实验二：丝状真菌生长的测定(精)
丝状真菌的鉴定
鉴定得分
数量及 百分比(%)
使用布鲁克丝状真菌库
v1.0 ≥2.0 ≥1.7 ＜1.7 错误
联合布鲁克和BMU数据库 ≥2.0 ≥1.7 ＜1.7 错误
55 67 37 7
90 104 0 7
(49.5) (60.4) (33.3) (6.3) (81.1) (93.7) (0) (6.3)
111株毛霉：根霉属(48)，毛霉属(41)，横梗霉属(11)，根毛霉属(4)，小 克银汉霉属(5)，共头霉属(2)
染色：乳酸酚棉兰染色
02 丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定
MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌
样品制备 ➢ 直接转移法 ➢ 甲酸提取法—推荐
数据库 ➢ 商业数据库 ➢ 补充数据库
其他影响因素 ➢ 黑色素抑制 ➢ 沙氏葡萄糖液体培养基旋转培养
MALDI-TOF MS-毛霉目真菌的鉴定
• Centraalbureau voor Schimmelcultures (hppt://www.cbs.knaw.nl)
04 常见丝状真菌鉴定
曲霉-直接镜检
曲霉-分生孢子头
分生孢子 瓶梗 顶囊 分生孢子柄
梗基
足细胞
烟曲霉 Aspergillus fumigatus
黄曲霉 Aspergillus flavus
毛霉目真菌-直接镜检
孢囊孢子
柱孢囊
囊轴
囊托
顶囊 孢囊梗
匍匐菌丝
单孢囊
假根
厚壁孢子
粉孢子
毛霉目基本结构
接合孢子 茎孢子
Lichtheimia
横梗霉（Lichtheimia）, 毛霉（Mucor）, 根毛霉（Rhizomucor）和根霉（Rhizopus）的孢子囊特征
第三章 真菌的生长与繁殖
(一) 泡囊学说（Grove，1970年） 1.内容 （1）菌丝顶端1-2μm的顶部区域含有大量的泡囊； （2）泡囊来源于内质网，后转移至高尔基体，在高尔
基体中进行浓缩加工，获得类原生质膜的泡囊膜； （3）泡囊从高尔基体中释放，转移到菌丝顶端，与原
生质膜结合，其内含物释放到膜壁之间用来合成细胞 壁，泡囊膜融入原生质膜，增加膜的面积，导致菌丝 顶端的生长。
直径的一半→两端加棉塞后灭菌→凝固后从一端接种 后→按时测定生长距离，并计算生长率。 二、菌丝干重法 液体培养后，过滤菌丝、洗涤、离心、烘干、称量干 重。仅适用于菌体浓度较高的样品。
第四节 环境的影响与极端耐受性 一、水
液体培养时多数真菌不能形成孢子。 真菌宜在高湿条件下生长，一般以相对湿度表示。 1.相对湿度95-100%生长良好；80-85%时，生长缓慢
“分生孢子”。 ➢ 孢囊梗类型：不分枝、双叉分支、不规则分支→分类
依据。
（三）、分生孢子 最常见的无性孢子，单细 胞或多细胞。 1.分生孢子的发育类型 ➢芽殖型：吹气球方式长 大，与泡囊聚集有关； ➢菌丝型：顶端停止生长， 形成隔膜而断裂。
（1）芽殖型（内生+外生）
①内生芽殖型 ➢从产孢细胞的管孔或孔 道中长出。 ➢产孢细胞只有内壁参与 分生孢子壁合成。 A.瓶梗孢子：孢子从瓶状 产孢细胞上产生； B.孔出孢子：孢子通过产 孢细胞孔道形成。
耐冷：0℃能生长，最适20-25℃。 ① 芽枝霉→冰冻条件下引起冷藏肉类的腐败。 ② 雪霉：如雪腐镰刀菌→侵染植物。
芽 枝 霉
北极雪藻
红雪
③嗜冷菌应用-低温酶（蛋白酶和脂酶最具潜力） • 洗涤工业：耐碱低温脂酶和蛋白酶； • 食品工业：低温凝乳酶用于豆奶凝乳和生产奶
丝状真菌
丝状真菌（霉菌）分离筛选方法霉菌生长在偏酸性有机质丰富的环境中，种类多，形态各异，细胞结构多样。
霉菌是一些丝状真菌统称，同酵母菌一样不是分类学的名词。
一.丝状真菌（霉菌）分离筛选1.培养基：1.1 PDA 培养基： 马铃薯一葡萄糖培养基（同酵母）并添加80%乳酸数滴（5mL/L ）或0.05 %去氧胆酸钠以抑制细菌生长，葡萄糖改为蔗糖。
注：土壤适于马丁或马玲薯一葡萄糖培养基 ，河泥 霉变材料 生物膜适用于查氏 马丁培养基或PDA 培养基1.2 察氏培养基：蔗糖30g/L FeSO 4 0.01g/L NaNO 32.0g/L MgSO 4 0.5g/L KC1 0.5g/L K 2HPO 4 1.0g/L PH6.7-7.01.3马丁培养基： 葡萄糖10g/L 蛋白胨5g/L KH 2PO 41g/L MgSO 40.5g/L 孟加拉红（0.1%）3.3mL 灭菌后使用前加入。
临用时每升培养基加入 1.0%链霉素 3.0mL PH 自然。
1.4特定培养基：橘皮培养青霉 甜酒曲培养根霉。
2.分离纯化：混菌和涂布法将样品梯度稀释（10-4、10-5、10-6），混菌和涂布于平板，25-28℃倒置培养3-7d ， 挑取不同典型单菌落孢子或菌丝进行反复划线纯化。
据菌落质地、颜色是否纯培养物，若有杂菌重复纯化一次。
对于形成固定菌落的（青霉 曲霉等）可用稀释平板混菌法分离纯化，菌落不定型蔓延繁殖的（根霉 毛霉），两菌落及易接触混杂，分离时采取较高稀释度或以培养16-24h 内生长菌丝接种。
根霉菌分离筛选：属于毛霉目，蔓延繁殖，没有一定的菌落形态，易与其他霉菌混生，故分离时采取大稀释度，早移植，可在培养基添加0.1℅去氧胆酸钠，防止蔓延。
可利用形态特征鉴别。
样品：酒药 培养基：葡萄糖豆芽汁培养基（豆芽汁100mL ，酵母膏2g 葡萄糖3g PH 自然。
豆芽汁制备：黄豆100g ，加水1000mL ，煮30-40min ，取汁备用）。
【专家共识】临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求
临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求【专家共识】近年来侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，准确、早期诊断是治疗疾病的关键。
然而，目前我国临床实验室真菌检测能力离临床诊治需求尚有较大差距，亟待改进。
国家卫生计生委办公厅于2016年底发布了《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》（国卫办医函[2016]1281号），要求在2020年以前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设，促进抗菌药物的合理应用，维护人民群众健康。
本共识的制定旨在建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求，推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升，从而提高综合医院真菌感染诊疗能力。
一、术语和定义（一）酵母菌单细胞真菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖，称为酵母菌（yeast）。
临床致病的酵母菌主要包括念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等。
（二）丝状真菌多细胞真菌有菌丝和孢子，菌丝延长分枝，交织成团，称为丝状真菌（filamentous fungi）。
又称霉菌（mold）。
临床重要的丝状真菌包括曲霉菌、毛霉菌、镰刀菌等。
（三）双相型真菌有些真菌可因环境条件（如营养、温度、氧气等）改变，由一种形态转变为另一种形态，称为双相型真菌（dimorphic fungi），如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌、孢子丝菌、马尔尼菲篮状菌等。
这些真菌在体内或在含动物蛋白的培养基上，37 ℃培养时呈酵母相；而在普通培养基，25 ℃培养时呈霉菌相。
二、环境和设施要求真菌实验室环境和设施的设计应确保实验的质量和生物安全。
（一）环境要求真菌实验室应与细菌、病毒等实验室区分，以防发生交叉污染。
其面积以满足工作和安全要求为宜，合理布局。
在建设实验室或开展实验活动之前，应进行生物危害评估。
（二）基本设施设置防飞虫纱窗和门禁，有充足的照明、应急灯、通风、供水、供电、紧急疏散标识及信息系统，工作区设有洗手池、应急淋浴和洗眼装置；门外有生物安全级别标识[1]。
配置生物安全柜和不同温度培养箱（至少包括25~30 ℃以及35~37 ℃）。
丝状真菌生长的测定
菌体干重法：液体培养真菌的生长期完成后，过滤菌丝、洗涤、离心、烘
干、称量干重。这种测定法比较直接而可靠，但仅适用于菌体浓度较高的样品， 而且要求样品中不含有菌体以外的其它干物质。 菌体湿重法：也可以采用测定菌丝湿重法，把烘干步骤省去。但无论测定 干重或湿重，大都用于工业发酵过程的检测。 真菌的生长还可用间接的方法测定，如全氮量和核糖核酸的分析，一般干 的菌丝体含氮量是4.5-8.5%，核糖核酸是2.0-4.0%。另外，还可以分析培养基 中糖的消耗量、氧的吸收量等作为测定生长量的指标。这些方法大都是工业生 产中所采用的方法。
（三）直线生长速率的测定 这一方法使用并不广泛。它是在“Ｕ”形培养管中进行的。培养管长40厘
米，内径约1.3厘米，在两端5厘米处弯成45°角，如图所示。
在培养管中加入适量的溶化的琼脂培养基，达到培养管直径的一半，两端加 棉塞后灭菌。凝固后从一端接种，然后按时测定生长距离，并计算生验内容：菌丝顶端延长生长的测定 1．配制 PDA培养基，高压灭菌备用 2．制备PDA培养基平板，在平板中心点接黑根霉，于28℃培养15h左右。 3．用显微镜的镜台测微尺来校对目镜测微尺。镜台测微尺100格共长1mm，每
格为10μm，标定目镜测微尺上每小格表示多少μm。
4．将黑根霉平板放置于显微镜台上，在菌落边缘选择单根菌丝边缘，在低倍镜 下聚焦。 5．将目镜测微尺与菌丝平行，并选择菌丝开始出现侧枝的位置与目镜测微尺上
