微生物菌种操作方法汇总
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法(含扩增方法)定期移植法,亦称传代培养保藏法,包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中,最适条件下培养,待生长充分后,于4~6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下:1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿,如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等,经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水,按培养基配方称取各项材料,依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解,最后加足水量,搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温,根据要求加稀酸(0.1mol/L盐酸)或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌,防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂,如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中,加热并不断搅拌至融解,再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉,将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4~5mL),穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口,以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞,外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌,通常蒸汽灭菌为121℃,15~20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面,斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验,通常30℃培养1~3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌(如毛霉、根霉等)。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法包括以下几个方面：
1. 无菌操作：在进行微生物实验或培养时，需要保持操作环境的无菌。
操作者应注意洗手、穿戴实验服、戴手套，并在无菌工作台或无菌室内进行操作。
可用酒精灯或紫外线灯消毒操作区域，以杀灭空气中的微生物。
2. 培养基的制备：根据所需的微生物类型选择适当的培养基，并按照配方制备。
培养基通常包括基础培养基、食物源、pH调节剂和琼脂等成分。
制备时需要称取和溶解成分，并用高压蒸汽或高温灭菌来杀灭培养基中的微生物。
3. 培养器具的消毒：使用前要对培养器具进行消毒处理，常用的方法有高压蒸汽灭菌、高温灭菌、紫外线消毒等。
确保培养器具的表面和内部都不带有致病菌。
4. 菌种的接种：将所需的菌种接种到培养基上。
通常使用接种环、接种针或接种环针进行接种。
在接种时要注意无菌操作，以避免外来细菌的污染。
5. 培养条件：对于每一种微生物，根据其生长特性和要求，设置适当的培养条件。
例如，合适的温度、湿度、pH值和氧气浓度等都会影响微生物的生长。
6. 培养观察：在培养过程中，定期观察微生物的生长情况。
可以使用显微镜观察细菌或酵母菌的形态，或者通过目测观察细菌悬浊液的浑浊度和沉淀情况来判
断微生物是否生长良好。
7. 分离纯化：将培养基上生长的微生物单克隆分离纯化，得到纯系菌株。
通常可以使用藻糖水平板或琼脂斜面触点法进行分离，将不同的菌落孤立开来。
8. 培养维持：根据微生物的生长要求，每隔一段时间更换培养基、条件，以保持微生物的生长和繁殖。
同时，也需要妥善保存纯化的菌株，以备后续实验使用。
微生物菌种保藏管理中心操作指南
微生物菌种保藏管理中心操作指南保藏方法冷冻干燥法、-80℃冻结法、液氮超低温冻结法。
冷冻干燥保藏法将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
操作步骤如下：好氧菌冷冻干燥管的制备1 安瓿管准备安瓿管材料以中性玻璃为宜。
清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2 保护剂的选择和准备保护剂种类要根据微生物类别选择。
配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。
如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。
3 冻干样品的准备在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。
微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。
采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。
若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。
分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。
分装时应注意在无菌条件下操作。
4 预冻一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。
5 冷冻干燥采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
6 真空封口及真空检验将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。
熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
微生物常用的接种方法
微生物常用的接种方法微生物的接种是微生物学实验中的一个重要步骤，它是将微生物从一个培养基转移到另一个培养基的过程。
接种方法的选择对于微生物的培养和研究具有重要意义。
下面将介绍一些微生物常用的接种方法。
