凝胶电泳技术ppt课件

TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一 问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液或高压灭菌。
DNA电泳带模糊的原因：
1) DNA降解，应 避免核酸酶污染；
2) 电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强 度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电 泳效果。建议经常更换电泳缓冲液；
3) 所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm， 温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃； 核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 ；
凝胶浓度 浓度越小，孔径越大，浓度越大，孔径 越小 。
不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围
浓度%（W/V）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线状DNA分子的有效 分离范围（kb）
5－60 1－20 0.8－10 0.5－7 0.4－6 1.2－3 0.1－2
DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
凝胶电泳技术
电泳（electroghoresis）：带电物质在电场中向相反 电极移动的现象 。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样 品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等 性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从 而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和 对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支 持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程， 减少了扩散和对流等干扰作用。
溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或 RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所 以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链 DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形 成较短的链内螺旋产生的。最低检出量100ng
染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量 DNA（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进 行脱色。
4、碱基组成： 对迁移率影响不明显，单链DNA形成 发头结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链DNA （1kb）
(二)支持物介质（种类和浓度）
核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同 浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同， 适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺 （TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长 链，并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉 连接而成，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。
② 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。
银染：
银染色液中的银离子(Ag )可与核酸形成稳定的 复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag 还原成银颗粒， 可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺 凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度 比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。
EB的替代物：
①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；
②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等 量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时；
③加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。
（2）EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理：
① 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温 放置1小时；
但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和 溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
3、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基 上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离， 所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3 时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分 子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的 电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
载样缓冲液的作用：
①增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉 入加样孔内；
②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳 的速度和位置；
③使样品呈色，使加样操作更方便。
配方：
将0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF或分别，或同时 加入或30%甘油水溶液，或40%（W/V）蔗糖水溶 液，或15%聚蔗糖(Ficoll400)中。
1-5V/cm（低压），低压时，线性DNA迁移率与电压成 正比，而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。
电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小。
高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降：因为 随电压上升，不同长度DNA泳动的增加程度不同， 凝胶有效分离范围随电压上升而下降 。
核酸吸收260nm紫外线 ，导致DNA的断裂，因此回收 DNA应在长波紫外线下观察较好，以减少对DNA的损 伤。
荧光易淬灭，注意观察的时期，不要反复在紫外下照 射。
由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含 EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和 危害人体健康。 (1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：
聚丙烯酰胺 浓度 有效分离范围（bp） 二甲苯青FF
3.5
1000－2000
460
5.0
80－500
260
8.0
60－400
160
12.0
40－200
70
15.0
25－150
60
20.0
6－100
45
溴酚蓝
100 65 45 20 15 12
（三）电场强度
电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯 度。
GoldView DNA染料是一种可代替溴化乙锭（EB）的 新型DNA染料，使用方法与之完全相同。采用琼脂糖 凝胶电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生 很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，在某些波段甚 至超过EB。在100ml琼脂糖胶溶液中加入5μl GoldView 即可，亦可在电泳缓冲液中以同样比例稀释后直接使 用。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链多聚 核酸链呈红色荧光。因此，GoldView不仅能染双链 DNA，也可用于染RNA和单链DNA。GoldView DNA 染料在不同的波长下灵敏度有一定影响，建议使用 312nm波长。
3Biblioteka Baidu种类 ：
TAE（Tris、醋酸、EDTA）：缓冲能力差，电流大易发 热，长时间使用阴极为碱性 ，阳极为酸性 ，需要循环使 两极的pH一致；但价格便宜。
TBE（Tris、硼酸、EDTA）：缓冲能力强。首选TBE。
TPE（Tris 磷酸，EDTA）：缓冲能力强，但回收DNA 易与DNA一起沉淀，影响酶反应。
DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被 结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两 种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm 处重新发射出来。
由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合 DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的 溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的 NDA条带。
球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所 带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身 状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳 迁移率。
电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm） 时带电分子的迁移速度
迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子 的大小和缓冲液的粘度成反比。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
TNE（Tris 醋酸钠，EDTA）：电流大，适合于长时间低 压电泳，分辨率高。
在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制 DNase，保护DNA。
TBE一般配10 ×或5 ×的贮存液，都以1×TBE作为 使用液进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备 足够的缓冲容量；进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲 液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使 用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
（二）染色剂
核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是 溴化乙锭染色法，其次是银染色，目前还有其他不仅安 全的染色剂。
溴化乙锭（ethidium bromide,EB）最常用260nm， 300nm，360nm，发出590nm橙红色。
溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一 个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列 特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱 基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面 基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互 作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导 致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶 液中染料有所增加。
在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰 的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链 线性DNA片段大致相同。 在 1%和1.4%琼脂糖中电泳 时，二甲苯青的迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线 性DNA大致相似。
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 （loading buffer）。
EB存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低 15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如 DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况 下电泳，电泳结束后用EB染色。
EB在凝胶或染色液中的浓度为0.5 g/ml或0.1 g/ml。
注意：
EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。
溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭 是强诱变剂，具有高致癌性！
4) DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量；
5) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐；
6) 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白；
7) DNA变性 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释 DNA。
二、核酸电泳的指示剂与染色剂
核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc） 呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的 迁移率比溴酚蓝慢。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术 的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物 大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝 胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
电泳的基本原理：
在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点 所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE 质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球 形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点 半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场 中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην
DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛 效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的 泳动率就不同，从而分出不同的区带。
为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应， 增加分子筛效应。
2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同， 其迁移率也不同。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比 如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状 DNA（covalently close circular DNA，ccc DNA， 超螺旋构型） ＞lDNA（linear form，线型，质粒 的两条链均断裂；线性分子）＞ocDNA（开环DNA， open circularDNA，ocDNA，它的双链中的一条保 持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切 口）。
高压电泳（20-600V/cm（电场强度）,10002000V（电压））,必须用PAG作介质。
（四）电泳缓冲液（种类、pH、离子强度）
1、pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏 碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 2、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电 颗粒泳动慢 ；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗 粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使DNA变 性。
弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般510min条带就会消失。
GeneFinder具有安全、灵敏等突出优点，可以代 替溴化乙锭(EB)作为各种核酸电泳的染色剂。
与强致癌性的EB不同，GeneFinder?属于花青类染 料，毒性很低，使用安全,可有效保护实验操作者和环 境。