细胞质的泡囊起源于高尔基体，高尔基体、核、内质网一起存在于亚顶端部位。
1970年，Grove等人提出了菌丝顶端生长的泡囊假说：
二、菌丝顶端生长的机制 泡囊作用的三重性： 1. 运输细胞壁溶解酶去破坏原来壁 组成之间的键;
2. 运输新的壁物质，并在壁合成酶
丝状真菌的快速鉴定及药敏试验
丝状真菌的快速鉴定及药敏试验彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【摘要】Objective To evaluate the application of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology in the identification of filamentous fungi,and analyze the susceptibility of filamentous fungi to commonly used antibiotics.Methods A total of 100 strains of filamentous fungi were collected and identified rapidly by MALDI-TOF MS.The obtained results were compared with those from microscopic examination.The susceptibility of filamentous fungi was detected by the Etest method.Results Among 100 strains of filamentous fungi identified by MALDI-TOF MS,61 reached to the specieslevel(score≥2.000),36 to the genus level(score between 1.700 and1.999),and 3 failed to be identified (score ＜ 1.700).There was inconsistent results for one strain of filamentous fungi between MALDI-TOF MS and microscopic examination.The MIC90 of amphotericin B against Epidermophytonfloccosum was 0.19 μg/mL,while that against Aspergillus flavus wa s above 32 μg/mL.The MIC90 of itraconazole against Trichophyton tonsurans,Microsporum canis and Epidermophytonfloccosum were all below 0.38 μg/mL,while that against Aspergillus niger was above 32 μg/mL.The MIC90 of fluconazol were above 256 μg/mL for most of strains.The MIC90 of voriconazole and caspofungin against Aspergillus fumigatus,Aspergillus flavus,Aspergillusniger,Trichophyton rubrum,Trichophyton tonsurans and Microsporumcanis were ≤0.38 μg/mL and ≤ 1 μg/mL,respectively.Conclusion The MALDI-TOF MS technology may be used to identify the filamentous fungi isolated from clinical specimens quickly,accurately and high-throughput.Voriconazole and caspofungin have effective anti-filamentous fungi activity.%目的评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在丝状真菌鉴定中的作用,分析常用抗菌药物对丝状真菌的药敏试验结果.方法收集100株丝状真菌,采用MALDI-TOF MS进行快速鉴定,并与显微镜检查结果进行比对;用E-test法进行丝状真菌药敏试验.结果 MALDI-TOF MS对100株丝状真菌鉴定达到种鉴定水平的有61株(得分≥2.000),达到属鉴定水平的有36株(1.700～1.999),未能鉴定的有3株(＜1.700);与镜检结果不一致的有1株.两性霉素B对絮状表皮癣菌的90％最低抑菌浓度(MIC90)为0.19 μg/mL,而对黄曲霉的MIC90＞32 μg/mL.伊曲康唑对断发毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的MIC90均＜0.38 μg/mL,而对黑曲霉的MIC90＞32 μg/mL.氟康唑对大部分受试菌株的MIC90均＞256μg/mL.伏立康唑和卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、红色毛癣菌、断发毛癣菌和犬小孢子菌的MIC90分别≤0.38μg/mL和≤1μg/mL.结论 MALDI-TOF MS技术可快速、准确、高通量检测临床分离的丝状真菌.伏立康唑和卡泊芬净对丝状真菌具有较好的抗菌活性.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2017(035)007【总页数】5页(P486-490)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;丝状真菌;真菌药敏试验【作者】彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【作者单位】苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003【正文语种】中文【中图分类】R446.5近年来，由于器官移植、免疫抑制剂使用、侵入性治疗、恶性肿瘤、HIV感染等患者逐年增多，以及广谱抗菌药物的广泛应用，丝状真菌的感染比例呈上升趋势。
真菌学实验报告
真菌学实验报告一.实验目的：1.1了解真菌形态的基本特征。
1.2掌握丝状真菌制片方法。
1.3掌握内生真菌的分离方法1.4掌握真菌的鉴定方法。
二.前言：真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。
真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。
当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。
真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。
因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。
植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。
研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。
三.材料与方法：3.1.1材料：在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。
3.1.2.药品与试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。
孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。
消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。
双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇(β- Mercaptoethanol)，石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。
丝状真菌形态观察
实验四 结 束
�
The major classes of fungi
Oomycetes(卵菌纲) Zygomycetes(接合菌纲) Ascomycetes(子囊菌) Basidiomycetes(担子菌纲) Deuteromycetes(半知菌纲)
观察霉菌的形态) 实验程序(观察霉菌的形态)
青霉, 青霉,黑曲霉观察
Mucor racemosus Geotrichum candidum Aspergillus niger Penicillium notatum Rhizopus oryzae
Several types of sexual spores
Oospores(卵孢子) Zygospores(接合孢子) Ascospores(子囊孢子) Basidiospores(担孢子)
实
验
四
丝状真菌形态的观察
丝状真菌形态的观察
目的要求 实验材料 实验程序 思考题
目的要求
学习观察丝状真菌形态的基本方法 加深理解丝状真菌的形态特征
实验材料
青霉, 丝状真菌培养物 :青霉,黑曲霉 水浸片法:根霉, 水浸片法:根霉,白地霉 显微镜,载玻片,接种环,解剖针,酒精灯, 显微镜,载玻片,接种环,解剖针,酒精灯, 镊子等. 镊子等. 乳酚油,碘液,酒精,蒸馏水等. 乳酚油,碘液,酒精,蒸馏水等.