一、平板接种法。
平板接种法是将微生物接种在培养基的表面上，通过接种棒或铅笔头的方式在培养基表面画线或涂抹，形成菌落。
这种接种方法适用于培养革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，通常用于分离和计数微生物。
在进行平板接种时，需要注意接种的均匀性和细菌数量的控制，以避免产生过多或过少的菌落。
二、液体接种法。
液体接种法是将微生物接种在含有营养物质的液体培养基中，通过摇床或振荡器进行培养。
这种接种方法适用于培养需要大量微生物的情况，如大规模生产微生物菌种或进行微生物代谢产物的生产。
在进行液体接种时，需要注意培养液的搅拌速度和通气情况，以保证微生物的充分生长和代谢。
三、斜面接种法。
斜面接种法是将微生物接种在倾斜的培养基表面上，通过接种棒或铅笔头的方式在斜面上画线或涂抹，形成菌落。
这种接种方法适用于培养对氧需求较高的微生物，如厌氧菌和微需氧菌。
在进行斜面接种时，需要注意斜面的倾斜角度和接种的均匀性，以保证微生物的充分生长和代谢。
四、深层接种法。
深层接种法是将微生物接种在含有固体琼脂的试管或培养瓶中，通过接种棒或铅笔头的方式在琼脂表面插入或涂抹，形成菌落。
这种接种方法适用于培养对氧需求较低的微生物，如厌氧菌和微需氧菌。
在进行深层接种时，需要注意琼脂的固化温度和接种的深度，以保证微生物的充分生长和代谢。
五、滴播接种法。
滴播接种法是将微生物接种在含有营养物质的琼脂平板上，通过滴管或移液器滴播微生物悬液，形成菌落。
这种接种方法适用于培养对氧需求较高的微生物，如厌氧菌和微需氧菌。
在进行滴播接种时，需要注意滴播的均匀性和微生物悬液的浓度，以保证微生物的充分生长和代谢。
总结，微生物的接种方法多种多样，选择合适的接种方法对于微生物的培养和研究具有重要意义。
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。
当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。
大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。
所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。
这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。
固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。
最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。
这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
1.1 稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
1.2 涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
不同生物安全级别微生物菌种操作规程
不同生物安全级别微生物菌种操作规程微生物可根据其自身或其所产生的毒素的危害程度分为四个不同的生物安全等级。
对健康成年人（动物）已知无致病作用的微生物的生物安全级别为一级；对人（动物）或环境具有中等潜在危害的微生物的生物安全级别为二级；主要通过呼吸途径使人（动物）传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物（通常已有预防传染的疫苗）的生物安全级别为三级；对人体（动物）具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物的生物安全级别为四级。
不同生物安全级别微生物菌种的操作，如分离、培养、鉴定和保藏，应在相应生物安全防护的条件下进行。
本规范根据当前国家自然科技资源平台建设的总体要求，结合微生物菌种资源的特点制定，便于在微生物菌种资源的收集、保存、鉴定、评价、研究和利用过程中，尽量避免环境和人员受到微生物本身及其代谢产物的危害，实现菌种资源的高效共享和可持续利用。
不同生物安全级别微生物菌种操作规程1范围本规程规定了微生物生物安全分类标准，以及不同生物安全级别防护级别进行微生物的操作规程。
本规程适用于各菌种保藏单位所保藏的菌种资源的操作，如分离、培养、鉴定和保藏。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424条令）《兽医实验室生物安全管理规范》（2003年农业部302号公告）WS233-2002微生物和生物医学实验室生物安全通用准则OIE2003国际动物卫生法典WHO《实验室生物安全手册》第二版GB19489-2004《实验室生物安全通用要求》3术语、定义、符号、缩写语3.1一类微生物对个体和群体危害程度高，通常引起人和/或动物严重疫病且暂无有效的预防和治疗措施的致病微生物。
微生物培养及实验基本操作技术
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
微生物菌种、毒株和样本标准操作程序与流程
病原微生物菌（毒）种和样本的标准操作规程流程1．目的：对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制，防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作。
2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理；菌种、毒种专职管理人员：于瑞芳、侯恩言3．职责①微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。
②科室指定2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理。
③科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核。
④技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。
4．工作程序⑴报送及入库①当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预防控制中心。
②新发现的菌、毒种，要做好原始记录，逐级报送进行复核确认，报送时须2人参加。
③一、二类菌、毒种入库前，科室审核，技术管理层批准后入库④个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理⑤菌、毒种入库时， 2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。
