mm，用加温的镊子将组织块切面朝下放入，按压使其接近底部，加满融化好的石蜡，放置冷冻机上冷却。

7，切片

包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。

将新切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

调整厚度调节器到所需的切片厚度，先调至20微米，右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔清扫蜡带，摇转速度不可太急。

等组织出现完全后调至5微米。观察蜡片，出现完整且不碎裂的蜡片后用毛笔轻轻将蜡带挑起，用沾水的牙签挑至铺片机上。

⑥用涂有蛋白甘油的载玻片捞起展开的蜡片，至中央位置

8，烤片

将载玻片放置恒温箱中50℃，2-3h。

9，HE染色

染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。常用HE染色法，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

①脱蜡复水

染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡。

脱蜡后切片须经高至低浓度的酒精处理后，水洗，使切片进入水分，才能使苏木精染液染细胞核。

②染色

切片放入苏木精中染色约3min。

③水洗

用自来水流水冲洗三次，将过多的苏木精洗掉。

④分化

将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约三十秒钟。

⑤漂洗

切片再放入自来水中去除分化液脱下的染料，终止分化作用。

⑥脱水1

再用酒精从低浓度到高浓度脱去水分。

⑦复染

用0.5%伊红染色。伊红主要染细胞质。

⑧脱水2

继续高浓度乙醇脱水。

⑨透明

二甲苯透明。

具体流程如下：

二甲苯1（5min）--→二甲苯2（5min）--→100％酒精（5min）--→95％酒精（4min）--→90％酒精（4min）--→80％酒精（4min）--→70％酒精（4min）--→蒸馏水（4min）--→苏木精（3min）--→水洗--→1％盐酸酒精分化（30s）--→自来水中返蓝（30min）--→70％酒精（4min）--→80％酒精（4min）--→90％酒精（4min）--→伊红（30~40s）--→95％酒精（4min）--→100％酒精1（5min）--→100％酒精2（5min）--→二甲苯1（5min）--→二甲苯2（5min）

10，封固

切片经染色后，取出切片，擦去多余二甲苯，滴一滴中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，晾干即可。

三、显微镜观察

10×，40×镜观察：

本切片为羊的肺部组织。

观察到的结构有：肺静脉，肺泡囊，肺动脉，细支气管，支气管，软骨等。

主要病变有:肺泡融合，破裂，出血；肺泡隔增宽；出现肉芽组织；有炎性细胞浸润；似有化脓灶。