囊轴columella 囊轴 囊托apophysis 囊托 孢子囊sporangium 孢子囊
匍匐菌丝stolon 匍匐菌丝 假根rhizoid 假根
孢子囊 sporangium
囊轴columella 囊轴
囊托apophysis 囊托 孢囊孢子sporangiospores 孢囊孢子
普通微生物学课后习题及答案第六章
微生物的个体生长：指细胞物质有规律地、不可逆地增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。
繁殖：引起生命个体数量增加的生物学过程。
微生物细胞数目的检测方法：显微直接计数法：用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。
活菌计数法：通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌的方法，计数依据是在稀释情况下一个菌落由一个活细胞繁殖形成，又称平板菌落计数法。
微生物生物量的测定方法：1、湿重法将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。
2、干重法将离心得到的细胞沉淀物置于100~105℃的烘箱中干燥过夜至水分去除，然后再称重。
3、比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增加。
在一定浓度范围内，悬液中细胞的数量与透光量成反比，与光吸收值成正比。
因此利用分光光度计在450nm~650mn的某一波长可以测定培养物的光吸收值来确定细胞量。
4、生理指标法与微生物生长量相平行的生理指标很多，可根据实验目的和条件适当选用。
一般微生物细胞的含氮量比较稳定，故可用凯氏定氮法等测定其总氮量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量。
蛋白质含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。
1、丝状微生物菌丝长度测定法将真菌接种在琼脂平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积。
2、培养料中菌体生长速率测定法主要测定一定时间内固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。
3、单个菌丝顶端生长速率测定法可利用湿室培养法对丝状微生物进行培养，定时将湿室中的培养有微生物的载玻片置于显微镜下，借助目镜测微尺测定一定时间内单个菌丝的伸长长度。
微生物的同步生长与同步培养方法同步培养法：使培养物中所有的微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法。
同步生长：指这种培养物中所有微生物细胞都处于同一生长阶段，并都能同时分裂的生长方式。
获得微生物同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：采用物理或化学因子使微生物细胞生长进行到某个阶段停止下来，使先到该阶段的微生物细胞不能进入下个阶段，待全部群体细胞都到达该生长阶段后，再除去该因子，使全部群体细胞同时进入下个生长阶段，达到诱导微生物细胞同步生长的目的。
遗传实验2-2粗糙链孢霉生活史及
05 数据记录与分析 详细记录实验数据，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ进行分析和总结。
04
实验结果和数据分析
实验结果
01
02
03
实验组1
在适宜条件下，粗糙链孢 霉生长良好，菌落形态正 常，颜色为灰白色。
实验组2
在不适宜条件下，粗糙链 孢霉生长受到抑制，菌落 形态变小，颜色为浅灰色。
对照组
未添加粗糙链孢霉的培养 基上未观察到任何菌落生 长。
生活史
无性繁殖
粗糙链孢霉通过无性繁殖产生分生孢子进行生殖，分生孢子在适宜的条件下萌发 形成新的菌丝。
有性生殖
粗糙链孢霉在某些条件下可以完成有性生殖，产生有性孢子。有性孢子的形成需 要两个不同性别的细胞结合，经过减数分裂产生单倍体核，再经过配对和分裂形 成有性孢子。有性孢子的萌发需要适宜的条件才能形成新的菌丝。
03
实验材料和方法
实验材料
粗糙链孢霉（Neurospora crassa）：作为实验材料， 粗糙链孢霉是一种常见的真菌，具有易于培养和遗传 操作的特点。
培养基：用于培养粗糙链孢霉的培养基有多种，如 玉米粉琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基等，可根据 实验需求选择适合的培养基。
显微镜、玻璃器皿、滤纸等实验器材：用于观察、 分离和培养粗糙链孢霉。
生殖方式
粗糙链孢霉通过无性繁殖产生 分生孢子进行生殖，每个分生 孢子可萌发形成新的菌丝。
生活环境
温度
粗糙链孢霉适宜在温暖的环境中生长，最适温度为2530℃，在10℃以下或35℃以上生长缓慢或停止生长。
湿度
粗糙链孢霉需要相对较高的湿度，一般在70%以上 的相对湿度下生长较好。
光照
粗糙链孢霉的生长不需要光照，黑暗条件有利于菌 丝的生长，而光照条件下有利于分生孢子的形成。
实验一：丝状真菌生长的测定
2）菌落生长速度的测定： ① PDA无菌平板，将待测菌株点接于培养基 平板上。 ② 每天测量菌落的半径 ③ 记载时间和生长量，在一定限度内生长量 与时间成直线关系。
3）直接生长速度的测定： ① PDA培养基倾注入“U形”培养管中，注入 培养基的量，达到培养管℃培养箱中培养；
实验一 丝状真菌生长的测定
一、概念
丝 状 真 菌 （ filamentous fungi ） ， 俗 称 霉 菌 （ mould, mold），通常指那些菌丝体较发达又不产生大型肉质子实体 结构的真菌。
一、测定方法 1）菌丝生长的测定：
① 马铃薯（PDA）培养基倒平板，冷却（无菌操作）。
配方：葡萄糖 20克 ，琼脂 20克，削皮马铃薯 200克煮汁 定容至1000ml，pH自然，115℃灭菌30分钟； ② 待测菌株点接于培养基平板中心，倒置28℃度培养； ③ 待菌落长出后，将平板翻置于显微镜镜台上，同时校对
③ 每日测定生长距离，并计算生长率。
三、结果记录： 1）每个方法作一张表格，记录每次不同时间丝
状真菌生长情况。
所用显微镜的目镜测微尺，并计算每一格的长度。在菌落边缘选 择单根菌丝的顶端在低倍镜下聚焦，然后将目镜测微尺与菌丝平 行，并选择菌丝开始出现侧枝的部位与目镜测微尺上的一条线重 合，这个点即为“参照点”。每隔一定的时间测量一次菌丝生长 的长度，观察数次后，根据时间和延长生长的长度划一条生长曲 线，并求出生长速度（毫米/小时）。
临床标本分离的丝状真菌实验室检测与临床特点分析
㊃论 著㊃临床标本分离的丝状真菌实验室检测与临床特点分析曹敬荣 王育英 谢威 王岩 陈典典 李文军 刘云屹 闵嵘 王培昌首都医科大学宣武医院检验科,北京100053通信作者:王培昌,E m a i l pc w 1905@126 c o m ʌ摘要ɔ 目的 分析临床分离出丝状真菌患者的临床资料和实验室结果,提高对该类感染的认识㊂方法 回顾性分析2016年1月至2019年1月宣武医院临床标本分离到丝状真菌的住院患者临床资料,包括人口学特征㊁临床表现㊁影像学及微生物学结果㊂比较肺部感染组和定植/污染组及存活组和死亡组的差异,分析导致感染的危险因素㊂统计学分析采用S P S S20 0软件㊂结果 共收集分离丝状真菌的患者110例,男70例,女40例;年龄(69 81ʃ13 93)岁,年龄范围为26~97岁,ȡ60岁占82 73%㊂70例(63 64%)确诊为丝状真菌感染,其中肺部感染组62例(56 36%),致病菌以曲霉菌为主(87 10%,54/62)㊂定植/污染组40例(36 36%),均来自呼吸道标本,分离菌株包括曲霉菌(82 50%,33/40)㊁青霉属等㊂2组患者性别㊁年龄㊁临床表现和影像学表现比较,差异均无统计学意义(P 值均>0 05)㊂2组患者发热比较,差异有统计学意义(χ2=10 736,P <0 05)㊂2组标本均主要来源于呼吸科㊁急诊科和老年科㊂菌种分布均以曲霉菌属(烟曲霉和黄曲霉)居多,肺部感染组菌种分布更广㊂肺部感染组主要危险因素为有肺部基础疾病㊁糖皮质激素使用和糖尿病,肺部感染组较定植/污染组病死率高(35 48%比5 00%,χ2=12 55,P <0 01)㊂肺部感染组患者住院期间均使用抗真菌药物治疗,好转40例(64 52%),死亡22例(35 48%)㊂死亡组患者年龄显著高于存活组(t =4 83,P =0 01),糖皮质激素的使用是死亡主要危险因素(χ2=8 40,P =0 02)㊂G 试验和GM 试验在肺部感染组检测阳性率高于定植/污染组(P 值均<0 05)㊂结论 丝状真菌感染病死率高,通过对丝状真菌感染患者的微生物检验与临床特征研究,有利于提高丝状真菌感染的早期诊断和治疗㊂ʌ关键词ɔ 