⑵日常管理①保管人员由于瑞芳、侯恩言2名检验人员组成。
②菌、毒种入库时，保管人员应及时验收，统一编号，填写《菌、毒种登记表》③严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所，应做到三专（专室、专柜、专锁）。
④菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。
未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。
⑤菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录。
⑥菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时通知分管病种的检验人员进行传代，定期鉴定，并详细记录在《菌、毒种登记表》⑦菌、毒种保管人员发现菌、毒种发生变异和死亡，应及时向科室负责人报告，并填写《菌、毒种登记表》。
科室须将变异及死亡的一、二类菌、毒种通报技术管理层。
【微生物】菌种实验操作中常见问题汇总及分析
【微生物】菌种实验操作中常见问题汇总及分析在实验操作中往往都会遇到这样那样的问题。
不过，没关系，记住下面这十一条小诀窍让您轻松实验!（1）平板上有过多的水分；（2）划线时接种环未经反复灼烧。
（3）多区划线，三区或四区划线。
（1）灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量。
（2）琼脂培养基不能反复溶化。
反复溶化会破坏培养基中的营养成分。
（3）培养基不能反复灭菌，反复灭菌也会导致营养成分的破坏。
（4）含琼脂的培养基灭菌后，要摇匀。
大多数平板如VRBA、DC、尿素酶生化管、显色系列等要避光低温保存。
（1）干粉培养基：避光干燥，结块后不能使用。
（2）亚碲酸钾卵黄增菌液、50%卵黄乳液等：冷冻保存，使用时，要常温解冻，避免水浴加热。
（3）抗生素类：冷藏保存，温度过高会导致灵敏度的下降。
（4）兔血浆：冷藏保存少量的红色不会影响结果。
按SN、GB等标准或培养基的使用说明所述时间进行观察，时间过短或时间过长，单菌落的特征都不会很明显。
如单增李斯特氏菌显色培养基，时间短单菌落看不到卵磷脂环，时间长绵羊李氏菌也会产生沉淀环。
OXA、PALCAM的观察也如此，时间过长，李氏菌使整个平板成黑色，不利于观察单个菌落。
（1）温度的掌握。
卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。
（2）定量。
过多会抑制一些目标菌，太少又导致杂菌的过度生长。
（1）真菌类。
25-28℃培养（2）细菌类。
李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在30℃左右。
（3）其他一般在36℃左右。
常用的方法主要有划线、三点接种、穿刺接种、倾注接种、涂布接种、液体接种。
染色时间的掌握、冲洗的方法。
（1）接种的方法。
（2）氧化型和发酵型实验操作。
（3）阳性菌种的对照。
（4）接种前的纯化。
挑取单个菌落进行一系列的生化。
（1）抑制：是在亚抑制剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这些因子后生长仍可以恢复的生物学现象。
（2）死亡：在致死剂量因子的作用下或在亚致死剂量因子长时间的作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使移去这种因子后生长仍不能恢复的生物学现象。
(完整word版)微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。
了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3。
学习微生物的保藏及鉴定方法。
4。
熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2。
平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1。
水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。
第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
微生物菌种选育
株，苏云金杆菌模式菌株等细菌、食用菌等大型真菌、林 木病原菌、菌根菌、病虫生防菌、木腐菌、病毒和植原体 类等。 中国工业微生物菌种保藏管理中心:保藏各种工业微生物菌种 资源包括：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌和大型真菌 。 中国医学细菌保藏管理中心: 兽医微生物菌种保藏管理中心:
美国典型菌种保藏中心 (American Type Culture Collection, ATCC）
三、菌种分离思路
1：新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要 求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所 需要的菌种挑选出来。
2:实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行 分离纯化。
3：有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的 设备与之配合。
8、几种微生物纯培养分离方法的比较
1）固体稀释平皿法： 即可定性,又可定量,用途广泛;
2）平皿划线分离法： 方法简便,多用于分离细菌;
3)组织分离法: 高等真菌及植物病原菌。
4）单细胞挑取法： 局限于专业化的科学研究；
5）利用选择培养基法： 适用于分离某些生理类型较特殊的微生物。
二、菌种的来源
1、根据资料直接向有科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买；
微生物常规实验操作与菌种保藏
9、小结
• 微生物学常规试验操作与菌种保藏是一项实 践动手能力很强的工作。 • 是一项非常细仔且要求责任心很强的工作， 安全第一。同时,又是其它研究工作的基础。
2、培养基的制备
制备过程：称量，配制，调pH，分装，灭菌。
• 建议所有药品分别用水溶解后再混合，若药品种类较多则 建议前一种药品充分溶解后再加另一种药品，且要边加边 用玻璃棒搅匀，待药品完全溶解后，补充水分至所需体积。 • 如果配制固体培养基，需等药品充分溶解好以后，再加入 琼脂，并充分搅拌，防止糊底，最后补足所需水分。 • 如果配方中含有淀粉，需先将淀粉用少量冷水调成糊状， 然后再在火上加热搅拌并补充水分，待完全溶解后使用。