真菌;感染;危险因素;定植;半乳甘露聚糖试验基金项目:北京市医管局人才培养计划 登峰 项目(D F L 20180803);宣武医院院级课题(XW J L -2019031)D O I 10 3760 c m a jc n 131368-20191224-01799C l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a nd l a b o r a t o r y a n a l y s i s o f f i l a me n t o u sf u n gi i s o l a t e d f r o m p a t i e n t s C a oJ i n g r o n g W a n g Y u y i n g X i e W e i W a n g Y a n C h e n D i a n d i a n L i W e n j u n L i uY u n y i M i n R o n g W a n g P e i c h a n gD e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y X u a n w u H o s p i t a lo f C a p i t a l M e d i c a lU n i v e r s i t y B e i j i n g 100053 C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r W a n g P e i c h a n g E m a i l pc w 1905@126 c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o a n a l y z e t h e c l i n i c a l d a t a a n d l a b o r a t o r y r e s u l t s of c l i n i c a l i s o l a t e s o f f i l a m e n t o u sf u ng i a n d t oi m p r o v eth e u n d e r s t a n di n g o ft h i st y pe o fi nf e c t i o n M e t h o d s A r e t r o s p e c t i v es t u d y w a sc o n d u c t e dt h r o ug hc o l l e c t i o no f th ec li n i c a ld a t a i n c l u d i n g d e m o g r a p h i c c h a r a c t e r i s t i c s c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s i m a g i n g a n d m i c r o b i o l o g i c a lf i n d i n g s o fi n -pa t i e n t s w i t h f i l a m e n t o u s f u n g i f r o m X u a n w u H o s p i t a lo fC a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t yb e t w e e nJ a n u a r y 2016t o J a n u a r y 2019 T h e d i f f e r e nc e s b e t w e e n p u l m o n a r y i n f e c t i o n g r o u p a nd c o l o n i z a t i o n p o l l u t i o n g r o u p s u r v i v a l g r o u p a n dde a t h g r o u p w e r e a n a l y z e d a n d t h e r i s kf a c t o r s o f i n f e c t i o nw e r e a n a l yz e d S P S S 20 0s o f t w a r ew a su s e df o rs t a t i s t i c a l a n a l ys i s R e s u l t s At o t a l o f110p a t i e n t sw i t hf i l a m e n t o u s ㊃7941㊃国际呼吸杂志2020年10月第40卷第19期 I n t JR e s pi r ,O c t o b e r 2020,V o l .40,N o .19Copyright ©博看网. All Rights Reserved.f u ng iw e r e c o l l e c t e d i n c l u d i n g70m a l e sa n d40f e m a l e s w i t ha g eo f26-97y e a r s m e a n6981ʃ1393y e a r s A m o n g th e m ȡ60y e a r so l da c c o u n t e df o r8273% 70c a s e s6364%w e r e di a g n o s e da s f i l a m e n t o u s f u n g a l i n f e c t i o n i n c l u d i n g62c a s e s o f p u l m o n a r y i n f e c t i o n5636%a n d t h e m a i n p a t h o g e n s w e r e A s p e r g i l l u s s p p8710% 546240c a s e s3636%i n t h e c o l o n i z a t i o n p o l l u t i o n g r o u p w e r e f r o mr e s p i r a t o r y s p e c i m e n s a n d t h e i s o l a t e s i n c l u d e dA s p e r g i l l u s s p p8250% 3340P e n i c i l l i u m e t c T h e r ew e r en o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n g e n d e r a g e c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s a n d i m a g i n g f i n d i n g sb e t w e e n t h e t w o g r o u p s a l l P>005T h e r ew a s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n f e v e r b e t w e e n t h e t w o g r o u p sχ2=10736P<005T h e s p e c i m e n s o f b o t h g r o u p s w e r e m a i n l y f r o m t h e d e p a r t m e n t o fr e s p i r a t o r y e m e r g e n c y a n d g e r i a t r i c s A s p e r g i l l u s s p p A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s a n dA s p e r g i l l u s f l a v u s w e r e t h ed o m i n a n t s p e c i e s i nb o t h g r o u p s a n dt h e s p e c i e sd i s t r i b u t i o ni n p u l m o n a r y i n f e c t i o n g r o u p w a s m o r ee x t e n s i v e T h e m a i nr i s kf a c t o r so f p u l m o n a r y i n f e c t i o n g r o u p w e r e p u l m o n a r y b a s i c d i s e a s e h o r m o n a l u s e a n dd i a b e t e s T h em o r t a l i t y o f p u l m o n a r y i n f e c t i o n g r o u p w a sh i g h e r t h a n t h a t o f c o l o n i z a t i o n g r o u p3548%v s500% χ2= 1255P<001I nt h e p u l m o n a r y i n f e c t i o n g r o u p40c a s e s6452%w e r ei m p r o v e da n d 22c a s e s3548%d i e d T h e a g e o f p a t i e n t s i n t h e d e a t h g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y o l d e r t h a n t h a t i n t h e s u r v i v a l g r o u p t=483P=001T h eu s eo f g l u c o c o r t i c o i d sw a s t h em a i nr i s kf a c t o ro f d e a t hχ2=840P=002T h e p o s i t i v er a t e so fGt e s ta n d GM t e s t i n p u l m o n a r y i n f e c t i o n g r o u p w e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h o s ei nc o l o n i z a t i o n p o l l u t i o n g r o u p b o t h P<005 C o n c l u s i o n s T h em o r t a l i t y o f f i l a m e n t o u s f u n g a l i n f e c t i o n i s h i g h I t i s h e l p f u l t o i m p r o v e t h e e a r l y d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o f f i l a m e n t o u s f u n g a l i n f e c t i o nb y s t u d y i n g t h em i c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n a n d c l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f p a t i e n t sw i t h f i l a m e n t o u s f u n g a l i n f e c t i o nʌK e y w o r d sɔ F u n g i I n f e c t i o n R i s k f a c t o r s C o l o n i z a t i o n G a l a c t o m a n n a n t e s tF u n d p r o g r a m B e i j i n g M u n i c i p a lA d m i n i s t r a t i o no fH o s p i t a l'sA s c e n tP l a n D F L20180803C o l l e g e-l e v e l P r o j e c t i nX u a n w uH o s p i t a l XW J L-2019031D O I103760c m a j c n131368-20191224-01799近年来,随着免疫功能低下人群增加,侵袭性真菌,尤其丝状真菌感染发病率逐年上升[1-3],但由于真菌感染的临床表现非特异和实验室检测技术有限,侵袭性丝状真菌感染的诊疗面临较大挑战,患者预后差,病死率高[3-5]㊂尤其分离自呼吸道的丝状真菌是定植/污染抑或感染受到临床和实验室人员的特别关注和重视㊂因此,本研究分析总结了首都医科大学宣武医院临床分离的丝状真菌患者实验室检测结果和临床资料,以期为实验室鉴定及临床明确诊断㊁治疗侵袭性丝状真菌感染提供科学依据,报道如下㊂1对象与方法11感染标准侵袭性真菌感染诊断标准参照我国‘侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则“[6]和2016‘年美国感染病学会曲霉病诊断处理实践指南“[7],诊断分为确诊㊁临床诊断和拟诊㊂本研究诊断符合率以临床诊断和确诊病例进行分析,无菌体液中真菌培养阳性时需结合临床排除标本污染㊂12临床资料和菌株来源回顾性分析2016年1月至2019年1月首都医科大学宣武医院各科室送检标本分离出丝状真菌患者的临床资料和实验室结果㊂每例患者多次分离相同菌株者只计入首次分离菌㊂本研究为回顾性分析,研究符合‘赫尔辛基宣言“的原则,该研究过程不会对人体发生任何接触,不会对治疗措施有改变㊂不会对患者本身产生风险,知情同意被放弃㊂研究中所有个人信息都在数据库中加密,患者数据被去除标识,无侵犯隐私㊂13方法131分组与纳入标准根据丝状真菌感染的诊断标准分为肺部感染组和定植/污染组,收集所有入选患者的临床资料进行回顾性分析,包括年龄,性别,合并疾病(如糖尿病㊁肺部疾病等),糖皮质激素,广谱抗生素使用情况,抗真菌治疗情况和预后等㊂同时分析丝状真菌感染患者中死亡组与存活组的不同㊂132菌种分离培养及鉴定将临床送检的呼吸道分泌物标本直接接种于沙保弱平板;组织标本研磨成匀浆后接种于沙保弱平板,置28ħ孵箱培养;血培养标本报警阳性后涂片镜检同时转种沙保弱平板,置28ħ和35ħ培养,观察生长菌落形态㊁颜㊃8941㊃国际呼吸杂志2020年10月第40卷第19期I n t JR e s p i r,O c t o b e r2020,V o l.40,N o.19Copyright©博看网. All Rights Reserved.色等特点,乳酸酚棉蓝染色观察菌丝㊁孢子和分生孢子形态㊁生长方式和颜色等,初步鉴定丝状真菌菌属,并经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(德国布鲁克公司)鉴定丝状真菌种属㊂133 G试验和GM试验检测试验严格按照G 试验和GM试验试剂盒说明书操作㊂G试验[丹娜(天津)生物科技股份公司]通过吸光度速率法测定真菌13-β葡聚糖含量,c u t-o f f值<375为阴性,>90为阳性㊂GM试验(美国B i o-R a d公司),采用双抗体夹心法检测血清或肺泡灌洗液中的半乳甘露聚糖含量,血清判定折点为ȡ05为阳性,肺泡灌洗液判定折点为ȡ10为阳性[8]㊂14统计学分析采用S P S S200软件进行统计分析㊂患者的年龄等为计量资料且呈正态分布,以x-ʃs表示,2组间的比较采用成组设计资料的t检验;构成比㊁检出率等为计数资料,统计分析采用配对资料χ2检验㊁F i s h e r确切概率检验或非参数检验㊂P<005为差异有统计学意义㊂2结果21患者一般临床资料共收集分离出丝状真菌患者110例,男70例,女40例;年龄(6981ʃ1393)岁,年龄范围为26~97岁,ȡ60岁占8273%㊂确诊丝状真菌感染者70例,培养阳性与感染诊断符合率为6364%,其中62例(5636%)为肺部感染组;8例为耳道感染㊁角膜感染㊁伤口感染和血流感染;定植/污染组40例(3636%)㊂肺部感染组患者年龄(7003ʃ1241)岁,与定植/污染组患者年龄[(7132ʃ1531)岁]相比,差异无统计学意义(t=169,P=010)㊂肺部感染患者中ȡ60岁者51例(8226%),感染病例主要集中于呼吸科㊁急诊科和老年科㊂定植/污染组患者ȡ60岁者35例(875%),丝状真菌主要分离自急诊科㊁老年科和呼吸科㊂肺部感染组患者肺部疾病或双肺受累㊁糖皮质激素使用及合并糖尿病者显著多于定植/污染组(P值均<005)㊂2组患者在年龄㊁性别㊁临床表现和影像学表现方面差异均无统计学意义(P值均>005),肺部感染组发热患者多于定植/污染组(χ2=10736,P= 0001)㊂见表1㊂22丝状真菌分布临床分离出丝状真菌的标本主要来源于呼吸道(9273%,102/110),其中痰液90例(8182%)㊁肺泡灌洗液12例(1091%);分离自眼角膜㊁耳道㊁伤口和血液分别为273%㊁182%㊁182%和091%㊂痰液中检出菌种多为曲霉菌属(8529%),其中烟曲霉5980%㊁黄曲霉1275%,另外分离到构巢曲霉㊁土曲霉㊁杂色曲霉和聚多曲霉等少见曲霉㊂耳道分泌物主要检出菌种为曲霉菌属,黑曲霉多见㊂角膜分泌物检出丝状真菌有链格孢菌属㊁镰刀霉和曲霉菌属㊂伤口分泌物检出毛孢子菌属和接合菌属㊂血液检出1例层生镰刀菌㊂肺部感染组和定植/污染组的菌种构成均以曲霉菌为主,差异无统计学意义(χ2=0410, P>005),见表1㊂23肺部感染组患者预后分析62例肺部丝状真菌感染者中死亡22例(3548%),存活40例(6452%)㊂死亡组与存活组患者的性别比较差异无统计学意义(χ2=001,P>005),但死亡组患者年龄显著高于存活组[(7886ʃ1014)岁比(6518ʃ1084)岁,t=483,P=001]㊂死亡组使用糖皮质激素者显著多于存活组(χ2=840,P< 