• 操作与固体接种方法基本固体接种相似，只是在将接种环 送入液体培养基中时，使环在液体与管壁接触的地方轻轻 磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，轻轻摇匀，即可培养。 或者先在长好菌种的斜面试管中加入无菌水，然后用接种 环将菌体轻轻洗下，混合均匀后直接倒入液体培养基中。 • 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管 接种。
3、平板接种
• 将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形 态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验 时采用的一种接种方法，可分为下面几种： • 划线法：见平板划线操作。 • 点种法：一般用于观察丝状真菌，点接于平板表面即可。
6、微生物菌种保藏
• 斜面保藏
• 液体石蜡保藏
• 甘油保藏
1、实验器皿的准备
试管、培养皿、三角瓶等玻璃器皿的准备
• 新的玻璃器皿，一般先用浓度为5%~6%的 盐酸浸泡6hs以上，再用自来水冲洗干净， 最后用蒸馏水冲洗2~3遍。旧的玻璃器皿， 只需洗干净，同样用蒸馏水冲洗2~3遍即可。 • 洗干净的玻璃器皿倒置晾干或烘干后备用。 • 包装、灭菌。
微生物的操作方法
微生物的操作方法微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等，它们在生态系统中起着重要的作用。
对于研究微生物，掌握微生物的操作方法是非常重要的。
下面将详细介绍微生物的操作方法。
第一步，无菌操作环境的准备：无菌操作是指在无菌条件下进行微生物的培养、分离、纯化和鉴定等实验操作。
首先要准备好无菌操作室，通过空气过滤、紫外线辐射等方式消毒操作室，保持无菌状态。
同时要准备好操作所需的无菌培养基、培养器具和工作平台等。
第二步，微生物的培养方法：微生物的培养是指将微生物菌株在适宜的培养基上进行生长繁殖的过程。
首先要选择适宜的培养基，根据微生物的营养需求和特性选择合适的培养基成分，并包装好无菌培养基。
接种前，要做好接种物的消毒处理，例如用75%酒精擦拭接种器具表面，同时用高温高压蒸汽或紫外线辐射对接种器具进行消毒。
然后，通过菌种悬液或菌落刷取适量的菌株转入无菌培养基中，摇匀后分装到无菌培养皿中。
接种后，将培养皿封闭，置于适宜的温度和湿度条件下，利用恒温培养箱或恒温培养箱进行培养。
在培养过程中要定期观察菌落的生长情况，记录下菌落的特征和数量。
第三步，微生物的分离和纯化方法：微生物的分离是指将混合菌群中的单个菌单元分离开来，纯化则是指将单个菌株在培养基上培养成纯种。
常用的方法有稀释平板法、涂布平板法和摇瓶液体培养分离法等。
稀释平板法是将已知稀释度的接种液均匀涂布在固体培养基上，将菌落稀释到一定程度，使菌落间有适当的距离，从而使每个菌落由单个菌细胞生长而成。
涂布平板法是将已知稀释度的接种液均匀涂布在固体培养基上，使菌落密度适宜，从而使得单个菌落能够生长成独立的菌株。
摇瓶液体培养分离法是将菌种悬液均匀分装到含有适宜培养基的摇瓶中，并通过摇床或摇瓶机进行培养，使微生物在液体中形成独立的培养。
分离纯化后，要对纯种菌株进行存储。
常见的存储方法有冷冻保存法和干燥保存法。
冷冻保存法是将菌种悬液加入到稳定的冷冻保护剂中，通过低温（-80）冷冻保存以延缓细胞死亡。
微生物菌种操作方法
微生物菌种操作方法
微生物菌种操作方法是指对微生物菌种进行培养、分离、保存和传代的步骤和技巧。
以下是一般的微生物菌种操作方法：
1. 培养基准备：根据微生物的营养需求选择适当的培养基，如琼脂培养基、液体培养基等。
制备培养基时要注意消毒、pH 调整和适当的营养物质添加。
2. 菌种接种：将需要操作的微生物菌种从原始培养物中取出，可以选择扩大培养量或进行传代培养。
接种时要保持无菌操作，使用消毒好的工具进行接种。
3. 培养条件控制：对不同微生物菌种，要根据其生长特点进行培养条件的控制，如适宜的温度、光照、氧气浓度等。
确保培养环境的无菌和稳定性。
4. 培养观察：定期观察微生物菌种的生长情况，可以通过肉眼观察菌液的颜色、浑浊度等指标，也可以在显微镜下观察微生物的形态和结构。
5. 菌种分离：如果需要分离纯种，可将菌液以适量稀释后进行涂布或稀释平板扩散等分离方法，培养出单菌落形成纯种。
6. 菌种保存：当需要长期保存菌种时，可使用冻干法、冷冻法或液氮冷冻法等方法进行菌种保存。
这些方法可以确保菌种的长期保存和活力的保持。
7. 传代培养：当需要进行菌种的繁殖或进一步研究时，可以进行传代培养。
传代培养可以通过将菌液接种到新的培养基中进行，以保持菌种的活力和适应性。
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常用的几种微生物接种方法
接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。
接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目的）。
在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环→稍冷→沾取细菌样品→进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→进行接种环灭菌等五个程序。
不同培养基，接种方法也不同，分述如下：
一、平板划线接种法（分离培养法）
是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。
平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。
（一）分段划线法
平板分段划线(左)及培养后菌落分布图
本法多用于含菌量较多的标本。
方法是以接种环沾取少许样品先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），然后将接种环置火焰上灭菌，俟冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），于第二段处再作划线，且在开始划线时与第一段的划线相交接数次，以后划线不必再相接，待第二段划完时，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。
这样每一段划线内的细菌数逐渐减少，即以获得单个菌落，划线接种完毕，盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）于37℃温箱中培养。