005)㊂但2组患者合并肺部疾病或肺受累㊁糖尿病及使用广谱抗菌药物方面比较,差异均无统计学意义(P值均>005)㊂见表2㊂24 G试验和GM试验结果102例肺部分离出丝状真菌患者均进行了G试验和GM试验检测,其中G试验阳性56例(5490%),GM试验阳性54例(5294%)㊂肺部感染组G试验结果阳性54例(8710%),定植/污染组G试验阳性2例(500%);肺部感染组中GM试验结果阳性52例(8387%),定植/污染组GM试验阳性2例(500%)㊂肺曲霉感染患者血清中GM含量显著高于定植/污染患者(χ2=6071,P=001)㊂3讨论近年来,由于人口老龄化增多,及糖皮质激素㊁广谱抗菌药物和免疫抑制剂在临床的广泛应用,丝状真菌感染的发病率有明显的上升趋势[1-4],已成为危重症患者和免疫功能低下人群的主要死因之一㊂曲霉菌是条件致病性真菌,普遍存在于空气和自然界中,曲霉菌孢子可通过呼吸道吸入肺部定植或导致侵袭性曲霉菌感染㊂不同部位感染侵袭性丝状真菌种类不同[9-10],临床表现和预后亦不同㊂角膜分泌物和耳道分泌物临床表现特殊,分泌物涂片多数可直接发现菌丝,诊断容易,通过抗真菌治疗可较快取得疗效㊂而呼吸道标本丝状真菌分离阳性需要结合宿主因素㊁临床特点等综合分析,免疫功能正常或低危宿主多为定植,而严重免疫缺陷者则会感染致病㊂本研究中丝状真菌分离最多为曲霉菌,占总分离数的8182%(90/110)㊂其中烟曲霉占曲霉菌总数的90%,仍为主要的分离菌㊂但其它少见曲霉㊃9941㊃国际呼吸杂志2020年10月第40卷第19期I n t JR e s p i r,O c t o b e r2020,V o l.40,N o.19Copyright©博看网. All Rights Reserved.表1肺部感染组与定植/污染患者临床资料与微生物学特点分析[例(%)]项目肺部感染组(n=62)定植/污染组(n=40)χ2值P值男性40645228700003290566科室分布呼吸科26419414350004910484急诊科1727426150021470143老年科58067175020850149血液科46454100004240515肾内科4645125008140367胸科4645125008140367其他科室23237175061580013基础疾病或合并症肺部疾病或肺受累38612910250012853<0001糖尿病1845004100052060023肾功能不全81290250017170190恶性肿瘤血液病㊁肺癌㊁食管癌等121935375027240099糖皮质激素使用152419250064490011广谱抗菌药物使用40645226650000020960临床表现咳嗽㊁咳痰㊁喘息55887128700056150018发热365806102500107360001影像表现斑片高密度影51822627675029430086空洞形成580600000154a 空气征696800000079a 死亡223548250012557<0001菌种分布曲霉菌54871033825004100522烟曲霉41661320500026310105黄曲霉69687175013380247其他曲霉69686150006640415青霉菌23235125032720070赛多孢菌㊁链格孢霉3484250000010971接合菌232300000519a 镰刀菌116100001000a 注:a F i s h e r确切概率法表262例肺部感染丝状真菌患者预后分析[例(%)]组别例数男性糖皮质激素肺部疾病或肺受累糖尿病使用广谱抗菌药物死亡组2214636410454516727383636146364存活组4026650051250225500102500246000χ2值001840188089014P值099002075097025(如构巢曲霉㊁土曲霉㊁杂色曲霉和聚多曲霉等)比例有所上升,与文献报道烟曲霉是侵袭性曲霉病最常见的病原体一致[11-13]㊂本研究分离到的其它丝状真菌包括镰刀菌㊁青霉菌㊁赛多孢菌和接合菌等,可导致不同部位感染,对常用抗真菌药物不敏感或耐药,值得临床重视㊂曲霉菌属是肺部感染和定植最常见的丝状真菌,分布科室以呼吸科㊁急诊科㊁老年科等为主,此类科室多为年龄偏大㊁合并多种基础疾病㊁免疫力相对低下患者,易吸入环境中曲霉孢子定植或感染有关㊂结构完整的气道可有效防御曲霉菌定植,而肺部疾病患者气道结构破坏,可增加曲霉菌的定植和感染㊂有文献显示既往有C O P D和支气管扩张症等结构破坏的呼吸道疾病是导致肺部丝状真菌感染的重要危险因素[14-15]㊂本研究对肺部感染组和定植/污染组比较,合并肺部疾病或肺受累㊁使用糖皮质激素及糖尿病的感染患者丝状真菌分离率显著高于定植组(P值均<005),与报道一致[10];而2组性别㊁年龄㊁肾功能不全等比较,差异均无统计学意义(P值均>005)㊂死亡组与存活组相㊃0051㊃国际呼吸杂志2020年10月第40卷第19期I n t JR e s p i r,O c t o b e r2020,V o l.40,N o.19Copyright©博看网. All Rights Reserved.比,年龄和糖皮质激素使用是导致死亡的主要危险因素,与文献报道一致,提示临床老年患者由于免疫力低下㊁基础状况差,易发生感染丝状真菌且死亡风险大,应用糖皮质激素会抑制巨噬细胞和单核细胞对曲霉孢子和菌丝的免疫[5,12]㊂因此,临床对糖皮质激素的使用要严格把握指征,避免滥用导致呼吸道真菌的定植㊁感染甚至死亡风险的增加㊂本研究显示,肺部感染组和定植/污染组患者临床表现均有咳嗽㊁咳痰等不典型表现,2组影像学检查均不特异,表明早期丝状真菌感染诊断和治疗困难㊂5806%肺部感染组患者有发热症状,显著高于定植/污染组(P<005)㊂提示临床一旦出现发热,需结合影像学㊁临床其它表现等警惕是否由定植演变为侵袭性感染的可能,及时送检痰或肺泡灌洗液镜检和培养,并监测G试验和GM试验,以便及早诊断和及时抗真菌治疗㊂本研究中尽管诊断为肺部丝状真菌感染患者均使用了抗真菌药物治疗,但病死率仍高达3548%,显著高于定植/污染组(P<005),提示临床一旦拟诊应及早应用药物及其他治疗手段,减少延迟诊治带来的不良预后㊂目前大多实验室鉴定丝状真菌最广泛的方法仍为传统的形态学鉴定方法[2,13,15],但该方法依赖菌落生长时间和判读者的经验,且对相似菌种无法鉴定到种㊂近年来,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱通过检测真菌中特异性蛋白可快速㊁准确鉴定丝状真菌㊂它正逐步应用于丝状真菌的诊断和菌种分类[16],能把常见的曲霉菌㊁镰刀菌等准确鉴定到种复合体水平,但受限于数据库信息有限及丝状真菌不同生长阶段特点(菌丝大小㊁产孢情况等)和不同前处理提取蛋白方法㊂2016年美国感染病协会曲霉诊疗指南更新中,GM检测在诊断肺曲霉菌病中被强烈推荐,作为证据级别高的诊断方法[7]㊂目前已有报道GM㊁I g G/I g A等对肺部侵袭性曲霉菌感染有较好的诊断价值[18-19]㊂本研究对所有肺部分离丝状真菌的患者均进行了G试验和GM试验检测,结果显示在丝状真菌肺部感染患者中G试验和GM试验的阳性检出率显著高于定植/污染患者,尤其对于肺曲霉感染者,其血清中GM 含量显著高于定植/污染者(χ2=6071,P= 001),提示临床联合使用G试验和GM试验可提高曲霉菌的检出率,对提示感染抑或定植/污染有重要意义㊂但G试验和GM试验不能确定丝状真菌种类,且受影响因素多,临床上应动态监测减少假阳性率㊂综上所述,临床分离培养出丝状真菌后,一定要结合宿主因素,患者临床表现,影像学检查,相关的血清学检查(G试验㊁GM试验)和病原学检测㊂尤其来源于非无菌部位分离的丝状真菌,应排除污染或定植㊂对可疑感染患者应及时多次送检高质量合格标本,提高丝状真菌的阳性检出率,以尽快明确诊断提高临床治疗的精确性,防止病情进展㊂利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献1康伟芳慢性肺曲霉菌病55例临床分析J中国真菌学杂志201914128-31D O I103969j i s s n1673-382720190128K a n g W F T h e c l i n i c a l f e a t u r e s o f c h r o n i c p u l m o n a r ya s p e r g i l l o s i s i n55p a