（二）连续划线法：此法多用于接种材料中含菌数量不太多的样品或培养物。
方法是先将样品或培养物涂于平板表面的一角，然后用接种环自样品涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平等线。
二、斜面接种法
此法主要用于移种纯菌，使其增殖后用于鉴定或保存菌种。
通常是从平板培养物上挑取某一单独菌落或者从一支已长好的斜面菌种，移种至斜面培养基上，接种步骤如下（以从已长好的斜面菌种转接为例）：
（一）左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长好的菌种。
右手持接种环或接种针通过火焰灭菌后俟冷，并同时以右手小指和无名指轻轻拔取两支试管的棉塞或试管帽（先转动棉塞后拔去），夹持于手指间。
（二）将试管口通过火焰数次，并稍转动，以防止外界的污染。
（三）首先将接种环伸入有菌试管，使接种环接触菌苔取少量菌，取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌后将接种环伸入斜面管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上的蜿蜒涂布，或直接自斜面底部向上蜿蜒涂布。
此步注意接种环不可碰试管壁和接种时不要划破培养基。
（四）烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，将接种环插到酒精瓶中。
三、倾注培养法
本法用于饲料中细菌、霉菌的计数。
方法是取原始样品或经适当稀释的（通常是10-1~10-5稀释）液体1mL，置于直径9cm无菌平皿内，倾入已融化并冷至50℃左右的培养基约13~15mL ，立即混匀，待凝固后倒置，于一定温度下培养一定小时，作菌落计数。
四、穿刺接种法
此法多用于双糖、半固体、明胶等培养基的接种，方法与斜面接种类似。
用接种针挑取菌落或菌液少许，由培养基表面中央直刺至管底（若为三糖铁并在斜面加以涂布），然后沿穿刺线拔出接种针（注：接种半固体看动力者不穿刺到底）。
穿刺接种琼脂固体穿刺生长形状
五、液体接种法
此法多用于单糖发酵试验等，接种方法与斜面接种方法基本相同。
以左手持培养基与菌种管，右手持接种环和拔持棉塞，将挑取的菌落或菌液接种于液体培养基内。
无菌技术：
1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；
2、将用于微生物培养的器皿、接种的用具和培养基等进行灭菌；
3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；
4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
倒平板操作：
1、将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。
2、右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；
3、用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。
4、等待平板冷却凝固（大约需5～10min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
平板划线操作：
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；
2、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞；
3、将试管口通过火焰；
4、将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液；
5、将试管口通过火焰，并塞上棉塞；
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。
注意不要划破培养基。
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。
重复以上操作，在三区域内划线。
注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。
8、将平板倒置，放入培养箱中培养。
稀释操作：
1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按10¹～106的顺序编号。
2、用移液管吸取1ml培养的菌液，注入10¹倍稀释的试管中。
用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。
3、从10¹倍稀释的试管中吸取1ml稀释液，注入10²倍稀释的试管中，重复第2步的混匀操作。
依次类推，直达完成最后一支试管的稀释。
注：移液管需要经过灭菌。
操作时，试管口和移液管应在离火焰的1～2cm处。
涂布平板操作：
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；
2、取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面；
3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s；
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：
1、将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。
取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
2、操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
平板划线法与稀释涂布平板法的区别
一、平板划线分离法
由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
用途：一般多用于从菌种的纯化；
优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；
缺点：不能计数；
二、稀释涂布平板法：
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。
一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
用途：一般多用于筛选菌株。
一般用于平板培养基的回收率计数。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。
如果菌液密度大的话，长不出单菌落。