t i e n t s J Z h o n g g u oZ h e nJ u n X u eZ aZ h i201914128-31D O I103969j i s s n1673-3827201901282吕玮刘正印侵袭性真菌感染临床诊治中应注意的问题J 中华内科杂志2019588553-555D O I103760c m a ji s s n0578-1426201908001L y u W L i u Z Y N o t i c e a b l e q u e s t i o n s o n d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n to f i n v a s i v e f u n g a l i n f e c t i o n J Z h o n g h u a N e iK e Z aZ h i2019588553-555D O I103760c m a j i s s n0578-14262019080013 D u r g aC S G u p t aN S o n e j aM e t a l I n v a s i v e f u n g a l i n f e c t i o n si nc r i t i c a l l y i l l p a t i e n t s a p r o s p e c t i v es t u d y f r o m at e r t i a r yc a r e h o s p i t a l i n I nd i a J D r u g D i s c o vT he r2018126363-367D O I105582d d t2018010684 L i nC Y W a n g I T C h a n g C C e ta l C o m p a r i s o no fc l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n d i a g n o s i s a n do u t c o m e so f i n v a s i v e p u l m o n a r ya s p e r g i l l o s i s a n d p u l m o n a r y m u c o r m y c o s i s JM i c r o o r g a n i s m s 2019 711 531 D O I 10 3390m i c r o o r g a n i s m s71105315 K a y aS G e nça l i o㊅g l uE Sön m e z M e ta l T h e i m p o r t a n c eo fr i s kf a c t o r s f o r t h e p r e d i c t i o n o f p a t i e n t s w i t h i n v a s i v e p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s J R e v A s s o c M e d B r a s19922017639764-770D O I1015901806-92826309764 6中华内科杂志编辑委员会侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则草案J中华内科杂志2006458697-7007 P a t t e r s o n T F T h o m p s o n G R D e n n i n g D W e ta l P r a c t i c eg u i d e l i n e s f o r t h e d i a g n o s i s a n dm a n a g e m e n t o f a s p e r g i l l o s i s2016u p d a t e b y t h e i n f e c t i o u s d i s e a s e s s o c i e t y o fA m e r i c a JC l i nI n f e c tD i s2016634433-442D O I101093c i dc i w4448任杰黄怡肺曲霉病诊断方法新进展J中国卫生检验杂志2018286766-7689 A l k a t a n HM A l-E s s a R S C h a l l e n g e si n t h e d i a g n o s i s o fm i c r o b i a l k e r a t i t i s ad e t a i l e dr e v i e w w i t hu p d a t ea n d g e n e r a lg u i d e l i n e s J S a u d iJ O p h t h a l m o l2019333268-276D O I101016j s j o p t201909002㊃1051㊃国际呼吸杂志2020年10月第40卷第19期I n t JR e s p i r,O c t o b e r2020,V o l.40,N o.19Copyright©博看网. 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生物培养真菌实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习并掌握真菌的培养方法。
2. 观察并描述真菌的生长特征。
3. 探究不同环境条件下真菌的生长情况。
二、实验材料1. 真菌样品：香菇、金针菇、平菇等。
2. 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。
3. 实验器材：培养皿、无菌棉签、镊子、酒精灯、显微镜等。
三、实验步骤1. 准备培养基：将PDA培养基称取适量，加水溶解后，分装到培养皿中，待冷却凝固。
2. 分离真菌：取适量真菌样品，用无菌镊子将菌丝撕成小块，放入培养基中。
3. 接种：用无菌棉签将菌丝均匀涂布在培养基表面。
4. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。
5. 观察与记录：定期观察真菌的生长情况，记录菌落形态、颜色、大小等特征。
6. 观察真菌生殖结构：将生长良好的菌落用显微镜观察，观察其生殖结构。
7. 分析与讨论：分析不同环境条件下真菌的生长情况，讨论影响真菌生长的因素。
四、实验结果1. 香菇：菌落呈白色，菌丝较粗，生长速度较快，菌落边缘整齐。
2. 金针菇：菌落呈淡黄色，菌丝较细，生长速度较快，菌落边缘不整齐。
3. 平菇：菌落呈灰白色，菌丝较粗，生长速度较快，菌落边缘整齐。
4. 镜下观察：香菇、金针菇、平菇的菌丝均具有分支，菌丝表面有孢子囊，内含大量孢子。
五、分析与讨论1. 实验结果表明，香菇、金针菇、平菇在不同的培养基上均能生长，且生长速度较快。
2. 香菇、金针菇、平菇的菌落形态、颜色、大小等特征存在差异，这与它们的生物学特性有关。
3. 实验过程中，温度、湿度等环境条件对真菌的生长有较大影响。
适宜的温度和湿度有利于真菌的生长。
4. 通过观察真菌的生殖结构，可以发现真菌具有分支的菌丝和孢子囊，内含大量孢子，这是真菌繁殖的方式。
六、实验结论1. 真菌的培养方法简单易行，可通过观察其生长特征了解其生物学特性。
2. 环境条件对真菌的生长有较大影响，适宜的温度和湿度有利于真菌的生长。
3. 通过实验，我们掌握了真菌的培养方法，了解了真菌的生长特征和繁殖方式。
丝状真菌的鉴定
04 常见丝状真菌鉴定
曲霉-直接镜检
曲霉-分生孢子头
分生孢子 瓶梗 顶囊 分生孢子柄
梗基
足细胞
烟曲霉 Aspergillus fumigatus
黄曲霉 Aspergillus flavus
丝状真菌的鉴定
北京大学第一医院皮肤科
主讲人：余进
余进 主任医师
北京大学第一医院 教授、博士生导师
中国微生物学会临床微生物学委 员会青年委员会副主任委员及真 菌学组副组长
中国微生物学会医学微生物学与 免疫学专委会真菌学组副组长
01
目
02
03
录
04
05
丝状真菌形态鉴定
丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定 丝状真菌DNA测序鉴定 常见丝状真菌鉴定 总结
镰刀菌—直接镜检
镰刀菌形态特征
瓶梗
复出芽细胞
单瓶梗
复瓶梗
大分生孢子
小分生孢子
芽生孢子
厚垣孢子
足细胞
茄病镰刀菌Fusarium solani
尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum
层生镰刀菌 Fusarium proliferatum
轮状镰刀菌 Fusarium verticillioides
絮状表皮癣菌 Epidermophyton floccosum
05 丝状真菌鉴定总结
感谢聆听
少根根霉 Rhizopus arrhizus
不规则毛霉 Mucor irregularis
微小根毛霉 Rhizomucor pusillus
棘状小克银汉霉 Cunninghamella echinulata
第二章 生长
真菌的分枝
菌丝分枝行为的有关现象
• 大多菌丝的分枝是在菌丝顶端之后的某一距离发生，新 菌丝总是向前或朝向菌落边缘； • 菌丝顶端彼此分离使菌丝间充满间隙，保证了营养要求； • 培养基中，菌落密度和菌落形成分枝的数目直接与营养 水平相关； • 丝状真菌的生长有重复循环，相当于单细胞生物的细胞 循环。（细胞质体积、核分裂与分枝有明显相关性）
• 适温菌：10-40℃生长，最适25-35℃
大多数真菌：青霉、根霉、曲霉、香菇等
• 嗜温菌：可在40-60℃生长 如粪污鬼伞(Coprinus fimetarius) 与酶蛋白、核蛋白体对温度的敏感性有关
四、空气湿度、基质含水量及水活度
空气湿度：
大多数真菌在相对湿度为95-100%时生长良好
第二节
单细胞真菌的生长
一、单细胞真菌的生长特性 二、单细胞真菌的生长动态
单细胞真菌的生长特性
酵母、壶菌等真菌的营养体为单细胞 , 通过 出芽或细胞分裂而增殖.（芽殖、裂殖）
单细胞真菌的生长往往采用群体生长来衡量，往往以代时来表示某种真 菌的生长速度。
Saccharomyces cerenisiae 的代时为2 h 左右。
受环境微生物的污染，同时也不允许操作的
微生物扩散到环境中去。
如高温灭菌、过滤、紫外线照射处理等。
1．简述（150字以内）丝状真菌顶端生长的泡囊假说。 2．真菌生长的测定方法有哪些？举例阐述其理论根据。
泡囊的顶端集聚
细胞壁的生长
• 泡囊内含有细胞壁合成的前
体物质和有关的酶。
• 含有不同成份的泡囊与顶端 泡囊作用的三重性： 细胞质膜融合时，既使顶端 • 运输酶破坏原来细胞壁间的键； 细胞质膜面积增大，又把合 • 运输新的壁物质，在合成酶的作用 成新的细胞壁的物质释放到 下，并入壁中，增加壁的面积； 膜外面，使细胞壁增加。 • 增加原生质膜的表面积。
丝状细菌培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习丝状细菌的培养方法。
2. 观察丝状细菌的生长特征，分析其生长条件。
3. 探究丝状细菌在微生物燃料电池中的应用潜力。
二、实验材料1. 丝状细菌菌种：Lysinibacillus varians GY322. 培养基：LB培养基（Luria-Bertani broth）3. 培养工具：培养皿、移液枪、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌器等4. 仪器：原子力显微镜、微电极分析仪等三、实验方法1. 菌种活化将保存在-80℃冰箱中的丝状细菌菌种取出，复苏于LB培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
2. 制备培养基按照LB培养基配方，配制适量培养基，用高压蒸汽灭菌器灭菌，待培养基冷却至室温后备用。
3. 接种与培养取过夜培养的丝状细菌，用移液枪吸取适量菌液，均匀涂布于制备好的培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养。
4. 观察与记录定期观察培养皿中的丝状细菌生长情况，记录其生长特征，如菌落形态、颜色、生长速度等。
5. 微生物燃料电池应用实验将生长良好的丝状细菌接种于石墨电极上，置于微生物燃料电池中，观察其在燃料电池中的导电性能。
6. 数据分析利用原子力显微镜和微电极分析仪等仪器，对丝状细菌的导电性能进行检测，分析其电导率与皮脂样蛋白质附属物之间的关系。
四、实验结果与分析1. 丝状细菌的生长特征经过一段时间培养，丝状细菌在培养基上形成了典型的菌落，菌落形态呈长丝状，颜色为白色，生长速度快。
2. 丝状细菌在微生物燃料电池中的应用在微生物燃料电池中，丝状细菌能够形成厘米范围的导电细胞网络，当其生长在石墨电极上时，细胞长度可达1.08毫米。
实验结果表明，丝状细菌在微生物燃料电池中具有良好的导电性能。
3. 电导率与皮脂样蛋白质附属物之间的关系原子力显微镜和微电极分析结果表明，电导率与皮脂样蛋白质附属物有关。
这表明，皮脂样蛋白质附属物在丝状细菌的电导性能中起着重要作用。
五、实验结论1. 丝状细菌在LB培养基中能够正常生长，具有典型的丝状菌落特征。
实验二：丝状真菌生长的测定(精)
所用显微镜的目镜测微尺，并计算每一格的长度。在菌落边缘选 择单根菌丝的顶端在低倍镜下聚焦，然后将目镜测微尺与菌丝平 行，并选择菌丝开始出现侧枝的部位与目镜测微尺上的一条线重 合，这个点即为“参照点”。每隔一定的时间测量一次菌丝生长 的长度，观察数次后，根据时间和延长生长的长度划一条生长曲 线，并求出生长速度（毫米/小时）。
实验二 丝状真菌生长的测定
一、概念
丝 状 真 菌 （ filamentous fungi ） ， 俗 称 霉 菌 （ mould, mold ），通常指那些菌丝体较发达又不产生大型肉质子实体 结构的真菌。
一、测定方法 1）菌丝生长的测定：
① 马铃薯（PDA）培养基倒平板，冷却（无菌操作）。
配方：葡萄糖 20克 ，琼脂 20克，削皮马铃薯 200克煮汁 定容至1000ml，pH自然，115℃灭菌30分钟； ② 待测菌株点接于培养基平板中心，倒置28℃度培养； ③ 待菌落长出后，将平板翻置于显微镜镜台上，同时校对
2）直接生长速度的测定： ① PDA培养基倾注入“U形”培养管中，注入 培养基的量，达到培养管直径的一半，另一端用塞 子塞好；
② 凝固后从一端接种，置28℃培养箱中培养；
③ 每日测定生长距离，并计算生长率。
三、结果记录： 1）每个方。
2）比较两种方法的优缺点。
谢谢大家！
3微生物的生长1
在单细胞微生物中，细胞内的原生质和各种细胞结构 协调增加，细胞体积增大，这便是生长。 当细胞增大到一定程度时，细胞开始分裂，最后形成 两个基本相同的子细胞，这便是繁殖。生长的过程也 可以说是它的繁殖过程。
在多细胞的微生物中（如丝状真菌），如果细胞数目 增加的同时并不伴有个体数目的增加，那么此过程只 能称为生长，只有形成有性和无性孢子的过程才能称 为繁殖。
G
=
3.3
t log
b/B
G = 240 minutes 3.3 log 107/104
G = 240 minutes 3.3 x 3
G = 24 minutes
影响细菌生长速率的因素
I.遗传因素 II.营养条件 III.物理生长条件
菌株名称 Escherichia coli Bacillus megaterium Streptococcus lactis Streptococcus lactis Staphylococcus aureus Lactobacillus acidophilus Rhizobium japonicum Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum
Nt dN
t
udt
N N0
t0
lnNt –lnN0= u(t-t0)
Nt=N0eu(t-t0)
l g Nt l gN02.3 u0(t3 t0)
根据世代时间(代时）g的定义，当Nt=2N0时，g = t—t0，
u ln2 0.693 gg
微生物的生长是一个及其复杂的生命过程，为什么 近似地遵循普通的一级化学反应呢？
细胞周期中各个时期的长短会随环境条件改 变，但主要的变化在G1期。
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实验二 丝状真菌生长的测定
一、概念
丝 状 真 菌 （ filamentous fungi ） ， 俗 称 霉 菌 （ mould, mold ），通常指那些菌丝体较发达又不产生大型肉质子实体 结构的真菌。
一、测定方法 1）菌丝生长的测定：
① 马铃薯（PDA）培养基倒平板，冷却（无菌操作）。
配方：葡萄糖 20克 ，琼脂 20克，削皮马铃薯 200克煮汁 定容至1000ml，pH自然，115℃灭菌30分钟； ② 待测菌株点接于培养基平板中心，倒置28℃度培养； ③ 待菌落长出后，将平板算每一格的长度。在菌落边缘选 择单根菌丝的顶端在低倍镜下聚焦，然后将目镜测微尺与菌丝平 行，并选择菌丝开始出现侧枝的部位与目镜测微尺上的一条线重 合，这个点即为“参照点”。每隔一定的时间测量一次菌丝生长 的长度，观察数次后，根据时间和延长生长的长度划一条生长曲 线，并求出生长速度（毫米/小时）。
2）直接生长速度的测定： ① PDA培养基倾注入“U形”培养管中，注入 培养基的量，达到培养管直径的一半，另一端用塞 子塞好；
② 凝固后从一端接种，置28℃培养箱中培养；
③ 每日测定生长距离，并计算生长率。
三、结果记录： 1）每个方法作一张表格，记录每次不同时间丝
状真菌生长情况。
2）比较两种方法的优缺点。